Inhibición de la subunidad beta3 de los canales de Ca2+ de tipo L.

Un método in vitro para identificar inhibidores de la proteína ß3 del canal de Ca2+ de tipo L

, que comprende:

a) poner en contacto las células huésped recombinantes de mamífero con un indicador de calcio que emite señales detectables en la presencia de calcio, en donde dichas células huésped se han transfectado con un vector de expresión recombinante que comprende secuencias de ácido nucleico de control operativamente unidas a un gen ß3 del canal de Ca2+ de tipo L y en donde dichas células huésped no poseen canales de Ca2+ de tipo L que contienen la subunidad ß3 funcional;

b) tratar dichas células huésped recombinantes de mamífero con uno o más compuestos de prueba, en donde el tratamiento ocurre antes, simultáneo con o después de poner en contacto las células huésped con el indicador de calcio;

c) estimular las células huésped recombinantes de mamífero con una cantidad de ATP que es efectiva para incrementar la concentración de calcio intracelular en las células de control; y

d) detectar señales del indicador de calcio en las células huésped recombinantes de mamífero, en donde un incremento inducido por el compuesto de prueba en las señales del indicador de calcio en las células huésped recombinantes de mamífero indica que el compuesto de prueba es un inhibidor de la proteína ß3 del canal de Ca2+ de tipo L.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2003/002929.

Solicitante: BIOCRINE AB.

Nacionalidad solicitante: Suecia.

Dirección: JOHN ERIKSSONSGATAN 9 112 22 STOCKHOLM SUECIA.

Inventor/es: BERGGREN,Per Olof, FLOCKERZI,VEIT.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/12 (Genes que codifican proteínas animales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/10 (Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/705 (Receptores; Antígenos celulares de superficie; Determinantes celulares de superficie)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/09 (Tecnología del ADN recombinante)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K45/00 (Preparaciones medicinales que contienen ingredientes activos no previstos en los grupos A61K 31/00 - A61K 41/00)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/68 (en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS... > A61P43/00 (Medicamentos para usos específicos, no previstos en los grupos A61P 1/00 - A61P 41/00)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/50 (Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre, de orina; Investigación o análisis por métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Investigación o análisis inmunológico (procedimientos de medida, de investigación o análisis diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto; procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/02 (en los que intervienen microorganismos vivos)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS... > Medicamentos para el tratamiento de trastornos del... > A61P3/10 (para la hiperglucemia, p.ej. antidiabéticos)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K38/00 (Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00))

PDF original: ES-2524574_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Inhibición de la subunidad β3 de los canales de Ca2+ de tipo L

Campo de la invención Esta invención se refiere a la biología molecular, biología celular, canales de calcio dependientes de voltaje, señalización del calcio, descubrimiento de fármacos, diabetes, resistencia a la insulina, alteración de la secreción de insulina y alteración de la homeostasis de la glucosa.

Antecedentes de la invención La diabetes mellitus (DM) comprende una serie de enfermedades, todas caracterizadas por hiperglicemia. La DM tipo l (“dependiente de la insulina") se caracteriza por la deficiencia de insulina, mientras que la DM tipo ll (“no dependiente de la insulina" o "de principio en adultos") se caracteriza por la resistencia a la insulina, la alteración de la secreción de insulina y el incremento de la producción de glucosa hepática. Las complicaciones crónicas de la DM resultan de la hiperglicemia e incluyen retinopatía, neuropatía, nefropatía y enfermedad cardiovascular.

