Ingeniería de glicosilación de anticuerpos para mejorar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo.

Una célula hospedadora de mamífero que expresa un anticuerpo recombinante que comprende una región Fc de IgG que contiene oligosacáridos enlazados a N,

en donde dicha célula hospedadora ha sido modificada genéticamente para regular la expresión incrementada de al menos una enzima seleccionada del grupo constituido por β(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III, β(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa V, y manosidasa II, en donde dicho anticuerpo recombinante tiene una proporción incrementada de residuos GlcNAc en la región Fc con relación a la proporción de residuos fucosa y tiene una citotoxicidad celular incrementada mediada por Fc, comparado con el anticuerpo correspondiente producido por la misma célula hospedadora que no ha sido modificada genéticamente.

Ingeniería de glicosilación de anticuerpos para mejorar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo.

I. CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo de la ingeniería de glicosilación de proteínas. Más particularmente, la presente invención se refiere a ingeniería de glicosilación para generar proteínas con propiedades terapéuticas mejoradas, que incluyen anticuerpos con citotoxicidad celular aumentada dependiente del anticuerpo.

II.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las glicoproteínas median muchas funciones esenciales en los seres humanos, otros organismos eucariotas, y algunos procariotas, que incluyen catálisis, señalización, comunicación célula-célula, y reconocimiento y asociación moleculares. Las mismas constituyen la mayoría de las proteínas no citosólicas en los organismos eucariotas. Lis y Sharon, 1993, Eur. J. Biochem. 218:1-27. Muchas glicoproteínas han sido aprovechadas para propósitos terapéuticos, y durante las dos últimas décadas, las versiones recombinantes de glicoproteínas secretadas existentes naturalmente se han convertido en un producto importante de la industria biotecnológica. Ejemplos incluyen eritropoyetina (EPO) , anticuerpos monoclonales terapéuticos (mAbs terapéuticos) , activador del plasminógeno tisular (tPA) , interferón-β, (IFN-β) , factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) , y gonadotropina coriónica humana (hCH) . Cumming et al., 1991, Glycobiology 1:115-130.

El componente oligosacárido puede afectar significativamente a las propiedades concernientes a la eficacia de una glicoproteína terapéutica, con inclusión de la estabilidad física, resistencia al ataque de las proteasas, interacciones con el sistema inmunitario, farmacocinética, y actividad biológica específica. Tales propiedades pueden depender no sólo de la presencia o ausencia, sino también de las estructuras específicas, de los oligosacáridos. Pueden hacerse algunas generalizaciones entre la estructura de los oligosacáridos y la función de las glicoproteínas. Por ejemplo, ciertas estructuras de oligosacárido median el aclaramiento rápido de la glicoproteína del torrente sanguíneo por interacciones con proteínas específicas de fijación de carbohidratos, en tanto que otras pueden estar ligadas por anticuerpos y desencadenar reacciones inmunes indeseables. Jenkins et al., 1996, Nature Biotechn. 14: 975-981.

Las células de mamífero son los hospedadores preferidos para la producción de glicoproteínas terapéuticas, debido a su capacidad para glicosilar las proteínas en la forma más compatible para aplicación humana. Cumming, 1991, arriba; Jenkins et al., 1996, arriba. Las bacterias glicosilan proteínas muy raramente, y al igual que otros tipos de hospedadores comunes, tales como levaduras, hongos filamentosos, células de insecto y células vegetales, producen patrones de glicosilación asociados con aclaramiento rápido del torrente sanguíneo, interacciones inmunes indeseables, y en algunos casos específicos, actividad biológica reducida. Entre las células de mamífero, las células de ovario de hámster chino (CHO) han sido utilizadas con gran frecuencia durante las dos últimas décadas. Además de proporcionar patrones de glicosilación adecuados, estas células permiten una generación coherente de líneas de células clonales genéticamente estables y muy productivas. Las mismas pueden cultivarse hasta densidades altas en biorreactores simples utilizando medios exentos de suero, y permiten el desarrollo de bioprocesos seguros y reproducibles. Otras células animales utilizadas comúnmente incluyen células de riñón de cría de hámster (BHK) , células de mieloma de ratón NSO- y SP-2/0. Más recientemente, se ha testado también la producción a partir de animales transgénicos. Jenkins et al., 1996, arriba.

