Hibridación genómica comparativa.

Un método para comparar al menos un cromosoma o parte del mismo de una célula con un primer cariotipo con el cromosoma correspondiente o parte del mismo de una célula con un segundo cariotipo, incluyendo el método las etapas de:

(a) amplificar aleatoriamente ADN de un cromosoma aislado o parte de un cromosoma aislado;

(b) agotar secuencias repetitivas y/o agotar secuencias del ADN amplificado que están sobrerrepresentadas debido a la amplificación aleatoria, produciéndose el agotamiento antes y/o después de la amplificación;

(c) unir el ADN amplificado con un sustrato sólido;

(d) amplificar ADN de una o más células con un primer cariotipo y amplificar ADN de una o más células con un segundo cariotipo;

(e) marcar el ADN amplificado de la o las células con un primer cariotipo con un primer marcador, y marcar el ADN amplificado de la o las células con un segundo cariotipo con un segundo marcador, donde el primer y segundo marcadores son detectablemente diferentes;

(f) hibridar el ADN amplificado y marcado de la o las células con un primer cariotipo con el ADN amplificado unido al sustrato sólido, e hibridar el ADN amplificado y marcado de la o las células con un segundo cariotipo con el ADN amplificado unido al sustrato sólido; y

(g) comparar la cantidad relativa de los primer y segundo marcadores hibridados con el ADN amplificado unidos al sustrato sólido;

donde la o las células con un primer cariotipo y la o las células con un segundo cariotipo no son una o más células embrionarias humanas, una o más células germinales humanas, uno o más oocitos humanos o uno o más cuerpos polares humanos.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/AU2004/000429.

Solicitante: ADELAIDE RESEARCH & INNOVATION PTY LTD.

Nacionalidad solicitante: Australia.

Dirección: Level 14, 115 Grenfell Street Adelaide, SA 5000 AUSTRALIA.

Inventor/es: HUSSEY,NICOLE DOMINIQUE, HU,DONG GUI.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/574 (para el cáncer)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/52 (Utilización de compuestos o de composiciones para investigaciones colorimétricas, espectrofotométricas o fluorométricas, p. ej. utilización de cintas de papel indicador)

PDF original: ES-2518317_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Hibridación genómica comparativa Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos de hibridación genómica comparativa. También se describen ácidos nucleicos unidos con un sustrato sólido adecuado para hibridación genómica comparativa.

Antecedentes de la invención

Las anomalías cromosómicas se asocian con frecuencia con trastornos genéticos, enfermedades degenerativas y cáncer. Las anomalías cromosómicas pueden ser de varios tipos, incluyendo cromosomas individuales extras o ausentes, partes extras o ausentes de un cromosoma, roturas y reordenamientos cromosómicos. Los reordenamientos cromosómicos incluyen translocaciones (transferencia de un trozo de un cromosoma a otro cromosoma), dicéntricos (cromosomas con dos centrómeros), inversiones (reversión de la polaridad de un segmento cromosómico), inserciones, amplificaciones y deleciones.

La detección de anomalías cromosómicas en células es importante por muchas razones, sin ser la menor la detección de anomalías cromosómicas para el diagnóstico genético prenatal y preimplantación, y la determinación del cariotipo de algunos cánceres.

El diagnóstico prenatal implica el ensayo genético de material fetal. Típicamente, esto implica la retirada de líquido amniótico que rodea al feto y el análisis de células en el líquido con respecto a anomalías cromosómicas. El diagnóstico prenatal es importante para la detección de fetos que tienen errores cromosómicos significativos. Se producen anomalías cromosómicas detectables con una frecuencia de aproximadamente uno de cada 25 nacimientos humanos, y las anomalías que implican deleciones o adiciones de material cromosómico con frecuencia conducen a muerte fetal o a graves defectos mentales y físicos. Por ejemplo, el Síndrome de Down puede estar provocado por tener tres copias del cromosoma 21 en lugar de las dos copias normales, o por una duplicación segmental de una subregión en el cromosoma 21.

El diagnóstico genético preimplantación (PGD) implica el ensayo de material genético de un embrión o un óvulo (oocito) antes de la implantación. Típicamente, este proceso implica la retirada y análisis de una o más células de un embrión fertilizado in vitro, para determinar si el embrión es adecuado para implantación. En el caso de anomalías cromosómicas derivadas por línea materna, el cuerpo polar de un oocito también puede retirarse y detectarse la presencia de una anomalía cromosómica.

El diagnóstico genético preimplantación con respecto a anomalías cromosómicas es importante para detectar embriones y oocitos que son adecuados para su implantación. Los embriones humanos tempranos tienen una frecuencia muy alta de errores cromosómicos incluyendo aneuploidía, poliploidía y mosaicismo, y es probable que estos errores cromosómicos sean responsables de la tasa significativa de fracaso de implantación de embriones fertilizados in vitro. Además, cuando existe la posibilidad de que un embrión u oocito pueda contener una anomalía cromosómica conocida heredada de uno de los padres, también puede realizarse diagnóstico preimplantación para seleccionar embriones u oocitos que no tengan la anomalía cromosómica conocida.