En la célula β pancreática, la despolarización de la membrana y un incremento oscilatorio en la [Ca2+]i son características clave en la secreción de insulina inducida por glucosa. El incremento oscilatorio en la [Ca2+]i se regula por una interacción sofisticada entre nutrientes, hormonas y neurotransmisores y se debe al influjo de Ca2+ a través de los canales de Ca2+ de tipo L dependientes de voltaje y la movilización de Ca2+ de los depósitos intracelulares tales como el retículo endoplásmico (ER) (Berggren & Larsson 1994, Biochem. Soc. Transact. 22:12-18) . En el metabolismo de la glucosa dentro de la célula β, se forma el ATP, el que a su vez cierra los canales específicos de K+ regulados por ATP, provocando la despolarización de la membrana plasmática. Dicha despolarización conduce a una apertura de los canales de Ca2+ de tipo L dependientes de voltaje, el influjo de Ca2+, un incremento en la [Ca2+]i; y subsecuentemente la liberación de la insulina. La apertura de los canales de Ca2+ de tipo L dependientes de voltaje ocurre por lo tanto a niveles de concentración de glucosa que estimulan a las células beta pancreáticas para secretar insulina.

Los canales de Ca2+ de tipo L son proteínas de múltiples subunidades, que consisten de una combinación de subunidades α, β y γ, en donde cada tipo de subunidad existe en múltiples formas. Mientras que la subunidad α1 forma el poro del canal de Ca2+ de tipo L, se cree que las subunidades β juegan un rol clave en la expresión/montaje del complejo del canal y modulan las corrientes de Ca2+ a través de las subunidades β1 (Singer y otros, 1991, Science 253:1553-1557; Hullin y otros 1992, EMBO J. 11:885-890; Tareilus y otros 1997, Proc. NatI. Acad. Sci. USA 94:1703-1708) . Hasta la fecha el rol de las subunidades β del canal de Ca2+ en la secreción de insulina se ha estudiado principalmente por experimentos de expresión heteróloga (lhara y otros, 1995, Mol. Endocrinol. 9:121-130) . Las células β pancreáticas expresan ambas subunidades β2y β3.

Los depósitos intracelulares tales como el ER son capaces de modular la señalización de la despolarización inducida por

Ca2+ mediante el secuestro de parte del Ca2+ que ingresa a través de los canales de Ca2+ de tipo L dependientes de voltaje a los depósitos de calcio intracelulares, o mediante la liberación de Ca2+ adicional al citoplasma. Dicha liberación de Ca2+ puede ocurrir a través de la activación mediada por Ca2+ de la fosfolipasa C específica de fosfatidilinositol (PI-PLC) y la formación de inositol 1, 4, 5-trifosfato (Ins (1, 4, 5) P3) o a través de la apertura directa de los canales de Ca2+ intracelulares mediante el ingreso de Ca2+ .

La mayoría de los esfuerzos en el desarrollo de fármacos para promover la secreción de insulina, tratar la resistencia a la insulina e incrementar la eficiencia de la homeostasis de la glucosa se han orientado a los canales de K+ regulados por ATP. Sin embargo, dichos fármacos actúan comúnmente sin tener en cuenta la concentración de glucosa en la sangre y por lo tanto pueden conducir a serios efectos colaterales, tales como la hipoglicemia. Por lo tanto, es una necesidad en la técnica 50 identificar los blancos para los terapéuticos que no sufren de estas desventajas.

Resumen de la invención El alcance de la presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

Además se describen animales transgénicos no humanos que tienen una interrupción en el gen β3 del canal de Ca2+ de tipo L que inhibe la expresión de la proteína β3 activa del canal de Ca2+ de tipo L y los métodos para producir dichos animales transgénicos. Además se describen secuencias y vectores de ácidos nucleicos aislados para crear dichos animales transgénicos.

Además, se describen células huésped recombinantes transfectadas con un vector de expresión recombinante que comprende secuencias de ácidos nucleicos de control operativamente unidas a un gen β3 del canal de Ca2+ de tipo L, en donde la célula huésped no posee canales de Ca2+ de tipo L funcionales.

La presente invención proporciona métodos para identificar los inhibidores de la proteína β3 del canal de Ca2+ de tipo L, que comprenden las células huésped recombinantes descritas en este documento, poner en contacto las células huésped recombinantes con un indicador de calcio que emite señales detectables en la presencia de calcio, tratar las células recombinantes con uno o más de los compuestos de prueba, en donde el tratamiento ocurre antes, simultáneo con o después de poner en contacto las células huésped recombinantes con el indicador de calcio, estimular las células huésped recombinantes con una cantidad de ATP que es efectiva para incrementar la concentración de calcio intracelular en las células de control y detectar las señales del indicador de calcio en las células huésped recombinantes, en donde un incremento en las señales del indicador de calcio inducido por el compuesto de prueba en las células huésped recombinantes indica que el compuesto de prueba es un inhibidor de la proteína β3 del canal de Ca2+ de tipo L.

