Molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con:

(a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido PRO286 que tiene los residuos de aminoácidos de 27 a 825 de la figura 1 (SEC ID N.º: 3) en la que el polipéptido tiene la capacidad para inducir la activación de NF-?B, o el complemento de la molécula de ADN; o

(b) una molécula de ADN que codifica el mismo polipéptido maduro codificado por el ADNc de la proteína humana de tipo Toll en el n.º de depósito ATCC 209386 (DNA42663-1154), en la que el polipéptido tiene la capacidad para inducir la activación de NF-?B, o el complemento de la molécula de ADN

Homólogos de tipo Toll humanos.

La presente invención se refiere generalmente a la identificación y aislamiento de nuevos ADN, designados en la presente como DNA42663, y a la producción recombinante de nuevos homólogos de tipo Toll humanos (designados como PRO286) codificados por dichos ADN.

Antecedentes de la invención

Las proteínas y receptores unidos a la membrana pueden desempeñar un papel importante en la formación, diferenciación y mantenimiento de organismos pluricelulares. El destino de muchas de las distintas células, por ejemplo proliferación, migración, diferenciación o interacción con otras células, habitualmente es controlado por información recibida de otras células y/o el entorno inmediato. Esta información a menudo es transmitida por polipéptidos secretados (por ejemplo, factores mitogénicos, factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de diferenciación, neuropéptidos y hormonas) que, a su vez, son recibidos e interpretados por diversos receptores celulares o proteínas unidas a la membrana. Entre tales proteínas y receptores celulares unidos a la membrana se incluyen, pero no exclusivamente, receptores de citocinas, receptores quinasas, receptores fosfatasas, receptores implicados en interacciones célula-célula y moléculas de adhesina celular como las selectinas y las integrinas. Por ejemplo, la transducción de señales que regulan el crecimiento y la diferenciación celular es regulada en parte por la fosforilación de varias proteínas celulares. Las proteínas tirosinquinasas, enzimas que catalizan aquel proceso, también pueden actuar como receptores de factores de crecimiento. Entre los ejemplos se incluyen el receptor del factor de crecimiento del fibroblasto y el receptor del factor de crecimiento nervioso.

Las proteínas y las moléculas receptoras unidas a la membrana tienen varias aplicaciones industriales, entre las que se incluyen de agentes farmacéuticos y de diagnóstico. Las inmunoadhesinas de receptores, por ejemplo, pueden utilizarse como agentes terapéuticos para bloquear la interacción receptor-ligando. Las proteínas unidas a la membrana también pueden utilizarse para el cribado de posibles péptidos o inhibidores de molécula pequeña de la interacción relevante receptor/ligando.

Tanto la industria como el mundo universitario están llevando a cabo esfuerzos para identificar nuevas proteínas receptoras nativas. Muchos de estos esfuerzos se concentran en el cribado de genotecas de ADN recombinante para identificar las secuencias que codifican nuevas proteínas receptoras.

Hashimoto y otros, Cell 52, 289-279 (1988), describieron la clonación del gen Toll de Drosophila, un gen de efecto materno que desempeña un papel fundamental en el establecimiento del patrón embrionario dorsal-ventral. El gen Toll de Drosophila codifica una proteína incorporada en la membrana con un dominio extracitoplasmático de 803 aminoácidos y un dominio citoplasmático de 269 aminoácidos. El dominio extracitoplasmático tiene un posible segmento que abarca la membrana y contiene múltiples copias de un segmento rico en leucina, un motivo estructural hallado en muchas proteínas transmembrana. La proteína Toll controla el modelado dorsal-ventral en embriones de Drosophila y activa el factor de transcripción Dorsal en la unión con su ligando Spätzle. (Morisato y Anderson, Cell 76, 677-688 (1994)). En adultos de Drosophila, la vía de señalación Toll/Dorsal participa en la respuesta inmunitaria antifúngica. (Lenaitre y otros, Cell 86, 973-983 (1996)).

