Inhibición por ARNi de la expresión de alfa-ENaC.

Una composición que comprende un agente ARNi que comprende una cadena codificante y una cadena no codificante,

en donde: a. la cadena codificante comprende al menos 19 nucleótidos contiguos a partir de la cadena codificante de ND8357 (SEQ ID NO: 145), y la cadena no codificante comprende al menos 19 nucleótidos contiguos a partir de la cadena no codificante de ND8357 (SEQ ID NO: 146); o

b. la cadena codificante comprende al menos 19 nucleótidos contiguos a partir de la cadena codificante de ND8573 (SEQ ID NO: 449), y la cadena no codificante comprende al menos 19 nucleótidos contiguos a partir de la cadena no codificante de ND8573 (SEQ ID NO: 450); o

c. la cadena codificante comprende al menos 19 nucleótidos contiguos a partir de la cadena codificante de ND8313 10 (SEQ ID NO: 57), y la cadena no codificante comprende al menos 19 nucleótidos contiguos a partir de la cadena no codificante de ND8313 (SEQ ID NO: 58).

Inhibición por ARNi de la expresión de alfa-ENaC

Campo técnico

La invención se relaciona con el campo de transporte de iones de las vías respiratorias mediadas por ENaC y las composiciones y métodos para modular la expresión de alfa-ENaC, y más particularmente con la inhibición de la expresión de alfa-ENaC mediante oligonucleótidos vía interferencia de ARN que se administran localmente a los pulmones y senos nasales a través de una administración intranasal/inhalación, o se administran sistémicamente, por ejemplo por medio de inyección intravenosa.

Antecedentes La interferencia de ARN o "ARNi" es un término inicialmente acuñado por Fire and co-workers para describir la observación que ARN de doble cadena (ARNdc) puede bloquear la expresión del gen cuando se introduce en gusanos (Fire et al., Nature 391:806-811, 1998) . El ARNdc corto dirige el silenciamiento post-transcripcional, específico del gen en muchos organismos, incluyendo vertebrados, y ha proporcionado una nueva herramienta para estudiar la función del gen. Recientemente, numerosas veces se ha revisado esta tecnología, ver, por ejemplo Novina, C.D:, and Sharp, P., Nature 2004, 430:161, y Sandy, P., et al., Biotechniques 2005, 39:215 .

Las superficies mucosas en la interfase entre el medio ambiente y el cuerpo han desarrollado un número de mecanismos protectores. Una forma principal de dicha defensa innata es limpiar estas superficies con líquido. Por lo general, la cantidad de la capa líquida sobre una superficie mucosa refleja el balance entre la secreción del líquido epitelial, que a menudo refleja la secreción del anión (Cl- y/o HCO3-) acoplado con agua (y un contraión catión) , y absorción líquida epitelial, que a menudo refleja la absorción de Na+, acoplado con agua y contra anión (Cl- y/o HCO3-) . Muchas enfermedades de superficies mucosas se causan por muy poco líquido protector sobre aquellas superficies mucosas creadas por un desequilibrio entre la secreción (muy poco) y absorción (relativamente mucho) . Los procesos defectuosos de transporte de la sal que caracterizan estas disfunciones mucosas residen en la capa epitelial de la superficie mucosa. Un enfoque para reponer la capa líquida protectora en las superficies mucosas es "re-balancear" el sistema mediante el bloqueo del canal de Na+ mediando en la absorción del líquido. La proteína epitelial que media la etapa limitante de la velocidad de absorción del líquido y Na+ es el canal de Na+ epitelial (ENaC) . El alfa-ENaC se posiciona en la superficie apical del epitelio, i.e. la interfase ambiente-superficie mucosa. La inhibición del alfa-ENaC mediada por el Na+ atenúa la absorción del líquido puede alcanzar utilidad terapéutica. Por lo tanto, existe una necesidad del desarrollo de terapias efectivas para el tratamiento y prevención de enfermedades o trastornos en los cuales se involucra el alfa-ENaC, por ejemplo fibrosis quística en humanos y animales, y particularmente para terapias con alta eficiencia. Un requisito previo de alta eficiencia es que el ingrediente activo no se degrade muy rápido en un ambiente fisiológico.

