HAPTENOS E INMUNOREACTIVOS Y SU USO EN LA OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS DE FAMILIA E INMUNOENSAYOS PARA QUINOLONAS.
Haptenos e inmunoreactivos y su uso en la obtención de anticuerpos de familia e inmunoensayos para quinolanas.
La presente invención se refiere a haptenos, inmunógenos e inmunoreactivos secundarios, su uso para la obtención de anticuerpos de amplio espectro contra los antibióticos de tipo quinolona, su aplicación en técnicas inmunoquímicas de análisis y a un kit que permite la detección de dichos antibióticos en muestras biológicas procedentes de productos alimentarios de origen animal.
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201031721.
Solicitante: CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (CSIC).
Nacionalidad solicitante: España.
Inventor/es: SANCHEZ BAEZA, FRANCISCO JOSE, GONZALEZ PINACHO,DANIEL, MARCO COLAS,Mª PILAR.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07D215/233 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07D COMPUESTOS HETEROCICLICOS (Compuestos macromoleculares C08). › C07D 215/00 Compuestos heterocíclicos que contienen quinoleína o quinoleína hidrogenada en el sistema cíclico. › un solo átomo de oxígeno que está unido en posición 4.
- G01N33/53 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.
PDF original: ES-2383857_A1.pdf
Fragmento de la descripción:
Haptenos e inmunoreactivos y su uso en la obtención de anticuerpos de familia e inmunoensayos para quinolonas La presente invención se refiere a haptenos, inmunógenos e inmunoreactivos secundarios, su uso para la obtención de anticuerpos de amplio espectro contra los antibióticos de tipo quinolona y su aplicación en técnicas inmunoquímicas de análisis de dichos antibióticos en muestras biológicas.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La calidad nutricional de los alimentos, su disponibilidad y su seguridad son un elemento clave para el bienestar de la sociedad. La necesidad de aumentar la productividad animal ha originado el empleo, en ocasiones inapropiado, de fármacos veterinarios.
Más en concreto, los antibióticos de tipo quinolona se utilizan con fines terapéuticos, pero también profilácticos con el fin de prevenir enfermedades en explotaciones con elevada densidad de estabulación. De esta manera se incita el desarrollo de mecanismos de resistencia bacteriana, reduciendo drásticamente la eficacia del tratamiento, cuando dichas bacterias son el origen de enfermedades en humanos.
Por esta razón, la Agencia Europea para la Evaluación de los Productos Médicos (EMEA) , en la Directiva sobre el campo de la seguridad alimentaria 2377/90/CE, ha establecido límites máximos de residuos (MRLs, maximum residue limit) en los distintos productos alimenticios de origen animal. También ha impuesto a los laboratorios de inspección una serie de pautas de frecuencia de muestreo y número de sustancias a controlar antes de que estos productos lleguen al consumidor (Directiva 96/23/CE) . Esto genera la necesidad de efectuar un número elevado de análisis.
Las técnicas actualmente utilizadas para la detección de quinolonas son principalmente la cromatografía de gases acoplada a espectrómetro de masas (CG-MS) y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con diversos tipos de detección (principalmente ultravioleta y espectrometría de masas) (Hernández-Arteseros, J. Chromatography A. 2002, 945, 1-24.) . El principal inconveniente de estas técnicas es que precisan de una instrumentación compleja y personal cualificado, además de necesitar una preparación previa de la muestra, lo que prolonga el tiempo de análisis.
También se emplean ensayos de tipo microbiológico que, aunque de menor coste, la demora en la obtención de los resultados unida a su propia metodología, los convierte en inviables como métodos rápidos de alarma. Por lo tanto, los actuales métodos de análisis y preparación de muestra no responden adecuadamente a los requerimientos que la legislación exige para proteger la salud pública. Los procedimientos inmunoquímicos ofrecen importantes ventajas como procedimientos de cribado debido a su simplicidad, coste y elevadas capacidades de procesado.
Ya se han descrito diversos inmunoensayos genéricos para las quinolonas en la bibliografía. En todos los casos, el hapteno de inmunización era una quinolona comercial unida a una proteína inmunogénica mediante el ácido carboxílico en la posición 3 (Holtzapple, Food and Agric. Immunol. 1997, 9, 13-26; Bucknall, Food Additives and Contaminants. 2003, 20, 221-228; Wang, Anal. Chem. 2007, 79, 4471-4483) o mediante el resto de piperacina en la posición 7 (Huet, J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 2822-2827) , bloqueando de esta forma epítopos comunes e importantes de la familia de las quinolonas.
La técnica anterior no aborda el método de unir el hapteno de quinolona al soporte inmunogénico a través de la posición 1. De esta manera, los haptenos conservarían todos los epítopos característicos de las quinolonas, maximizando su exposición al sistema inmune del animal huésped y manteniendo a su vez intactas las propiedades ácido base de este tipo de compuestos.