Medzhitov y otros, Nature 388, 894-897 (1997), describieron un homólogo humano de la proteína Toll de Drosophila. Este Toll humano, al igual que el Toll de Drosophila, es una proteína transmembrana de tipo I, con un dominio extracelular que consiste en 21 motivos ricos en leucina repetidos en tándem (región rica en leucina, LRR), separados por una región no LRR, y un dominio citoplasmático homólogo al dominio citoplasmático del receptor humano de la interleucina 1 (IL-1). Se observó que un mutante esencialmente activo del Toll humano transfectado en estirpes celulares humanas era capaz de inducir la activación del NF-?B y la expresión de genes controlados por NF-?B para las citocinas inflamatorias IL-1, IL-6 e IL-8, así como la expresión de la molécula coestimuladora B7.1, que es necesaria para la activación de células T nativas. Se ha sugerido que Toll actúa en vertebrados como un receptor no clónico del sistema inmunitario, que puede inducir señales para activar tanto una respuesta inmunitaria innata como adaptativa en vertebrados. El gen Toll humano descrito por Medzhitov y otros, supra, se expresaba con mayor fuerza en el bazo y los leucocitos de sangre periférica (PBL), y los autores sugirieron que su expresión en otros tejidos puede ser debida a la presencia de macrófagos y células dendríticas, en las que podría actuar como sistema de primer aviso de infección. La base de datos pública Genbank contiene las siguientes secuencias Toll: Toll1 (ADNX n.º HSU88640.1, que es idéntico al ADNc n.º HUMRSC786-1 aleatorio secuenciado en toda su longitud); Toll2 (ADNX n.º HSU88878-1); Toll3 (ADNX n.º HSUB8879-1); y Toll4 (ADNX n.º HSU88880-1, que es idéntico a la secuencia de ADN descrita por Medzhitov y otros, supra). Una secuencia Toll parcial (Toll5) se halla disponible en GenBank bajo ADNX n.º HSU88881.1.

Recientemente se han clonado otros homólogos humanos de la proteína Toll de Drosophila, designados como receptores de tipo Toll (huTLRs1-5), y se ha observado que reflejan la estructura topográfica del homólogo de Drosophila (Rock y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 588-598 [1998]). La sobreexpresión de un mutante esencialmente activo de un TLR humano (homólogo de proteína Toll. Medzhitov y otros, supra; TLR4-Rock y otros, supra) conduce a la activación de NF-?B y a la inducción de las citocinas inflamatorias y las moléculas coestimuladoras. Medzhitov y otros, supra.

Descripción resumida de la invención

Los solicitantes han identificado tres nuevos clones de ADNc que codifican nuevos polipéptidos Toll humanos, designados en la presente solicitud como PRO285 (codificado por DNA40021), PRO286 (codificado por DNA42668) y PRO358 (codificado por DNA47361).

En una realización, la invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende un ADN que codifica un polipéptido que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con una molécula de ADN que codifica un polipéptido PRO286 que tiene los residuos de aminoácidos 27 a 825 de la figura 1 (SEC ID N.º:3), o el complemento de la molécula de ADN. La molécula de ADN complementario preferiblemente permanece unida de manera estable a dicha secuencia codificante de ácidos nucleicos al menos en condiciones moderadas y, opcionalmente, en condiciones muy restrictivas.

En una realización adicional, la molécula aislada de ácido nucleico comprende un polinucleótido que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de 1 a 1041 de la figura 1 (SEC ID N.º: 3).