Li Tianbo et al. describen cómo la interferencia de ARN de alfa-ENaC inhibe la absorción de fluido pulmonar de rata in vivo, Am Journal of Physiol Lung Cell Mol Physiol 290: L649-L660, 2006.

Resumen En un primer aspecto la presente invención provee una composición que comprende un agente ARNi que comprende una cadena codificante y una cadena no codificante, en donde:

a. la cadena codificante comprende al menos 19 nucleótidos contiguos a partir de la cadena codificante de ND8357 (SEQ ID NO: 145) , y la cadena no codificante comprende al menos 19 nucleótidos contiguos a partir de la cadena no codificante de ND8357 (SEQ ID NO: 146) ; o

b. la cadena codificante comprende al menos 19 nucleótidos contiguos a partir de la cadena codificante de ND8573 (SEQ ID NO: 449) , y la cadena no codificante comprende al menos 19 nucleótidos contiguos a partir de la cadena no codificante de ND8573 (SEQ ID NO: 450) ; o

c. la cadena codificante comprende al menos 19 nucleótidos contiguos a partir de la cadena codificante de ND8313 (SEQ ID NO: 57) , y la cadena no codificante comprende al menos 19 nucleótidos contiguos a partir de la cadena no codificante de ND8313 (SEQ ID NO: 58) .

En un segundo aspecto, la presente invención provee una composición que comprende un agente ARNi para alfa-ENaC, en donde el agente ARNi comprende una cadena codificante y una cadena no codificante,

en donde la cadena codificante comprende al menos 19 nucleótidos contiguos a partir de la cadena codificante de un agente ARNi seleccionado del grupo que consiste de ND8357 (SEQ ID NO: 145) , ND8573 (SEQ ID NO: 449) y ND8313 (SEQ ID NO: 57) y en donde la cadena no codificante comprende al menos 19 nucleótidos contiguos a partir de la cadena no codificante de un agente ARNi seleccionado del grupo que consiste de ND8357 (SEQ ID NO: 146) , ND8573 (SEQ ID NO: 450) y ND8313 (SEQ ID NO: 58) , la composición que además comprende un ligando de receptor epitelial.

En un tercer aspecto, la presente invención provee una composición que comprende un agente ARNi, como se describe anteriormente en este documento, para uso en terapia.

Las composiciones de la invención, por ejemplo, las composiciones del agente ARNi se pueden utilizar con cualquier dosificación y/o formulación descrita en este documento, así como con cualquier ruta de administración descrita en este documento.

Los detalles de una o más modalidades de la invención se exponen en los dibujos acompañantes y la descripción a continuación. Otras características, objetos, y ventajas de la invención serán evidentes a partir de esta descripción, los dibujos, y de las reivindicaciones.

En las figuras:

Figura 1: Mapa de la restricción digerida de la construcción pXoon para a-EnaC de cinomólogo clonado.

Figura 2: Secuencia de ADN y proteína de alfa-EnaC de mono cinomólogo.

Figura 3: Clonación de los sitios de reconocimiento inespecíficos y específicos pronosticados en la construcción indicadora de luciferasa doble AY535007. Los fragmentos consisten de 19nt del sitio diana pronosticado y 10 nt de secuencia flanqueante en ambos extremos 5’ y 3’.

Descripción detallada Para facilitar la exposición el término "nucleótido" o "ribonucleótido" algunas veces se utiliza en este documento en referencia a una o más subunidades monoméricas de un agente ARN. Será entendido que el uso del término "ribonucleótido" o "nucleótido" en este documento, en el caso de un ARN modificado o sustituto de nucleótido, también puede referirse a un nucleótido modificado, o fracción de reemplazo sustituto, como se describe además a continuación, en una o más posiciones.

