Haptenos, conjugados y anticuerpos para el fungicida pirimetanil.

Haptenos, conjugados y anticuerpos para el fungicida pirimetanil.

La presente invención se refiere a haptenos, conjugados, derivados marcados y anticuerpos para pirimetanil. Así mismo, la presente invención también se refiere al uso de conjugados de pirimetanil como antígenos de ensayo o inmunógenos para obtener anticuerpos de este fungicida; y al uso de los derivados marcados de pirimetanil como antígenos de ensayo. Además, la presente invención también se refiere a un método de análisis de pirimetanil utilizando los anticuerpos obtenidos, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son conjugados o derivados marcados. Esta invención también proporciona un kit para analizar pirimetanil que comprende anticuerpos de este fungicida, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son conjugados o derivados marcados.

Haptenos, conjugados y anticuerpos para el fungicida pirimetanil

La presente invención se refiere a haptenos, conjugados, derivados marcados y anticuerpos para pirimetanil. Además, la presente invención también se refiere a un método de análisis de pirimetanil utilizando los anticuerpos obtenidos, en ocasiones junto con antígenos de ensayo que son conjugados o derivados marcados.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Los fungicidas son el grupo de plaguicidas que con mayor frecuencia aparece en los programas de vigilancia y control. Esto es así no sólo por su elevado uso, sino principalmente porque estos productos de protección vegetal se emplean para combatir las infecciones causadas por hongos en momentos muy próximos a la cosecha o incluso con posterioridad (fungicidas postcosecha) . Este hecho incrementa considerablemente la probabilidad de que residuos de dichos tratamientos permanezcan cuando el alimento llegue al consumidor, lo que obliga a los organismos de regulación y control a estar más vigilantes e idealmente a aumentar los controles. Los ataques por hongos en frutos almacenados constituyen uno de los motivos principales de pérdidas económicas en agricultura. El uso intensivo de fungicidas convencionales,

como el tiabendazol o el imazalil, ha llevado en los últimos años a la aparición de cepas resistentes y por tanto a una menor eficacia de los tratamientos con estos productos. Ante esta circunstancia, las empresas agroquímicas pusieron en marcha programas de I+D encaminados a desarrollar nuevos productos que presentaran mecanismos de acción innovadores y que permitieran combatir de forma eficaz las infecciones fúngicas, al tiempo que fueran seguros y compatibles con los programas de gestión integrada de plagas. Estos productos están comenzando a sustituir progresivamente a los productos más antiguos, que resultan menos aceptables desde un punto de vista toxicológico y medioambiental.

Entre los fungicidas más relevantes desarrollados en la última década con aplicaciones en postcosecha destaca el pirimetanil [H.J. Rosslenbroich y D. Stuebler, Crop Prot. 2000, 19, 557−561]. Este plaguicida pertenece a la familia de las anilinopirimidinas cuyo modo bioquímico de acción es común a esta familia y diferente al del resto de fungicidas. El pirimetanil (4, 6-dimetil-Nfenilpirimidin-2-amina) es un producto desarrollado por AgrEvo y comercializado a nivel mundial por compañías como Bayer CropScience, BASF

o Janssen Pharmaceutical. En la actualidad las denominaciones comerciales más habituales son Scala y Penbotec, encontrándose también en forma de 10 formulaciones combinadas con una gran variedad de fungicidas diferentes, entre las que destacan Philabuster (con imazalil) y FlintStar (con trifloxistrobin) . Su utilización como fungicida postcosecha está autorizada tanto en cítricos como en frutas de hueso y pepita. El pirimetanil fue incluido en el anexo I de la UE en el 2006. Entre los cultivos para los que la UE ha establecido límites máximos de residuos de forma explícita se encuentran los cítricos (10 ppm) , frutas de hueso (3–10 ppm) , frutas de pepita (5 ppm) , uva y fresa (5 ppm) , además de en una gran variedad de vegetales y hortalizas.

Las metodologías analíticas empleadas para el análisis de estos fungicidas son fundamentalmente de tipo instrumental, en especial cromatografía de 20 gases (GC) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) , acopladas a diferentes detectores según el tipo de compuesto a analizar y la sensibilidad requerida. Estas técnicas se caracterizan por su capacidad para analizar simultáneamente varios residuos con una elevada precisión y exactitud. Sin embargo, pese a que resultan imprescindibles en muchas circunstancias, con 25 frecuencia implican la utilización de metodologías laboriosas y de elevado coste, que deben realizarse por personal altamente cualificado en laboratorios centralizados bien equipados y habitualmente alejados de las zonas de producción. Estas limitaciones condicionan la idoneidad de estas técnicas para acometer el análisis de grandes números de muestras y para obtener 30 resultados en breve plazo, dos aspectos que contribuirían a garantizar la seguridad de los alimentos comercializados y a la realización de estudios más exhaustivos sobre la exposición de los consumidores a estos fungicidas a través de los alimentos.