En una realización específica, la presente invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico que comprende ADN que codifica polipéptidos PRO286 nativos o variantes, con o sin la secuencia de señal aminoterminal, y con o sin las regiones transmembrana de las secuencias respectivas en toda su longitud. En un aspecto, el ácido nucleico aislado comprende ADN que codifica un polipéptido maduro PRO286 nativo en toda su longitud que tiene los residuos de aminoácidos 1 a 1041 de la figura 1 (SEC ID N.º: 3), o es complementario a tal secuencia codificante de ácidos nucleicos. En otro aspecto, la presente invención se refiere a una molécula aislada de ácido nucleico que comprende ADN que codifica un polipéptido PRO286 nativo sin una secuencia señal aminoterminal, o es complementaria a tal secuencia codificante de ácidos nucleicos. Y aun en otra realización, la presente invención se refiere a un ácido nucleico que codifica formas en las que se ha inactivado o eliminado el dominio transmembrana de las proteínas PRO286 nativas en toda su longitud.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido PRO286 que comprende ADN que se híbrida al complemento del ácido nucleico entre aproximadamente los residuos 57 y aproximadamente 4.199, ambos inclusive, de la figura 2 (SEC ID N.º: 4). Preferiblemente, la hibridación tiene lugar bajo...

1. Molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene por lo menos un 95% de identidad de secuencia con:

(a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido PRO286 que tiene los residuos de aminoácidos de 27 a 825 de la figura 1 (SEC ID N.º: 3) en la que el polipéptido tiene la capacidad para inducir la activación de NF-?B, o el complemento de la molécula de ADN; o

(b) una molécula de ADN que codifica el mismo polipéptido maduro codificado por el ADNc de la proteína humana de tipo Toll en el n.º de depósito ATCC 209386 (DNA42663-1154), en la que el polipéptido tiene la capacidad para inducir la activación de NF-?B, o el complemento de la molécula de ADN.

2. Molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1, que comprende ADN que codifica un polipéptido PRO286 que tiene los residuos de aminoácidos 1 a 1041 de la figura 1 (SEC ID No. 3).

3. Molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que dicho ADN comprende las secuencias de nucleótidos que empiezan en la posición de nucleótidos 57 y que acaba en la posición 3179 de la figura 2 (la secuencia de SEC ID No. 4), o su complemento.

4. Vector que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

5. Vector de la reivindicación 4 unido operativamente con secuencias de control identificadas por una célula huésped transformada con el vector.

6. Célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 5.

7. Célula huésped de la reivindicación 6 en la que dicha célula es una célula CHO.

8. Célula huésped de la reivindicación 6 en la que dicha célula es un E. coli.

9. Célula huésped de la reivindicación 6 en la que dicha célula es una célula de levadura.

10. Procedimiento para producir un polipéptido que comprende cultivar la célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 bajo condiciones adecuadas para la expresión de un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y recuperar dicho polipéptido.

11. Polipéptido aislado que tiene por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en la figura 1 (SEC ID N.º: 3), en el que el polipéptido tiene la capacidad para inducir la activación de NF-KB.

12. Polipéptido de la reivindicación 11 que tiene los residuos de aminoácidos 1 a 1041 de la figura 1 (SEC ID N.º: 3).

13. Polipéptido de la reivindicación 11 que tiene los residuos de aminoácidos 27 a 825 de la figura 1 (SEC ID N.º: 3).

14. Polipéptido de la reivindicación 11, en el que el polipéptido es codificado por la secuencia de nucleótidos que empieza en la posición de nucleótidos 57 y que acaba en la posición 3179 de la figura 2 (SEC ID No. 4).

15. Molécula quimérica que comprende un polipéptido PRO286 de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, fusionado a una secuencia de aminoácidos heteróloga.

16. Molécula quimérica de la reivindicación 15, en la que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una secuencia de epítopo etiqueta.

17. Molécula quimérica de la reivindicación 15, en la que dicha secuencia de aminoácidos heteróloga es una región Fc de una inmunoglobulina.

18. Anticuerpo que es capaz de unirse específicamente a un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1 (SEC ID N.º: 3).

19. Anticuerpo de la reivindicación 18, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

20. Anticuerpo de la reivindicación 19 capaz de bloquear el reconocimiento de un organismo gramnegativo o grampositivo mediante dicho polipéptido.

21. Anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 para uso terapéutico.

22. Uso del anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 para la preparación de un medicamento para el tratamiento del choque septicémico.

23. Composición que comprende un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 mezclado con un portador farmacéuticamente aceptable.