Ingeniería de sistemas, métodos y composiciones de guía optimizadas para manipulación de secuencias.

Un sistema vector asociado a CRISPR - Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas

(CRISPR) (Cas) (CRISPR-Cas) que no se encuentran en la naturaleza, de ingeniería, que comprende uno o más vectores que comprenden:

a) un primer elemento regulador unido de manera operable a una o más secuencias de nucleótidos que codifican una o más secuencias de polinucleótidos del sistema CRISPR-Cas que comprende una secuencia guía, un ARNtracr y una secuencia de emparejamiento tracr, en la que la secuencia guía se hibrida con una o más secuencias objetivo en los sitios de los polinucleótidos en una célula eucariota,

b) un segundo elemento regulador unido de manera operable a secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cas9 de Tipo II,

en el que los componentes (a) y (b) están situados en los mismos vectores o diferentes vectores del sistema,

en el que el sistema CRISPR-Cas comprende dos o más señales de localización nuclear (las NLS) expresadas con la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Cas9,

según lo cual una o más secuencias guía fijan como objetivo uno o más sitios de polinucleótidos en una célula eucariota y la proteína Cas9 escinde uno o más sitios de polinucleótidos, según lo cual se modifica la secuencia de uno o más sitios de polinucleótidos.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E14170383.

Solicitante: The Broad Institute, Inc.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 7 Cambridge Center Cambridge, MA 02142 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: ZHANG, FENG, CONG,LE, HSU,PATRICK, RAN,FEI.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/63 (Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión)

PDF original: ES-2542015_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Ingeniería de sistemas, métodos y composiciones de guía optimizadas para manipulación de secuencias.

Campo de la invención La presente descripción se refiere en general a sistemas, métodos y composiciones usados para el control de la expresión de genes que implica fijar como objetivo una secuencia, tal como perturbación del genoma o edición de genes, que pueden usar sistemas vector relacionados con Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas (CRISPR, por sus siglas en inglés) y componentes de los mismos Informe en cuanto a investigación patrocinada federalmente Esta invención se realizó con soporte del gobierno otorgado por el Pioneer Award del NIH, Institutos Nacionales de Salud, OP1 MH100706. El gobiemo tiene ciertos derechos en la invención.

Antecedentes de la invención Los recientes avances en las técnicas de secuenciación del genoma y métodos de análisis han acelerado significativamente la capacidad para catalogar y cartografiar factores genéticos asociados a un diverso intervalo de funciones biológicas y enfermedades. Se requieren tecnologias precisas para fijar como objetivo genoma para permitir la ingeniería inversa sistemática de variaciones genéticas causales permitiendo la perturbación selectiva de elementos genéticos individuales, asi como avanzar las aplicaciones de la biología sintética, biotecnológicas y médicas. Aunque están disponibles técnicas de edición de genoma tales como dedos de cinc diseñadores, efectores del tipo activador de la transcripción (los TALE, por sus siglas en inglés) o meganucleasas de migración para producir perturbaciones del genoma fijado como objetivo, sigue existiendo la necesidad de nuevas tecnologías de ingeniería del genoma que tengan un precio asequible, fáciles de montar, escalables y susceptibles de fijar como objetivo múltiples posiciones dentro del genoma eucariota.

Sumario de la invención Existe una necesidad apremiante de sistemas y técnicas altemativos y robustos para fijar como objetivo secuencias con una amplia serie de aplicaciones. Esta invención estudia esta necesidad y proporciona ventajas relacionadas. El CRISPRlCas o el sistema CRISPR-Cas (ambos términos se usan de manera intercambiable por toda esta solicitud) no requiere la generaciÓfl de proteínas personalizadas para secuencias específicas fijadas como objetivo sino más bien se puede programar una enzima Cas única mediante una molécula de ARN corta para reconocer un objetivo de AON especifico, en otras palabras la enzima Cas se puede reclutar para un objetivo de AON específico usando dicha molécula de ARN corta. Añadir el sistema CRISPR-Cas al repertorio de técnicas de secuenciación del genoma y métodos de análisis puede simplificar de manera significativa la metodología y acelerar la capacidad para catalogar y cartografiar factores genéticos asociados a un diverso intervalo de funciones biológicas y enfermedades. Para utilizar el sistema CRISPR-Cas de manera eficaz para editar genoma sin efectos pe~udiciales, es crítico comprender aspectos de ingeniería y optimización de estas herramientas de ingeniería del genoma, que son aspectos de la invención reivindicada En un aspecto, la descripción proporciona un sistema vector que comprende uno o más vectores. En algunas realizaciones, el sistema comprende: (a) un primer elemento regulador ligado de manera operable a una secuencia de emparejado tracr y uno o más sitios de inserción para insertar una o más secuencias guía aguas arriba de la secuencia de emparejado tracr, en la que cuando se expresa, la secuencia guía se dirige a unión específica de secuencias de un complejo CRISPR a una secuencia fijada como objetivo en una célula, por ejemplo, célula eucariota, en la que el complejo CRISPR comprende una enzima CRISPR complejada con (1 ) la secuencia guía que se hibrida a la secuencia fijada como objetivo y (2) la secuencia de emparejado tracr que se hibrida a la secuencia tracr y (b) un segundo elemento regulador ligado de manera operable a una secuencia codificadora de enzimas que codifica dicha enzima CRISPR que comprende una secuencia de localización nuclear; en el que los componentes