La deleción o multiplicación de copias de cromosomas completos o segmentos cromosómicos también se produce con frecuencia en células cancerosas y en muchos casos estas anomalías cromosómicas contribuyen a que las células adquieran un fenotipo canceroso. La detección de dichas anomalías cromosómicas no es solamente importante para entender la base genética de cómo algunas células progresan desde un estado no canceroso a un estado canceroso, sino que en algunos casos pueden proporcionar información útil con respecto al diagnóstico y tratamiento de un cáncer específico.

Tradicionalmente, se han usado técnicas citogenéticas o de hibridación de fluorescencia in situ (FISH) para detectar anomalías cromosómicas. Sin embargo, la hibridación genómica comparativa (CGH) proporciona ahora un método potente para superar muchas de las limitaciones de los enfoques citogenéticos y de FISH tradicionales. La CGH implica la hibridación comparativa, multicolor de una población de ácidos nucleicos de referencia marcada en un color fluorescente y una población de ácidos nucleicos de muestra marcada en un segundo color fluorescente para todo o parte de un genoma de referencia, tal como una extensión cromosómica de metafase humana. La comparación de la intensidad de fluorescencia resultante en localizaciones en el genoma de referencia permite la determinación del número de copias de secuencias cromosómicas en la población de muestras.

Aunque la CGH ha proporcionado una mejora sobre las tecnologías citogenéticas y FISH tradicionales, aún hay muchas deficiencias asociadas con la CGH, incluyendo el periodo de tiempo requerido para realizar el análisis. Por ejemplo, la CGH convencional con extensiones de metafase tarda al menos 72 horas en completarse, y si se realiza PGD en una única célula tomada de un embrión, entonces debe realizarse crioconservación del embrión antes de la implantación para permitir el tiempo suficiente para completar el procedimiento.

La presente invención se refiere a la identificación de un método mejorado para realizar hibridación genómica comparativa. También se describen en el presente documento matrices de ácidos nucleicos adecuadas para hibridación genómica comparativa.

A lo largo de la presente memoria descriptiva se puede hacer referencia a documentos con el fin de describir diversos aspectos de la invención. Sin embargo, no se realiza ninguna admisión de que ninguna referencia citada en la presente memoria descriptiva constituya técnica anterior. En particular, se entenderá que la referencia a cualquier documento en el presente documento no constituye una admisión de que ninguno de estos documentos forma parte del conocimiento general habitual en la técnica en Australia o en ningún otro país. El análisis de las referencias indica lo que afirman sus autores, y el solicitante se reserva el derecho a poner en duda la precisión y pertinencia de cualquiera de los documentos citados en el presente documento.

Fiegler et al (Genes Chromosomes Cáncer. Abr. 23; 36(4): 361-74) describe el uso de DOP-PCR en la amplificación de clones de inserto grandes durante la construcción de matrices de CGH. Sin embargo, D2 no aborda el agotamiento de secuencias repetitivas y/o secuencias que están sobrerrepresentadas debido a la amplificación en la construcción de dichas matrices.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un método para comparar al menos un cromosoma o parte del mismo de una célula con un primer cariotipo con el cromosoma correspondiente o parte del mismo de una célula con un segundo cariotipo, incluyendo el método las etapas de:

(a) amplificar aleatoriamente ADN de un cromosoma aislado o parte de un cromosoma aislado;

(b) agotar las secuencias repetitivas y/o agotar secuencias del ADN amplificado que están sobrerrepresentadas debido a la amplificación aleatoria, produciéndose el agotamiento antes y/o después de la amplificación;

(c) unir el ADN amplificado con un sustrato sólido;

(d) amplificar el ADN de una o más células con un primer cariotipo y amplificar el ADN de una o más células con un segundo cariotipo;

(e) marcar el ADN amplificado de la o las células con un primer cariotipo con un primer marcador, y marcar el ADN amplificado de la o las células con un segundo cariotipo con un segundo marcador, donde el primer y segundo marcadores son detectablemente diferentes;

(f) hibridar el ADN amplificado y marcado de la o las células con un primer cariotipo con el ADN amplificado... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para comparar al menos un cromosoma o parte del mismo de una célula con un primer cariotipo con el cromosoma correspondiente o parte del mismo de una célula con un segundo cariotipo, incluyendo el método las etapas de:

(a) amplificar aleatoriamente ADN de un cromosoma aislado o parte de un cromosoma aislado;

(b) agotar secuencias repetitivas y/o agotar secuencias del ADN amplificado que están sobrerrepresentadas debido a la amplificación aleatoria, produciéndose el agotamiento antes y/o después de la amplificación;

(c) unir el ADN amplificado con un sustrato sólido;

(d) amplificar ADN de una o más células con un primer cariotipo y amplificar ADN de una o más células con un segundo cariotipo;

