HAPTENOS, INMUNÓGENOS Y ANTICUERPOS CONTRA OXICODONA Y SUS METABOLITOS.

Un compuesto de fórmula: **(Ver fórmula)**en la que R es un alquilo divalente,

cicloalquilo o un grupo arilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, y X es un grupo funcional seleccionado entre ácido carboxílico, maleimido, ditiopiridilo, tioacetilo, amino y aldehído

Campo de la invención[0001] La presente invención se refiere a nuevos derivados de hapteno de oxicodona, y a su uso en la preparación de inmunógenos.

Antecedentes de la invención [0002] Las reacciones de unión específica, tales como las reacciones anticuerpo-antígeno, se han venido utilizando extensivamente en inmunoensayos para detectar y/o cuantificar diversos fármacos u otros compuestos de interés en fluidos biológicos. Dichos inmunoensayos se han desarrollado para determinar antígenos como proteínas, así como moléculas pequeñas (haptenos).[0003] Los haptenos son por definición moléculas demasiado pequeñas como para estimular la producción de anticuerpos cuando se administran a un animal; es decir, los haptenos por sí mismos no son inmunogénicos. No obstante, se sabe perfectamente que un hapteno puede hacerse inmunogénico al conjugarse con un material vehículo apropiado, que provocará una respuesta inmunogénica cuando se inyecta en un animal huésped.[0004] Los opiáceos constituyen una clase de alcaloides producidos por plantas de la familia de las amapolas. Los opiáceos más comunes producidos por las plantas amapolas son morfina y codeína. Dichos opiáceos se han utilizado durante siglos para prevenir el dolor, pero su uso continuado conduce a la adicción. Los análogos sintéticos de la morfina presentan también las propiedades narcóticas y adictivas de los opiáceos naturales y entre ellos se incluyen heroína, hidromorfina, hidrocodona, oxicodona y oximorfona. Dichos opiáceos (naturales o sintéticos) tienen estructuras químicas íntimamente relacionadas. El uso ilícito de opiáceos ha supuesto un requerimiento médico de anticuerpos específicos para cada opiáceo, para su uso en diagnóstico con el fin de detectar rápidamente el opiáceo correspondiente y sus metabolitos para vigilar y tratar la adicción a los opiáceos.[0005] La oxicodona es un agente para eliminar el dolor analgésico y narcótico, y como derivado semi-sintético de la morfina puede ser muy adictivo. Los metabolitos de oxicodona son noroxicodona y oximorfona.[0006] Hasta la fecha, la determinación de oxicodona y sus metabolitos en los fluidos biológicos se ha basado principalmente en cromatografía de gases-espectrometría de masa (GC-MS) y cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC). Dichos métodos cromatográficos proporcionan una excelente sensibilidad y selectividad, pero requieren derivatización de oxicodona y sus metabolitos. Estos métodos resultan además demasiado costosos y consumen mucho tiempo para su uso como herramientas de detección selectiva.[0007] Los radioinmunoensayos son muy sensibles, pero requieren trazadores de radionuclido, por ejemplo 125I y 3H, y en algunos casos, una etapa de extracción preliminar. No se conocen RIAs para oxicodona.[0008] Los ensayos por inmunoabsorción ligados a enzima (ELISAs) constituyen una alternativa no radiactiva, que se podría utilizar para la determinación cuantitativa y cualitativa de oxicodona y sus metabolitos. También en este caso, no se conocen ELISAs para oxicodona.[0009] Existe la necesidad de contar con conjugados de oxicodona y su aplicación en inmunoensayos para cuantificar oxocodona y sus metabolitos sin una reactividad cruzada con la familia de los opiáceos en los fluidos biológicos.[0010] Findlay y cols., Clinical Chemistry, vol. 27, Nº 9, páginas 1524-1535 (1981) describe un hapteno de oxicodona 3modificado y su uso en la preparación de un inmunógeno correspondiente.[0011] En WO 93/20079 se describen derivados opiáceos que se sintetizan para unión covalente con antígenos, para la preparación de anticuerpos o receptores para los opiáceos y metabolitos de opiáceos.

Compendio de la invención[0012] De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, los nuevos derivados de oxicodona, que implican la