La presente invención proporciona dichos haptenos y los inmunoreactivos derivados de estos, que son útiles en la obtención de anticuerpos de familia mejorados contra quinolonas y que proporcionan mejores prestaciones cuando se utilizan en inmunoensayos para la detección de quinolonas.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un conjunto de haptenos estructuralmente relacionados, desde un punto de vista químico, con los antibióticos de tipo quinolona. De igual modo se refiere a los inmunoreactivos resultantes de la unión de dichos haptenos a soportes inmunogénicos y al uso de estos en la obtención de anticuerpos con selectividad de clase para la familia de las quinolonas. A su vez se refiere a la utilización de alguno de dichos inmunoreactivos, a modo de inmunoreactivos secundarios, y de algún anticuerpo generado a partir de alguno de ellos, en métodos inmunoquímicos de análisis de quinolonas en muestras biológicas.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) :
OO
F
R1
N
R3
R2
(I)
R2 se selecciona entre H, alquilo C3-C10, - (CH2) m-R5R6, donde m es un valor de 3 a 6 cuando R5 se selecciona entre, O ó NH o m es un valor de 1 a 6 cuando R5 es S y R6 se selecciona entre H, alquilo C1-C6, arilo, alquil-arilo, R4 o LR4, donde L es un compuesto de unión bifuncional; R3 se selecciona entre heterociclo, halógeno o NR7R8, donde R7 y R8, se seleccionan independientemente entre H, alquilo C1-C6, - (CH2) n-R9R10, donde n es un valor de 1 a 6, R9 se selecciona entre S, O ó NH y R10 se selecciona entre H 10 o alquilo C1-C6, arilo, alquil-arilo, R4 o LR4. Preferiblemente, R1 es O-alquilo C1-C6 y más preferiblemente O-etilo. Preferiblemente, R1 es OH. Preferiblemente, R1 es NHR4, donde R4 es una proteína y más preferiblemente R4 se selecciona entre albúmina de suero bovino (BSA) , concanavalina A (CONA) , ovalbúmina, peroxidasa de rábano picante (HRP) , hemocianina de lapa ojo de cerradura (KLH) o hemocianina de cangrejo herradura (HCH) . Preferiblemente, R2 es - (CH2) 3-SR6 donde R6 se selecciona entre H o LR4, L se selecciona entre maleimidopropanoato y iodoacetilo y R4 se selecciona entre BSA, CONA, HRP o HCH. Preferiblemente, R2 es alquilo C3-C6 y más preferiblemente, R2 es propilo. Preferiblemente, R3 se selecciona entre halógeno o heterociclo. Más preferiblemente, R3 se selecciona entre flúor o cloro. R11 Preferiblemente, R3 se selecciona entre el siguiente grupo: donde R11 es alquilo C1-C6 y preferiblemente metilo. Preferiblemente, R3 es NR7R8, donde R7 y R8 son un grupo alquilo C1-C6 igual o diferente. Más preferiblemente R7 y R8 son etilo. Preferiblemente, R3 es NR7R8, donde R7 es H y R8 es un grupo alquilo C1-C6 sustituido. Más preferiblemente, R3 es -NH (CH2) 2NH2. Preferiblemente, R3 es -NH (CH2) 2NHLR4, siendo L 2, 4-dicloro-1, 3, 5-triazina y R4 una proteína que se selecciona entre albúmina de suero bovino, concanavalina A, ovoalbúmina, peroxidasa de rábano picante, hemocianina de lapa ojo de cerradura o hemocianina de cangrejo herradura. Preferiblemente, el compuesto de fórmula (I) se selecciona del siguiente grupo: - 6, 7-difluoro-4-oxo-1-propil-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxilato de etilo. - 1- (3- (bencidriltio) propil) -7-cloro-6-fluoro-4-oxo-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxilato de etilo. - 1- (3- (bencidriltio) propil) -6, 7-difluoro-4-oxo-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxilato de etilo. - Ácido 6, 7-difluoro-4-oxo-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxílico. - Ácido 6, 7-difluoro-4-oxo-1-propil-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxílico. - Ácido 1- (3- (bencidriltio) propil) -6, 7-difluoro-4-oxo-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxílico. - Ácido 6-fluoro-7- (N-morfolinil) -4-oxo-1, 4 dihidroquinolina-3-carboxílico. - Ácido 6-fluoro-7- (N-morfolinil) -4-oxo-1-propil-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxílico. - Ácido 7- (2-aminoetilamino) -6-fluoro-4-oxo-1-propil-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxílico. - Ácido 7- (dietilamino) -6-fluoro-4-oxo-1-propil-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxílico. - Ácido 1- (3- (bencidriltio) propil) -6-fluoro-7- (N-morfolinil) -4-oxo-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxílico. - Ácido 1- (3- (bencidriltio) propil) -6-fluoro-4-oxo-7- (N-piperacinil) -1, 4-dihidroquinolina-3-carboxílico. - Ácido 6-fluoro-7- (4-metilpiperacin-1-il) -4-oxo-1-propil-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxílico. - Ácido 6-fluoro-1-... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Compuesto de fórmula (I) :