Un "agente ARN" como se utiliza en este documento, es un ARN no modificado, ARN modificado, o sustituto de nucleósido, cada uno de los cuales se describe en este documento o es bien conocido en la técnica de ARN sintético. Mientras numerosos ARNs modificados y sustitutos de nucleósidos se describen, ejemplos preferidos incluyen aquellos que tienen mayor resistencia a la degradación por la nucleasa que los ARNs no modificados. Ejemplos preferidos incluyen aquellos que tienen una modificación de azúcar en 2’, una modificación en un saliente de cadena sencilla, preferiblemente un saliente de cadena sencilla 3’, o, particularmente si la cadena sencilla, una modificación en 5’ que incluye una o más grupos fosfato o uno o más análogos de un grupo fosfato.

Un "agente ARNi" (abreviatura para "agente ARN interferente") como se utiliza en este documento, es un agente ARN, que puede inhibir la expresión de un gen diana, por ejemplo el gen ENaC SCNN1A. Si bien no se desea estar ligado por la teoría, un agente ARNi puede actuar mediante uno o más de un número de mecanismos, incluyendo corte post-transcripcional de un ARNm diana algunas veces denominado en la técnica como ARNi, o mecanismos pre-transcripcional o de pre-traducción.

Un "agente ARNi dc" (abreviatura para "agente ARNi de doble cadena") , como se utiliza en este documento, es un agente ARNi que incluye más de una, y preferiblemente dos, cadenas en las cuales la hibridación intercadena puede formar una región de estructura doble. Una "cadena" en este documento se refiere a una secuencia de nucleótidos contiguos (incluyendo nucleótidos de origen no-natural o modificados) . Las dos o más cadenas pueden ser, o cada una formar una parte de, moléculas separadas, o pueden estar interconectadas covalentemente, por ejemplo, por un ligador, por ejemplo, un ligador polietilenglicol, para formar una molécula. Al menos una cadena puede incluir una región que es... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende un agente ARNi que comprende una cadena codificante y una cadena no codificante, en donde:

a. la cadena codificante comprende al menos 19 nucleótidos contiguos a partir de la cadena codificante de ND8357 (SEQ ID NO: 145) , y la cadena no codificante comprende al menos 19 nucleótidos contiguos a partir de la cadena no codificante de ND8357 (SEQ ID NO: 146) ; o

b. la cadena codificante comprende al menos 19 nucleótidos contiguos a partir de la cadena codificante de ND8573 (SEQ ID NO: 449) , y la cadena no codificante comprende al menos 19 nucleótidos contiguos a partir de la cadena no codificante de ND8573 (SEQ ID NO: 450) ; o

c. la cadena codificante comprende al menos 19 nucleótidos contiguos a partir de la cadena codificante de ND8313 (SEQ ID NO: 57) , y la cadena no codificante comprende al menos 19 nucleótidos contiguos a partir de la cadena no codificante de ND8313 (SEQ ID NO: 58) .

2. La composición de la reivindicación 1, en donde la cadena no codificante tiene 30 o menos nucleótidos de longitud, y en donde la cadena codificante y la cadena no codificante forman una región dúplex de 15 a 30 pares de nucleótidos de longitud.

3. La composición de la reivindicación 1, en donde la cadena no codificante y la cadena codificante tienen cada una 19 a 23 nucleótidos de longitud.

4. La composición de la reivindicación 1, en donde el agente ARNi comprende una modificación que causa que el agente ARNi tenga un aumento de estabilidad en una muestra biológica.

5. La composición de la reivindicación 1, en donde el agente ARNi comprende un fosforotioato o un nucleótido modificado en 2’.

6. La composición de la reivindicación 1, en donde el agente ARNi comprende:

al menos un dinucleótido 5’-uridina-adenina-3’ (5’-ua-3’) , en donde la uridina es un nucleótido modificado en 2’;al menos un dinucleótido 5’-uridina-guanina-3’ (5’-ug-3’) , en donde la 5’-uridina es un nucleótido modificado en 2’;al menos un dinucleótido 5’-citidina-adenina-3’ (5’-ca-3’) , en donde la 5’-citidina es un nucleótido modificado en 2’;o al menos un dinucleótido 5’-uridina-uridina-3’ (5’-uu-3’) , en donde la 5’-uridina es un nucleótido modificado en 2’.