(a) y (b) están situados en los mismos vectores o diferentes del sistema. En algunas realizaciones, el componente

(a) comprende además la secuencia tracr aguas abajo de la secuencia de emparejamiento tracr bajo el control del primer elemento regulador. En algunas realizaciones, el componente (a) comprende además dos o más secuencias guía ligadas de manera operable al primer elemento regulador, en el que cuando se expresan, cada una de las dos

o más secuencias guía dirige unión específica de la secuencia de un complejo CRISPR a una secuencia objetivo diferente en una célula euca riota. En algunas realizaciones, el sistema comprende la secuencia tracr bajo el control de un tercer elemento regulador, tal como un activador de polimerasa 111. En algunas rea lizaciones, la secuencia tracr presenta al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de complementariedad de secuencias a lo largo de la longitud de la secuencia de emparejado tracr cuando se alinean de manera óptima. En algunas realizaciones, el complejo CRISPR comprende una o más secuencias de localización nuctear de suficiente fortaleza para conducir la acumulación de dicho complejo CRISPR en una cantidad detectable en el núcleo de una célula eucariota. Sin desear estar ligados por la teoría, se cree que una secuencia de localización nuclear no es necesariamente para actividad del complejo CRISPR en eucariotas, sino que incluyendo tales secuencias se mejora la actividad del sistema, especialmente en cuanto a moléculas de ácido nucleico fijadas como objetivo en el núcleo. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es una enzima del sistema CRISPR de tipo 11. En algunas realizaciones, la enzima

CRISPR es una enzima Cas9. En algunas realizaciones, la enzima Cas9 es Cas9 S. pneumoniae, S. pyogenes o S thermophilus y puede incluir Cas9 mutada derivada de estos organismos. La enzima puede ser un homólogo u ortólogo de Cas9. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR es codón-optimizada para expresión en una célula eucariota. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR dirige la escisión de una o dos hebras en la posición de la secuencia objetivo. En algunas realizaciones, la enzima CRISPR carece de actividad de escisión de la cadena de ADN. En algunas realizaciones, el primer elemento regulador es un activador de la polimerasa 111. En algunas realizaciones, el segundo elemento regulador es un activador de la polimerasa 11. En algunas realizaciones, la secuencia guía tiene al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 nucleótidos o entre 10-30 o entre 15-25 o entre 15-20 nucleótidos de longitud. En general y por toda esta memoria descriptiva, el término ~vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Los vectores incluyen, pero no se limitan a, moléculas de ácido nucleico que son monocatenarias, bicatenarias o parcialmente bicatenarias; moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más extremos libres, ningún extremo libre (por ejemplo, circular) ; moléculas de ácido nucieico que comprenden ADN, ARN o ambos y otras variedades de polinucleótidos conocidos en la técnica. Un tipo de vector es un ~plásmido~, que se refiere a un bucle de ADN de doble cadena circular en que se pueden insertar segmentos de ADN adicionales, tal como por técnicas de clonación molecular clásicas. Otro tipo de vector es un vector virico, en el que están presentes secuencias de ADN o ARN derivadas viricamente en el vector para empaquetamiento en un virus (por ejemplo, retrovirus, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus, adenovirus de replicación defectuosa y virus adenoasociados) . Los vectores... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un sistema vector asociado a CRISPR -Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas (CRISPR) (Cas) (CRISPR-Cas) que no se encuentran en la naturaleza, de ingeniería, que comprende uno o más vectores que comprenden:

a) un primer elemento regulador unido de manera operable a una o más secuencias de nucleótidos que codifican una o más secuencias de polinucleótidos del sistema CRISPR-Cas que comprende una secuencia guía, un ARNtracr y una secuencia de emparejamiento tracr, en la que la secuencia gura se hibrida con una o mas secuencias objetivo en los sitios de los polinucleótidos en una célula eucariota,