La glicosilación de proteínas terapéuticas recombinantes producidas en células animales puede realizarse técnicamente por sobreexpresión de genes de glicosil-transferasa en células hospedadoras. Bailey, 1991, Science 252: 1668-1675. Sin embargo, el trabajo previo en este campo ha utilizado únicamente la expresión constitutiva de los genes de glicosil-transferasa modificadores de glicoproteínas, y se ha prestado escasa atención al nivel de expresión.

WO 97/30087 se refiere a una preparación de anticuerpos en la cual un sitio de glicosilación en N del dominio Fc del anticuerpo está sustituido con un oligosacárido bi-antenario, en donde al menos 20% de la preparación comprende moléculas de anticuerpo que tienen un oligosacárido que contiene al menos un residuo galactosa.

III. SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención está dirigida a células hospedadoras para la generación de proteínas que tienen un patrón de glicosilación alterado que da como resultado valores terapéuticos mejorados. En una realización específica, la invención está dirigida a células hospedadoras que han sido modificadas por ingeniería de tal modo que las mismas son capaces de expresar un rango preferido de una actividad de glicosil-transferasa modificadora de las glicoproteínas que aumenta los oligosacáridos complejos enlazados a N que llevan GlcNAc bisectante. Se describen también en esta memoria métodos para la generación de glicoformas modificadas de glicoproteínas, por ejemplo anticuerpos, con inclusión de moléculas de anticuerpo enteras, fragmentos de anticuerpo, o proteínas de fusión incluyen una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina, teniendo una citotoxicidad celular mediada por Fc incrementada, y las glicoproteínas así generadas. La invención está basada, en parte, en el descubrimiento por los inventores de que existe un rango óptimo de expresión de glicosil-transferasa modificadora de las glicoproteínas para la maximización de oligosacáridos complejos enlazados a N que llevan GlcNAc bisectante.

La presente invención proporciona una célula hospedadora de mamífero que expresa un anticuerpo recombinante que comprende una región Fc de IgG que contiene oligosacáridos enlazados a N, en donde dicha célula hospedadora ha sido modificada genéticamente para regular la expresión incrementada de al menos una enzima seleccionada del grupo constituido por β (1, 4) -N-acetilglucosaminiltransferasa III, β (1, 4) -Nacetilglucosaminiltransferasa V, y manosidasa II, en donde dicho anticuerpo recombinante tiene una proporción incrementada de residuos GlcNAc en la región Fc con relación a la proporción de residuos fucosa y tiene una citotoxicidad celular incrementada mediada por Fc, comparado con el anticuerpo correspondiente producido por la misma célula hospedadora que no ha sido modificada genéticamente.

La presente invención proporciona también un anticuerpo recombinante producido por la célula hospedadora de la invención para uso en medicina, en particular para uso en el tratamiento del cáncer.

IV. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIGURA 1 muestra la representación de estructuras típicas de oligosacáridos asociados a Fc.

La FIGURA 2 representa un análisis por transferencia western de la expresión regulada por tetraciclina de GnT-III en dos clones de CHO productores de tTA diferentes. Células CHOt2 (pistas A y B) CHOt17 (pistas C y D) se transfectaron con el vector de expresión pUDH10-3GnT-IIIm y se cultivaron durante 36 horas en ausencia (pistas A y C) o presencia de tetraciclina, a una concentración de 400 ng/ml (pistas B y D) . Se prepararon luego lisados de células para análisis por transferencia western sondando con un anticuerpo (9E10) , que reconoce específicamente el marcador c-myc añadido a GnT-III en su término carboxi.