(e) marcar el ADN amplificado de la o las células con un primer cariotipo con un primer marcador, y marcar el ADN amplificado de la o las células con un segundo cariotipo con un segundo marcador, donde el primer y segundo marcadores son detectablemente diferentes;

(f) hibridar el ADN amplificado y marcado de la o las células con un primer cariotipo con el ADN amplificado unido al sustrato sólido, e hibridar el ADN amplificado y marcado de la o las células con un segundo cariotipo con el ADN amplificado unido al sustrato sólido; y

(g) comparar la cantidad relativa de los primer y segundo marcadores hibrldados con el ADN amplificado unidos al sustrato sólido;

donde la o las células con un primer cariotipo y la o las células con un segundo cariotipo no son una o más células embrionarias humanas, una o más células germinales humanas, uno o más oocltos humanos o uno o más cuerpos polares humanos.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el método se usa para detectar una anomalía cromosómlca en la célula con un primer cariotipo, para el diagnóstico prenatal de un feto donde la célula con un primer cariotipo es una célula fetal, o para la determinación del cariotipo de una célula cancerosa donde la célula con el primer cariotipo es una célula cancerosa aislada de un sujeto por blopsla o aislada de la sangre.

3. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, donde la amplificación de ADN de una o más células con un primer cariotipo y la amplificación de ADN de una o más células con un segundo cariotipo es amplificación con cebadores aleatorios.

4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el ADN amplificado de una o más células con un primer cariotipo es ADN amplificado de 1 o menos células.

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el ADN amplificado de una o más células con un primer cariotipo es ADN amplificado de 1 a 2 células.

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el ADN amplificado de una o más células con un primer cariotipo es ADN amplificado de una única célula.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el mareaje del ADN amplificado de la o las células con un primer cariotipo se realiza durante o como parte de la amplificación del ADN de la o las células con un primer cariotipo.

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, donde la amplificación aleatoria de ADN de la o las células con un primer cariotipo es amplificación directa de ADN extraído de las células.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, donde la lisis de las células con un primer cariotipo y la amplificación aleatoria de ADN resultante de la lisis se producen en el mismo tubo.

1. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, donde el método incluye la etapa de realizar un ciclo adicional de amplificación aleatoria de ADN amplificado aleatoriamente de las células con un primer cariotipo y el mareaje del ADN con un primer marcador se produce simultáneamente con y/o después del ciclo adicional de amplificación aleatoria.

11. Un método de diagnóstico genético pre-implantación de un embrión o un ooclto, Incluyendo el método las etapas de:

(a) amplificar aleatoriamente ADN de un cromosoma aislado o parte de un cromosoma aislado;

(b) agotar secuencias repetitivas y/o agotar secuencias del ADN amplificado que están sobrerrepresentadas debido a la amplificación aleatoria, produciéndose el agotamiento antes y/o después de la amplificación;

(c) unir el ADN amplificado con un sustrato sólido;

(d) amplificar aleatoriamente ADN de una o más células embrionarias obtenidas de un embrión en el estadio de 6-8 células o después, o un cuerpo polar de oocito con un cariotipo desconocido y amplificar ADN de una o más

células con un carlotlpo de referencia;

(e) marcar el ADN amplificado de la o las células embrionarias, o un cuerpo polar de un ooclto con un cariotipo desconocido con un primer marcador, y marcar el ADN amplificado de una o más células con un cariotipo de referencia con un segundo marcador, donde el primer y segundo marcadores son detectablemente diferentes;

(f) hibridar el ADN amplificado y marcado de la o las células con un cariotipo desconocido con el ADN amplificado unido al sustrato sólido, e hibridar el ADN amplificado y marcado de la o las células con un cariotipo de referencia con el ADN amplificado unido al sustrato sólido;

(g) detectar la presencia de una anomalía cromosómica en la o las células con el cariotipo desconocido comparando la cantidad relativa del primer marcador hibridado con el ADN amplificado unido al sustrato sólido con la cantidad de un segundo marcador hibridado con el ADN amplificado unido al sustrato sólido; y

(h) determinar la idoneidad del embrión o el oocito para implantación por ausencia de una anomalía cromosómica.

12. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 2 u 11, donde la anomalía cromosómica se selecciona del grupo que consiste en un cromosoma individual extra o ausente, una parte de un cromosoma extra o ausente, una rotura cromosómica, una reordenación cromosómica, una translocación, un cromosoma dicéntrico, una inversión, una amplificación de una región cromosómica, una deleción y una mutación puntual.

13. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde la parte de un cromosoma aislado es un fragmento clonado de un cromosoma.

14. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde las secuencias repetitivas incluyen secuencias de Cot-1, ADN repetido sencillo, repeticiones satélite, repeticiones mini-satélite, repeticiones específicas de cromosoma, repeticiones micro-satélite, genes repetidos, secuencias derivadas de elementos transponibles, elementos derivados de múltiples copias de virus tales como retrovirus, repeticiones asociadas con centrómeros o telómeros y repeticiones asociadas con heterocromatina.