Identificación de proteínas de unión específicas al antígeno o al ligando.

Un método para aislar e identificar por lo menos una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo específico para un antígeno o ligando deseado, que comprende las etapas de:

(a) transducir al menos una construcción de expresión retroviral que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo en células anfitrionas de vertebrados mediante el uso de partículas retrovirales incompetentes para la replicación, donde la al menos una construcción se integra de forma estable en el genoma de la célula anfitriona de modo que las células anfitrionas transducidas son capaces de expresar y presentar dicho anticuerpo o fragmento del mismo en su superficie celular y donde las células anfitrionas de vertebrados son linfocitos B precursores que expresan de forma endógena moléculas de Igα e Igß que facilitan la deposición en membrana de dicho anticuerpo o fragmento del mismo y que son incapaces de expresar polipéptidos de anticuerpos endógenos y al menos un componente de la cadena ligera sustituta;

(b) expresar de forma estable dicho anticuerpo o fragmento del mismo en dichas células anfitrionas de vertebrados y presentar el mismo en su superficie celular;

(c) enriquecer las células anfitrionas de vertebrados que expresan dicho anticuerpo o fragmento del mismo sobre la base de su capacidad para unirse a dicho antígeno o ligando deseado mediante la separación de células que exhiben una unión al antígeno específica a partir de una población de células que no se unen, de este modo se aíslan selectivamente anticuerpos enlazantes potentes con una afinidad elevada por dicho antígeno o ligando deseado; y

(d) aislar e identificar dicha al menos una secuencia de nucleótidos que codifica dicho anticuerpo o fragmento de este a partir de las células anfitrionas de vertebrados transducidas y enriquecidas retroviralmente.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E09003076.

Solicitante: 4-Antibody AG.

Nacionalidad solicitante: Suiza.

Dirección: Hochbergerstrasse 60C 4057 Basel SUIZA.

Inventor/es: GRAWUNDER, ULF, STITZ,JÖRN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/705 (Receptores; Antígenos celulares de superficie; Determinantes celulares de superficie)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/68 (en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos)

PDF original: ES-2528753_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Identificación de proteínas de unión específicas al antígeno o al ligando.

Campo de la invención La presente invención se refiere a nuevos métodos para la generación, expresión y detección de diversas colecciones de proteínas de unión en células de vertebrados in vitro, que permiten la identificación y el aislamiento de proteinas de unión reactivas al ligando o al anligeno. En particular, la presente invención describe métodos para la expresión retroviral, el aislamiento y la identificación de por lo menos una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o fragmento de este, especifico para un antigeno o ligando deseado.

Antecedentes Las tecnologías de expresión han desempeñado un papel fundamental en el aislamiento de proteínas de unión específicas de alta afinidad con fines diagnósticos y terapéuticos en un gran número de trastornos y enfermedades Estas tecnologías alcanzan el vasto campo de la ingeniería de anticuerpos, enzimas sintéticas, proteómicas y síntesis de proteinas in vitro. Las tecnologias de expresión biomoleculares que permiten la construcción de una gran reserva de biomoléculas codificadas modularmente, su expresión con fines de selección según sus propiedades y la rápida caracterización (decodificación) de sus estructuras, son especialmente útiles para acceder y analizar una diversidad de proteínas a gran escala. Recientemente han adquirido importancia las tecnologías de expresión in vitro debido al aislamiento de anticuerpos por expresión de fago, expresión de ribosomas y expresión microbiana que actualmente se han convertido en las plataformas dominantes en el campo de la ingeniería de proteínas y anticuerpos. Sin embargo, la expresión microbiana y los sistemas de expresión tienen limitaciones, espeCialmente para la expresión de grandes proteínas diméricas de vertebrados, lales como los anticuerpos. Esto se debe a la incapacidad general de expresar anticuerpos de longitud completa en dichos sistemas de expresión, que requiere la expresión de fragmentos de anticuerpos modificados genéticamente, pero también debido a la falta de glicosilación, la ausencia de proteinas chaperonas, la falta de compartimientos subcelulares y de tráfico de proteínas específicas a las células eucariotas, que individual y colectivamente dan como resultado artefactos plegables de proteínas en proteínas de mamíferos expresadas microbianamente. Recientemente se han desarrollado también métodos de expresión in vitro empleando células anfitrionas eucariotas, entre eUas, células de levadura, de vegetales y mamíferos. Los sistemas de expresión de células de levadura y de vegetales también carecen de chaperones específicos de glicosilación y específicos para células de vertebrados y mamíferos, de modo que las mismas limitaciones relativas al plegado de proteinas rigen con respecto a la expresión de proteinas de vertebrados en dichos sistemas. Sólo puede esperarse que la expresión, el plegamiento de proteínas y la modificación postraducción de grandes proteínas recombinadas, como los anticuerpos, tenga lugar con razonable eficiencia y calidad en los sistemas de expresión de vertebrados, que idealmente expresan proteínas en los sistemas celulares más estrechamente relacionados desde el punto de vista filogenético Por lo tanto, las proteínas interesantes desde el punto de vista terapéutico, como los anticuerpos de roedores o de humanos, idealmente son expresadas en células de roedores o de humanos y no sorprende que las autoridades reguladoras aprueben sólo los sistemas de expresión provenientes de dichas especies para la producción de anticuerpos terapéuticos de longitud completa aptos para uso clínico. Sin embargo, los sistemas de expresión basados en células de mamíferos y vertebrados son trabajosos, requieren marcos a largo plazo para establecer