b) un segundo elemento regulador unido de manera operable a secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cas9 de Tipo 11 ,

en el que los componentes (a) y (b) están situados en los mismos vectores o diferentes vectores del sistema,

en el que el sistema CRISPR-Cas comprende dos o más señales de localización nuclear (las NLS) expresadas con la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Cas9,

según lo cual una o más secuencias guía fijan como objetivo uno o más sitios de polinucleótidos en una célula eucariota y la proteína Cas9 escinde uno o más sitios de polinucleótidos, según lo cual se modifica la secuencia de uno o más sitios de polinucleÓtidos 2. Un sistema vector CRISPR-Cas de TIpo 11, que no se encuentra en la naturaleza, de ingeniería, según la reivindicación 1,

en el que la proteína Cas9 muta con respecto a una proteína Cas9 de tipo natural correspondiente de manera que la proteína mutada es una nickasa que carece de capacidad para escindir una hebra de un polinucleótido objetivo,

según lo cual una o más secuencias guía fijan como objetivo uno o más sitios de polinucleótidos en una célula eucariota y la proteína Cas9 sólo escinde una hebra de los sitios de polinucleótidos, según lo cual se modifica la secuencia de uno o más sitios de polinucleótidos.

3. El sistema de la reivindicación 1 ó 2, en el que los vectores son vectores víricos

4. El sistema de la reivindicación 3, en el que los vectores víricos son vectores víricos retrovirales, lentivíricos, adenovíricos, adenoasociados o de herpes simple

5. El sistema según cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en el que la proteína Cas9 comprende una o más mutaciones en los dominios catalíticos RuvC 1, RuvC 11 o RuvC 111

6. El sistema según cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en el que la proteína Cas9 comprende una mutación seleccionada del grupo que consiste en D10A, H840A, N854A y N863A con referencia a la numeración de la posición de una proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9) .

7. El sistema según cualquier reivindicación precedente, en el que al menos una NLS está en o cerca del término amino de la proteína Cas9 y/o al menos una NLS está en o cerca del término carboxi de la proteína Cas9

8. El sistema de la reivindicación 7, en el que al menos una NLS está en o cerca del término amino de la proteína Cas9 yJo al menos una NLS está en o cerca del término carboxi de la proteina Cas9

9. El sistema según cualquier reivindicación precedente, en el que una o más secuencias de polinucleótidos del sistema CRISPR-Cas comprenden una secuencia guía fusionada a una secuencia cr de activación trans (traer)

10. El sistema según cualquier reivindicación precedente, en el que la secuencia de polinucleótidos del sistema CRISPR-Cas es un ARN quimérico que comprende la secuencia guía, la secuencia traer y una secuencia de emparejamiento traer

11. El sistema según cualquier reivindicación precedente, en el que la célula eucariota es una célula de mamífero o una célula humana

12. El sistema según cualquier reivindicación precedente, en el que la proteína Cas9 es codón-optimizada para expresión en una célula eucariota.

13. Uso del sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para ingeniería de genomas, siempre que el uso no comprenda un procedimiento para modificar la identidad genética de la línea germinal de seres humanos y siempre que dicho uso no sea un método para tratamiento del cuerpo humano o de un animal por cirugía o terapia.

El uso de la reivindicación 13, en el que la ingeniería de genomas comprende modificar un polinucleótido objetivo en una célula eucariota, modificar la expresión de un polinucleótido en una célula eucariota, generar una célula eucariota modelo que comprenda un gen de enfermedad mutado o eliminar un gen 15. El uso de la reivindicaciórJ 13, en el que el uso comprende además reparar dicho polinucleótido fijado como objetivo escindido insertando un polinucleótido de plantilla exágeno, en el que dicha reparación da como resultado una mutación que comprende una inserción, supresión o sustitución de uno o más nucleótidos de dicho polinucleótido objetivo.

16. El uso de la reivindicaciórJ 13, en el que el uso comprende además editar dicho polinucleótido objetivo escindido insertando un polinucleótido de plantilla exágeno, en el que dicha ediciórJ da como resultado una mutación que comprende una inserción, supresión o sustitución de uno o más nucleótidos de dicho polinucleótido objetivo 17. El uso según la reivindicación 15ó 16, en el que la inserción es por recombinación homóloga 18. Uso del sistema según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la producción de un animal transgénico no humano o planta transgénica .