N
R2
(I)
donde R1 se selecciona entre OH, O-alquilo C1-C10, OR4, NHR4, donde R4 es un soporte inmunogénico; R2 se selecciona entre H, alquilo C3-C10, - (CH2) m-R5R6, donde m es un valor de 3 a 6 cuando R5 se selecciona entre O ó NH o m es un valor de 1 a 6 cuando R5 es S y R6 se selecciona entre H o alquilo C1-C6, arilo, alquil-arilo, R4 o LR4 donde L es un compuesto de unión bifuncional; 10 R3 se selecciona entre, heterociclo, halógeno o NR7R8, donde R7 y R8 se seleccionan independientemente entre H o alquilo C1-C6, - (CH2) n-R9R10, donde n es un valor de 1 a 6, R9 se selecciona entre S, O ó NH y R10 se selecciona entre H o alquilo C1-C6, arilo, alquil-arilo, R4 o LR4. 2. Compuesto según la reivindicación 1 donde R1 es O-alquilo C1-C6. 3. Compuesto según la reivindicación 2 donde R1 es O-etilo. 4. Compuesto según la reivindicación 1 donde R1 es OH. 5. Compuesto según la reivindicación 1 donde R1 es NHR4 siendo R4 es proteína que se selecciona entre albúmina de suero bovino, concanavalina A, ovalbúmina, peroxidasa de rábano picante, hemocianina de lapa ojo de cerradura o hemocianina de cangrejo herradura. 6. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde R2 es (CH2) 3-R5R6, donde R5 y R6 se definen 20 como en la reivindicación 1. 7. Compuesto según la reivindicación 6 donde R5 es S y R6 se selecciona entre H o LR4, siendo L maleimidopropanoato o iodoacetilo y R4 una proteína que se selecciona entre albúmina de suero bovino, concanavalina A, ovalbúmina, peroxidasa de rábano picante, hemocianina de lapa ojo de cerradura o hemocianina de cangrejo herradura. 8. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde R2 es alquilo C3-C6. 9. Compuesto según la reivindicación 8 donde R2 es propilo. 10. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde R3 se selecciona entre halógeno o heterociclo. 11. Compuesto según la reivindicación 10 donde R3 se selecciona entre fluor o cloro. 12. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde R3 se selecciona entre el siguiente grupo: R11 donde R11 es alquilo C1-C6 13. Compuesto según la reivindicación 12 donde R11 es metilo. 14. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde R3 es NR7R8, siendo R7 y R8 un grupo alquilo C1-C6 igual o diferente. 15. Compuesto según la reivindicación 14 donde R7 y R8 son etilo. 16. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde R3 es NR7R8, siendo R7 hidrógeno y R8 un grupo alquilo C1-C6 sustituido. 17. Compuesto según la reivindicación 16 donde R3 es -NH (CH2) 2NH2 18. Compuesto según la reivindicación 16 donde R3 es -NH (CH2) 2NHLR4, siendo L 2, 4-dicloro-1, 3, 5-triazina y R4 una proteína que se selecciona entre albúmina de suero bovino, concanavalina A, ovoalbúmina, peroxidasa de rábano picante, hemocianina de lapa ojo de cerradura o hemocianina de cangrejo herradura. 19. Compuesto de fórmula (I) que se selecciona del siguiente grupo: - 6, 7-difluoro-4-oxo-1-propil-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxilato de etilo. - 1- (3- (bencidriltio) propil) -7-cloro-6-fluoro-4-oxo-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxilato de etilo. - 1- (3- (bencidriltio) propil) -6, 7-difluoro-4-oxo-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxilato de etilo. - Ácido 6, 7-difluoro-4-oxo-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxílico. - Ácido 6, 7-difluoro-4-oxo-1-propil-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxílico. - Ácido 1- (3- (bencidriltio) propil) -6, 7-difluoro-4-oxo-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxílico. - Ácido 6-fluoro-7- (N-morfolinil) -4-oxo-1, 4 dihidroquinolina-3-carboxílico. - Ácido 6-fluoro-7- (N-morfolinil) -4-oxo-1-propil-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxílico. - Ácido 7- (2-aminoetilamino) -6-fluoro-4-oxo-1-propil-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxílico. - Ácido 7- (dietilamino) -6-fluoro-4-oxo-1-propil-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxílico. - Ácido 1- (3- (bencidriltio) propil) -6-fluoro-7- (N-morfolinil) -4-oxo-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxílico. - Ácido 1- (3- (bencidriltio) propil) -6-fluoro-4-oxo-7- (N-piperacinil) -1, 4-dihidroquinolina-3-carboxílico. - Ácido 6-fluoro-7- (4-metilpiperacin-1-il) -4-oxo-1-propil-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxílico. - Ácido 