clones y líneas celulares producidas en forma estable y la modificación genéticamente controlada y eficiente de dichas células generalmente no es simple y por lo tanto hace que estos sistemas sean menos atractivos para los métodos de detección y expresión. Por ejemplo, los métodos de transfección de ADN no pueden ser controlados en cuanto al número de construcciones de ADN que son incorporadas a las células transfectadas, ya sea en forma transitoria o estable, lo cual impide la expresión clonal de colecciones de proteinas y por lo tanto una detección gen a fenotipo precisa. Los sistemas virales de alternativa carecen de un control adecuado de la expresión clonal, de un mantenimiento estable de las construcciones genéticas y/o sufren el hecho de que dichos sistemas a menudo producen efectos citopaticos en las células objetivo (por ejemplo, la expresión de virus vacuna) de modo tal que los clones de las proteínas no pueden ser expresados y/o enriquecidos secuencialmente para un fenotipo particular como, por ejemplo, la unión específica a un anligeno.

Por ende, un objetivo de la presente invención es proporcionar un método que supere claramente todas las limitaciones y obstaculos anteriormente mencionados de los sistemas de selección y expresión de genes eucariotas y procariotas del arte previo. El método de conformidad con la invención utiliza la expresión retroviral estable de los anticuerpos en linfocitos B precursores, de modo que se logra la expresión estable y preferiblemente clonal de las proteínas de anticuerpos en presencia de proteínas chaperonas de g1icosilación y trafico de proteínas apropiados, garantizando así el plegamiento de las proteínas apropiadas y permitiendo la detección eficiente y, si se desea, repetida de los clones de anticuerpo de unión al antígeno. Habida cuenta que el método de conformidad con la invención está basado en la expresión retroviral de los anticuerpos o fragmentos de los mismos en los linfocitos B precursores, la tecnología descrita en el presente se denomina 'Retrocyte Display' (por retroviral preB Iymphocvte 65 display (expresión retroviral de linfocito preB) ) Sumario de la invención La presente invención se relaciona generalmente con la provisión de anticuerpos con fines diagnósticos o terapéuticos o fragmentos de estos. En particular, se relaciona con la identificación y la selección de los anticuerpos reactivos al antígeno con secuencias de aminoácidos completamente humanos de interés para aplicaciones terapéuticas. Las realizaciones de la invención involucran vectores de expresión retroviral que permiten la expresión de diversas colecciones de anticuerpos o fragmentos de estos, en linfocitos B precursores de vertebrados, y métodos eficaces de aislamiento de moléculas reactivas al antígeno. La presente invención proporciona métodos novedosos para la generación de diversas colecciones de anticuerpos o fragmentos de estos mediante tres métodos alternativos. Primero, mediante barajado de cadenas de al menos una molécula de cadena pesada o ligera contra una colección diversa (banco) de cadenas ligeras o pesadas (enfoque de barajado de cadenas) , o segundo, mediante la diversificación de al menos una combinación de una cadena pesada y ligera de un anticuerpo después de la transducción retroviral en las células de vertebrados in situ mediante la mutación somática de las construcciones de expresión transducidas en forma retroviral (enfoque de mutación somática) , o tercero, mediante la recombinación Y (O}J de construcciones de expreSión transducidas retroviralmente que contienen las regiones codificantes de los dominios de unión variables en configuración ·cuasi·linea genninal" es decir, todavia separada en segmentos génicos Y, opcionalmente O y J (enfoque de recombinación Y (D) J) . Se entenderá que las diversas colecciones de anticuerpos o fragmentos de estos pueden generarse también mediante cualquier combinación de los métodos mencionados... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para aislar e identificar por lo menos una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo específico para un antígeno o ligando deseado, que comprende las etapas de·