Además se describen métodos para tratar un sujeto con una o más enfermedades seleccionadas del grupo que consiste de diabetes, resistencia a la insulina, alteración de la secreción de insulina y alteración de la homeostasis de la glucosa, que comprenden administrar al sujeto uno o más inhibidores de una subunidad β3 del canal de Ca2+ de tipo L para proporcionar un beneficio al sujeto.

Breve descripción de las figuras La Figura 1 representa la organización del gen β3 (A) y del vector de orientación (IIMB) usado para generar un noqueo ("knockout") del gen β3. Los exones se representan por los recuadros llenos y los intrones por las líneas. La estructura del producto de recombinación homóloga se muestra en (C) . Abreviaturas: E, EcoRl; H, Hincll; P, sonda; tk, gen timidina cinasa del virus del herpes simple.

La Figura 2 representa los resultados de la prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (A) y la prueba de tolerancia a

-/- (•) .

la glucosa oral (B) en ratones de tipo silvestre (o) y ratones β3

Descripción detallada de la invención La presente invención satisface una necesidad en la técnica al identificar la subunidad β3 del canal de Ca2+ de tipo L dependiente de voltaje como un blanco de los fármacos para tratar la diabetes, la resistencia a la insulina, la alteración de la secreción de insulina y la alteración de la homeostasis de la glucosa. Se ha descubierto que la inhibición de la subunidad β3 del canal de Ca2+ de tipo L dependiente de voltaje (referida de aquí en adelante como la "proteína... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método in vitro para identificar inhibidores de la proteína β3 del canal de Ca2+ de tipo L, que comprende:

a) poner en contacto las células huésped recombinantes de mamífero con un indicador de calcio que emite señales detectables en la presencia de calcio, en donde dichas células huésped se han transfectado con un vector de expresión recombinante que comprende secuencias de ácido nucleico de control operativamente unidas a un gen β3 del canal de Ca2+ de tipo L y en donde dichas células huésped no poseen canales de Ca2+ de tipo L que contienen la subunidad β3 funcional;

b) tratar dichas células huésped recombinantes de mamífero con uno o más compuestos de prueba, en donde el tratamiento ocurre antes, simultáneo con o después de poner en contacto las células huésped con el indicador de calcio; c) estimular las células huésped recombinantes de mamífero con una cantidad de ATP que es efectiva para incrementar la concentración de calcio intracelular en las células de control; y

d) detectar señales del indicador de calcio en las células huésped recombinantes de mamífero, en donde un incremento inducido por el compuesto de prueba en las señales del indicador de calcio en las células huésped recombinantes de mamífero indica que el compuesto de prueba es un inhibidor de la proteína β3 del canal de Ca2+ de tipo L.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la cantidad de ATP que es efectiva para incrementar la concentración de calcio intracelular en las células de control está entre 0.2 μM y 500 μM.

3. El método de la reivindicación 2, en donde la cantidad de ATP que es efectiva para incrementar la concentración de calcio intracelular en las células de control está entre 1 μM y 100 μM.

4. El método de la reivindicación 1, en donde la proteína β3 del canal de Ca2+ de tipo L está codificada por un ácido nucleico con una secuencia de acuerdo con la SEC ID NO:6.

5. El método de la reivindicación 1, en donde las señales detectadas se comparan con las señales obtenidas a partir 30 de las células de control.

6. El método de la reivindicación 1, en donde las células huésped recombinantes de mamífero se seleccionan del grupo que consiste de células de humano y de roedor.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde las células huésped recombinantes de mamífero no se derivan de células musculares, neuronas, o células neuroendocrinas.