6-fluoro-1- (3-mercaptopropil) -7- (N-morfolinil) -4-oxo-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxílico. - Ácido 6-fluoro-1- (3-mercaptopropil) -4-oxo-7- (N-piperacinil) -1, 4-dihidroquinolina-3-carboxílico. - Ácido 1-[3- (2-acetamida de BSA) tiopropil]-6-fluoro-7- (N-morfolinil) -4-oxo-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxílico. - Ácido 1-[3- (2, 5-dioxo-1- (3- (carboxamida de BSA) propil) pirrolidin-3-iltio) propil]-6-fluoro-4-oxo-7- (N-piperacinil) 1, 4-dihidroquinolina-3-carboxílico. - Ácido 1-[3- (2-acetamida de HCH) tiopropil]-6-fluoro-7- (N-piperacinil) -4-oxo-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxílico. - Ácido 1-[3- (2-acetamida de BSA) tiopropil]-6-fluoro-7- (N-piperacinil) -4-oxo-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxílico - 6, 7-difluoro-4-oxo-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxamida de BSA. - 6, 7-difluoro-4-oxo-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxamida de CONA. - 6, 7-difluoro-1-propil-4-oxo-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxamida de BSA. - 6, 7-difluoro-1-propil-4-oxo-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxamida de CONA. - 6-fluoro-7- (N-morfolinil) -4-oxo-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxamida de BSA. - 6-fluoro-7- (N-morfolinil) -4-oxo-1-propil-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxamida de BSA. - Ácido 7-[2- (acetamida de BSA) etilamino]-6-fluoro-4-oxo-1-propil-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxílico. - 7- (dietilamino) -6-fluoro-4-oxo-1-propil-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxamida de BSA. - 7- (dietilamino) -6-fluoro-4-oxo-1-propil-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxamida de CONA. - 6-fluoro-7- (4-metilpiperacin-1-il) -4-oxo-1-propil-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxamida de BSA. - 6-fluoro-7- (4-metilpiperacin-1-il) -4-oxo-1-propil-1, 4-dihidroquinolina-3-carboxamida de CONA. - Ácido 7-[2- (4-cloro-6-HRP-1, 3, 5, -triazin-2-ilamino) etilamino]-6-fluoro-4-oxo-1-propil-1, 4-dihidroquinolina-3carboxílico o sus sales, isómeros o solvatos, 20. Uso de un compuesto de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 para la obtención de anticuerpos contra antibióticos del tipo quinolona. 21. Uso según la reivindicación 20 donde el antibiótico se selecciona entre marbofloxacino, enrofloxacino, norfloxacino, ciprofloxacino, sarafloxacino, ácido oxolínico, flumequina, ofloxacino, danofloxacino o difloxacino. 22. Procedimiento de obtención de anticuerpos contra antibióticos del tipo quinolonas que comprende: a) activación de un soporte inmunogénico utilizando un compuesto de unión bifuncional, b) conjugación del soporte inmunogénico activado en (a) con un compuesto de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, c) inmunización de un animal no humano con el conjugado obtenido en (b) , d) extracción de los anticuerpos generados en (c) . 23. Procedimiento según la reivindicación 22 donde el soporte inmunogénico se selecciona entre seroalbúmina bovina, ovoalbúmina, concanavalina A, peroxidasa de rábano picante, hemocianina de cangrejo herradura, hemocianina de lapa ojo de cerradura. 24. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 22 ó 23 donde la activación del soporte inmunogénico se realiza haciéndolo reaccionar con ésteres de succinimido o carbodiimidas. 25. Anticuerpo obtenible por el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24. 26. Uso de los anticuerpos según la reivindicación 25 para la detección y/o cuantificación de antibióticos tipo quinolona en una muestra biológica aislada. 27. Uso de un compuesto de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 como inmunoreactivo secundario para la detección y/o cuantificación de antibióticos tipo quinolona en una muestra biológica aislada. 28. Uso según la reivindicación 26 ó 27 donde la muestra biológica procede de un producto de origen animal destinado al consumo alimentario. 29. Uso según la reivindicación 28 donde el producto de origen animal es leche. 30. Kit para la detección y/o cuantificación de antibióticos tipo quinolona que comprende al menos un anticuerpo según la reivindicación 25 o un compuesto de fórmula (I) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19. 31. Uso del kit de detección según la reivindicación 30 para la determinación y/o cuantificación de antibióticos tipo quinolona en productos alimentarios de origen animal. o sus sales, isómeros o solvatos,
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