(a) transducir al menos una construcción de expresión retroviral que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo en células anfitrionas de vertebrados mediante el uso de partículas retrovirales incompetentes para la replicación , donde la al menos una construcción se integra de forma estable en el genoma de la célula anfitriona de modo que las células anfitrionas transducidas son capaces de expresar y presentar dicho anticuerpo o fragmento del mismo en su superficie celular y donde las células anfitrionas de vertebrados son linfocitos B precursores que expresan de forma endógena moléculas de Igo e Ig~ que facilitan la deposición en membrana de dicho anticuerpo o fragmento del mismo y que son incapaces de expresar polipéptidos de anticuerpos endógenos y al menos un componente de la cadena ligera sustituta;

(b) expresar de fonna estable dicho anticuerpo o fragmento del mismo en dichas células anfitrionas de vertebrados y presentar el mismo en su superficie celular;

(c) enriquecer las células anfitrionas de vertebrados que expresan dicho anticuerpo o fragmento del mismo sobre la base de su capacidad para unirse a dicho antígeno o ligando deseado mediante la separación de células que exhiben una unión al antigeno específica a partir de una población de células que no se unen, de este modo se aíslan selectivamente anticuerpos enlazantes potentes con una afinidad elevada por dicho antígeno o ligando deseado; y

(d) aislar e identificar dicha al menos una secuencia de nucleótidos que codifica dicho anticuerpo o fragmento de este a partir de las células anfitrionas de vertebrados transducidas y enriquecidas retroviralmente.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la etapa (d) está precedida por la expansión de dichas células anfitrionas de vertebrados enriquecidas en histocultivo

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 en donde la etapa (cl está seguida por la expansión de tales células anfitrionas de vertebrados enriquecidas en histocultivo, después de lo cual se repite la etapa (c) como se definió en la reivindicación 1, por lo menos una vez

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde la Iransducción retroviral se lleva a cabo a una multiplicidad de infección igualo menor a 0, 1.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en donde el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en donde el fragmento de un anticuerpo se selecciona del grupo integrado por: una cadena pesada, una cadena ligera, un dominio V .... único, un dominio VL único, un fragmento scFv, un fragmento Fab y un fragmento F (ab') 2.

7. El método de confonnidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde las células anfitrionas de vertebrados se derivan de un grupo de especies integrado por peces cartilaginosos, peces teleósteos, anfibios, reptiles, aves, mamíferos, incluidos cerdos, ovejas, ganado vacuno, caballos y roedores, inclusive ratones, ralas, conejos y cobayos.

8. El método de conformidad con la reivindicación 7 en donde la especie de célula anfitrión de vertebrado preferida es de ratón.

9. El método de conformidad con la reivindicación 5 en donde el anticuerpo de longitud completa se selecciona del grupo integrado por: un anticuerpo completamente humano, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo híbrido

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en donde la al menos una secuencia de nucleótidos es una pluralidad de secuencias de nucleótidos que codifica (i) una secuencia de cadena pesada de anticuerpo y múltiples secuencias de cadena ligera de anticuerpo, o (ii) una secuencia de cadena ligera de anticuerpo y múltiples secuencias de cadena pesada de anticuerpo

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en donde el anticuerpo o el fragmento del mismo comprende un dominio de unión variable codificado por esa al menos una construcción de expresión retroviral que permite la recombinación V (D) J a fin de generar una secuencia codificante para un dominio de unión variable tras la transducción retroviral

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en donde la etapa (b) se lleva a cabo en condícíones mutagenízantes

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en donde la expresión de ese anticuerpo o fragmento del mismo en las células anfitrionas de vertebrado transducidas retroviralmenle está unido operativamente a

(a) por lo menos un marcador de selección de antibiótico,

(b) por lo menos un marcador de detección, ylo a

(c) una combinación de los mismos,

y en donde la expresión de dicho anticuerpo o fragmento del mismo esta unida al uso de por lo menos una secuencia interna de entrada al ribosoma (IRES) .

14. El método de confonnidad con la reivindicación 13 en donde el al menos un marcador de detección es (i) una proteína fluorescente seleccionada del grupo integrado por la proteína verde fluorescente (GFP) , la proteína amarilla fluorescente (YFP) , la proteína roja fluorescente (RFP) y la proteína azul fluorescente (BFP) ; o (ii) un marcador de superficie celular seleccionado del grupo integrado por C07, C034 y el receptor del factor de crecimiento de nervios de baja afinidad.

15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en donde la etapa (e) de enriquecimiento se lleva a cabo mediante separación física de células a partir de una población de células que no se unen, usando:

(i) separación de células activadas por fluorescencia (FACS) ;

(ii) micromanipulación; o

(iii) métodos panning para antígeno o ligando deseado inmovilizado.