La FIGURA 3 representa la determinación del rango de concentraciones de tetraciclina en las que puede controlarse la expresión de GnT-III marcada con myc. Se transfectaron células CHOt17 con el vector de expresión pUDH10-3-GnT-IIIm y se cultivaron luego durante 48 horas en presencia de las concentraciones indicadas de tetraciclina. Los niveles de GnT-III en los lisados se compararon en los lisados de células de estos cultivos utilizando análisis por transferencia western. Se detectó GnT-III por la vía del marcador c-myc utilizando el anticuerpo 9E10.

Las FIGURAS 4A a 4B representan el cribado de clones CHO para expresión estable y regulada por tetraciclina de GnT V (FIGURA 4A) o glicosiltransferasas GnT-III marcadas con myc (FIGURA 4B) por análisis por transferencia western. Se co-transfectaron células CHOt17 con un vector para expresión de resistencia a puromicina (pPUR) y o bien pUHD10-3GnTV (FIGURA 4A) o clones pUDH10-3GnT-IIIm (FIGURA 4B) y se seleccionaron clones CHO estables respecto a resistencia a puromicina (7, 5 μ/ml)... [Seguir leyendo]

1. Una célula hospedadora de mamífero que expresa un anticuerpo recombinante que comprende una región Fc de IgG que contiene oligosacáridos enlazados a N, en donde dicha célula hospedadora ha sido modificada genéticamente para regular la expresión incrementada de al menos una enzima seleccionada del grupo constituido por β (1, 4) -N-acetilglucosaminiltransferasa III, β (1, 4) -N-acetilglucosaminiltransferasa V, y manosidasa II, en donde dicho anticuerpo recombinante tiene una proporción incrementada de residuos GlcNAc en la región Fc con relación a la proporción de residuos fucosa y tiene una citotoxicidad celular incrementada mediada por Fc, comparado con el anticuerpo correspondiente producido por la misma célula hospedadora que no ha sido modificada genéticamente.

2. La célula hospedadora de la reivindicación 1, en donde dicha al menos una enzima es β (1, 4) -Nacetilglucosaminiltransferasa III.

3. La célula hospedadora de la reivindicación 1, en donde dicha al menos una enzima es manosidasa II.

4. La célula hospedadora de la reivindicación 1, en donde dicha al menos una enzima es β (1, 4) -Nacetilglucosaminiltransferasa III y manosidasa II.

5. La célula hospedadora de la reivindicación 4, en donde dichas β (1, 4) -N-acetilglucosaminiltransferasa III y manosidasa II se encuentran bajo el control de uno o más promotores constitutivos.

6. La célula hospedadora de la reivindicación 1, en donde dicha modificación genética comprende introducir en dicha células hospedadora al menos un polinucleótido que codifica una enzima seleccionada del grupo constituido por β (1, 4) -N-acetilglucosaminiltransferasa III, β (1, 4) -N-acetilglucosaminiltransferasa V, y manosidasa II.

7. La célula hospedadora de la reivindicación 1, en donde dicha célula hospedadora se selecciona del grupo constituido por una célula CHO modificada por ingeniería de glicosilación, una célula BHK modificada por ingeniería de glicosilación, una célula NSO modificada por ingeniería de glicosilación, y una célula SP 2/0 modificada por ingeniería de glicosilación.

8. La célula hospedadora de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo recombinante es un anticuerpo quimérico.

9. La célula hospedadora de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo recombinante se selecciona del grupo constituido por un anticuerpo entero y un fragmento de anticuerpo o una proteína de fusión que incluye una región Fc de una inmunoglobulina.

10. La célula hospedadora de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo recombinante es un anticuerpo terapéutico.

11. La célula hospedadora de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo recombinante es un anticuerpo monoclonal.

12. La célula hospedadora de la reivindicación 1, en donde dicha al menos una enzima es GnT-III de rata o GnT V humana.

13. Un anticuerpo recombinante producido por la célula hospedadora de cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para uso en medicina.

14. Un anticuerpo recombinante producido por la célula hospedadora de cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para uso en el tratamiento del cáncer.