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en la que R es un alquilo divalente, cicloalquilo o un grupo arilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, y X es un grupo funcional seleccionado entre ácido carboxílico, maleimido, ditiopiridilo, tioacetilo, amino y aldehído.[0013] Se puede utilizar el grupo X funcional para acoplar los haptenos con los materiales de vehículo para la preparación de los inmunógenos correspondientes. Los inmunógenos resultantes se administran a huéspedes mamíferos para provocar la producción de anticuerpos específicos avid, que se utilizan después para desarrollar inmunoensayos sensibles para la detección de oxicodona y sus metabolitos sin presentar reactividad cruzada con otros opiáceos como morfina, codeína y heroína.[0014] De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, por tanto, los inmunógenos comprenden haptenos con arreglo a la presente invención, acoplados con un material vehículo que confiere antigenicidad.[0015] De acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención, se desarrollan nuevos anticuerpos contra los inmunógenos de la presente invención, siendo capaces los anticuerpos de unirse con al menos un epítopo estructural de oxicodona y sus metabolitos.[0016] En otro aspecto más, los conjugados de la presente invención comprenden haptenos de la presente invención unidos covalentemente a un agente de etiquetado detectable.[0017] En otro aspecto más de la presente invención, se proporciona un método para detectar o determinar oxicodona y sus metabolitos noroxicodona y oximorfona sin reactividad cruzada con otros opiáceos en una muestra. El método comprende el contacto de la mezcla con un conjugado de la presente invención y con un anticuerpo de la presente invención, o una mezcla de los mismos; la detección o determinación del conjugado unido y la deducción desde una curva de calibración de la presencia o la cantidad de oxicodona y sus metabolitos.[0018] En otro aspecto más, se proporciona un equipo para detectar o determinar oxicodona y sus metabolitos; el equipo incluye un conjugado de la presente invención y un anticuerpo de la presente invención. El equipo puede incluir opcionalmente instrucciones para el uso del conjugado y el anticuerpo para detectar o determinar oxicodona y sus metabolitos en una muestra. Preferiblemente, la muestra es una solución, como por ejemplo un fluido biológico. Más preferiblemente, la muestra es suero u orina.

Descripción de los modos de realización preferibles[0019] La presente invención se refiere a la preparación de los primeros derivados de hapteno de oxicodona. Dichos haptenos se emplean en la preparación de inmunógenos acoplándolos con materiales vehículo inmunogénicos modificados o sin modificar. Los inmunógenos obtenidos se administran después a huéspedes mamíferos para provocar la producción de anticuerpos específicos, que se utilizan después para desarrollar inmunoensayos competitivos para oxicodona y sus metabolitos, empleando agentes de etiquetado con hapteno como conjugados (reactivos de detección).[0020] En los compuestos de la invención, R es preferiblemente alquileno de C1-C3, X es preferiblemente ácido carboxílico.

Preparación de haptenos[0021] Los haptenos de la invención se pueden preparar a través de procedimientos conocidos entre las personas especializadas en este campo. El modo de realización que se expone a continuación se puede modificar según sea necesario para preparar otros compuestos de la invención.[0022] El hapteno B se puede preparar en tres etapas, con arreglo al siguiente esquema:

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La síntesis expuesta parte de la sustancia no controlada naloxona 1. La reacción de naloxona 1 (base libre) con yoduro de metilo, en dimetilformamida (DMF) en presencia 5 de carbonato potásico, da N-alil noroxicodona 2. La noroxicodona funcionalizada con éster 3 se prepara por

reación de 3-mercaptopropionato de etilo (éster carboxíclico funcionalizado con tiol) con el enlace doble localizado en Nalil noroxicodona 2 en presencia de 2,2'azobisisobutironitrilo (AIBN) como fuente de radicales libres de iniciación, en un disolvente clorado por calentamiento a reflujo. Se saponifica la N-[S(carboetoxietil)tioetil]noroxicodona 3 en condiciones alcalinas utilizando hidróxido potásico en una mezcla de tetrahidrofurano/agua para dar hapteno B en un buen rendimiento.

Preparación de inmunógenos y conjugados[0024] Si bien los haptenos de la presente invención proporcionan epítopos estructurales definidos, no son por sí mismos inmunogénicos y, por lo tanto, necesitan ser conjugados con materiales de vehículo que provoquen la respuesta inmunogénica cuando se administran al animal huésped. Cada hapteno de la presente invención se puede copular también con un agente de etiquetado, como por ejemplo una enzima, una sustancia que tenga propiedades fluorescentes

o una...

1. Un compuesto de fórmula:

**(Ver fórmula)**

5 en la que R es un alquilo divalente, cicloalquilo o un grupo arilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, y X es un grupo funcional seleccionado entre ácido carboxílico, maleimido, ditiopiridilo, tioacetilo, amino y aldehído.

2. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que R es alquileno de C1-C3.

3. Un compuesto según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que X es ácido carboxílico.

4. Un compuesto según la reivindicación 1, que es N-[S(carboxietil)tiopropil]noroxicodona.

5. Un inmunógeno que comprende un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, acoplado a un vehículo antigénico.

5 6. Un anticuerpo desarrollado contra un inmunógeno según la reivindicación 5, y capaz de unirse con al menos un epítopo de oxicodona y sus metabolitos.

7. Un anticuerpo según la reivindicación 6, desarrollado contra un inmunógeno según la reivindicación 5, comprendiendo el inmunógeno un compuesto según la reivindicación 4 acoplado a un vehículo antígeno y siendo el anticuerpo capaz de unirse con al menos un epítopo de oxicodona, noroxicodona e hidrocodona.

8. Un conjugado que comprende un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 unido covalentemente a una etiqueta detectable.

9. Un equipo para determinar la presencia o cantidad de oxicodona y sus metabolitos que incluye un conjugado según la reivindicación 8 y un anticuerpo según la reivindicación 6 o la reivindicación 7.