7. La composición de la reivindicación 1, en donde el agente ARNi comprende una modificación en 2’ seleccionada del grupo que consiste de: 2’-desoxi, 2’-desoxi-2’-fluoro, 2’-O-metilo, 2’-O-metoxietilo (2’-O-MOE) , 2’-O-amino-propilo (2’-O-AP) , 2’-O dimetilaminoetilo (2’-O-DMAOE) , 2’-O-dimetilaminopropilo (2’-O-DMAP) , 2’-O-dimetilaminoetiloxietilo (2’- O-DMAEOE) , y 2’-O-N-metilacetamido (2’-O-NMA) .

8. La composición de la reivindicación 1, en donde el agente ARNi comprende un extremo romo.

9. La composición de la reivindicación 1, en donde el agente ARNi comprende un nucleótido protuberante que tiene de 1 a 4 nucleótidos no apareados.

10. La composición de la reivindicación 1, en donde el agente ARNi comprende un nucleótido protuberante en el extremo 3’ de la cadena no codificante del agente ARNi.

11. La composición de la reivindicación 1, en donde el agente ARNi es ND8357 (SEQ ID NOs: 145 y 146) .

12. La composición de la reivindicación 1, en donde el agente ARNi es ND8573 (SEQ ID NOs: 449 y 450) .

13. La composición de la reivindicación 1, en donde el agente ARNi es ND8313 (SEQ ID NOs: 57 y 58) .

14. La composición de la reivindicación 1, en donde el agente ARNi se liga a uno o más compuestos de diagnóstico, grupo indicador, agente de entrecruzamiento, fracciones que confieren resistencia a la nucleasa, nucleobase natural

o inusual, molécula lipofílica, colesterol, lípido, lectina, esteroide, uvaol, hecigenina, diosgenina, terpeno, triterpeno, sarsasapogenina, Friedelina, ácido litocólico derivado del epifriedelanol, vitamina, carbohidrato, dextrano, pululano, quitina, quitosano, carbohidrato sintético, Oligo Lactato 15-mer, polímero natural, polímero de peso molecular medio

o bajo, inulina, ciclodextrina, ácido hialurónico, proteína, agente de enlace de proteína, molécula que dirige a la integrina, policatiónico, péptido, poliamina, mimético de péptido, y/o transferrina.

15. Una composición que comprende un agente ARNi de alfa-ENaC, en donde el agente ARNi comprende una cadena codificante y una cadena no codificante,

en donde la cadena codificante comprende al menos 19 nucleótidos contiguos a partir de la cadena codificante de un agente ARNi seleccionado del grupo que consiste de ND8357 (SEQ ID NO: 145) , ND8573 (SEQ ID NO: 449) y

ND8313 (SEQ ID NO: 57) y

en donde la cadena no codificante comprende al menos 19 nucleótidos contiguos a partir de la cadena no codificante de un agente ARNi seleccionado del grupo que consiste de ND8357 (SEQ ID NO: 146) , ND8573 (SEQ ID NO: 450) y ND8313 (SEQ ID NO: 58) ,

la composición que además comprende un ligando de receptor epitelial.

16. La composición de la reivindicación 15, en donde el ligando de receptor epitelial es (i) la transferrina o (ii) el ácido fólico.

17. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 15, para uso en terapia.

18. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 15, para utilizar en el tratamiento de una enfermedad mediada por la disfunción del canal de sodio epitelial seleccionado de: fibrosis quística, disquinesia ciliar primaria,

bronquitis crónica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) , asma, infecciones de las vías respiratorias, carcinoma de pulmón, síndrome de Liddle, hipertensión, insuficiencia renal, y/o desequilibrio de electrolitos.

Figura 1 Figura 2 Traducción: Figura 3