Los inmunoensayos son técnicas bioanalíticas basadas en la interacción de un antígeno (el analito) con un anticuerpo que lo reconoce específicamente. No 5 obstante, un plaguicida es una molécula orgánica pequeña que constituye un único sitio de unión al anticuerpo, por lo que en este tipo de técnicas analíticas la interacción entre el analito y el anticuerpo se realiza por desplazamiento de la unión entre el anticuerpo y un análogo marcado del analito. De este modo, en presencia del analito se establece una competencia entre éste y el análogo 10 marcado por la unión al anticuerpo. Habitualmente, el marcaje se realiza con una actividad enzimática, dando así lugar a los enzimoinmunoensayos. Cuando además uno de los participantes en la reacción se encuentra inmovilizado sobre un soporte sólido, la técnica se denomina ELISA (del inglés Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) . Los primeros inmunoensayos enzimáticos para 15 plaguicidas se desarrollaron durante la primera mitad de los años 80. Desde entonces hasta la actualidad el número de plaguicidas para los cuales se han desarrollado inmunoensayos ha aumentado espectacularmente, suponiendo varias decenas y cubriendo los principales grupos de compuestos: insecticidas, herbicidas y fungicidas. De hecho, un gran número de estos ensayos están 20 disponibles comercialmente en forma de kits con diferentes formatos. La creciente aceptación de los inmunoensayos como técnicas complementarias a las cromatográficas para el análisis de pequeñas moléculas orgánicas se debe a que se trata de una metodología sencilla, rápida y de bajo coste, exhibiendo al mismo tiempo una elevada sensibilidad y especificidad. Los inmunoensayos 25 permiten detectar específicamente el analito diana en mezclas muy complejas, simplificando considerablemente los laboriosos procedimientos de preparación de la muestra, lo que a su vez redunda en un aumento en la capacidad de muestreo. Además, los inmunoensayos pueden realizarse en formatos portátiles, lo que los independiza de los laboratorios centralizados y los 30 convierte en idóneos para el análisis en los puntos de producción. Las excelencias analíticas atribuidas a los inmunoensayos ya han sido demostradas en muchas aplicaciones prácticas, donde han competido favorablemente con las técnicas cromatográficas [M.C. Hennion, Analysis 1998, 26, 149–155; A. Abad et al., J. Chromatogr. A 1999, 833, 3–12; A. Abad et al., J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 1707–1712; N.A. Lee y I.R. Kennedy, J. AOAC

Int. 2001, 84, 1393–1406; F.A. Esteve-Turrillas et al., Anal. Chim. Acta 2010, 682, 93–103].

Sin embargo, hasta la fecha no se ha descrito la utilización de la tecnología de inmunoensayo para analizar el contenido del fungicida pirimetanil en una muestra.

Por lo tanto, existe una necesidad, en particular en la industria alimentaria y/o agrícola, de desarrollar un método analítico que permita la determinación o detección mediante la tecnología de inmunoensayo de pirimetanil, fungicida ampliamente utilizado en la actualidad, preferentemente mediante la utilización de un kit que comprenda al menos un anticuerpo de pirimetanil.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona haptenos de pirimetanil, compuestos de fórmula (I) , que presentan una funcionalización adecuada, en diferentes posiciones de la molécula, para la obtención de conjugados de pirimetanil o derivados marcados de pirimetanil.

Un primer aspecto de la presente invención describe un compuesto de fórmula general (I) :

T−L−Y

(I)

caracterizado porque 25 T se selecciona del grupo que consiste en R-I, R-II, R-III, R-IV y R-V;

HH N N NN

N

N R-I

R-II

HH NN

NN N

N R-III

R-IV

NN N

R-V

donde R-I se selecciona del grupo que consiste en [2- ( (4, 6-dimetilpirimidin-2il) amino) fenilo], [3- ( (4, 6-dimetilpirimidin-2-il) amino) fenilo] y [4- ( (4, 6dimetilpirimidin-2-il) amino) fenilo];

R-II es [4, 6-dimetil-2- (fenilamino) pirimidin-5-ilo]; R-III se selecciona del grupo que consiste en [2- ( (4-metilpirimidin-2il) amino) fenilo], [3- ( (4-metilpirimidin-2-il) amino) fenilo] y [4- ( (4-metilpirimidin-2il) amino) fenilo]; R-IV se selecciona del grupo que consiste en [6-metil-2- (fenilamino) pirimidin-4

ilo]... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto de fórmula (I) :

T−L−Y 5 (I)

caracterizado porque T se selecciona del grupo que consiste en R-I, R-II, R-III, R-IV y R-V;

HH N N NN

N N

R-I R-II

HH NN

NN N

N R-III

R-IV

NN N

R-V

donde R-I se selecciona del grupo que consiste en [2- ( (4, 6-dimetilpirimidin-2il) amino) fenilo], [3- ( (4, 6-dimetilpirimidin-2-il) amino) fenilo] y [4- ( (4, 6dimetilpirimidin-2-il) amino) fenilo];

R-II es [4, 6-dimetil-2- (fenilamino) pirimidin-5-ilo]; R-III se selecciona del grupo que consiste en [2- ( (4-metilpirimidin-2il) amino) fenilo], [3- ( (4-metilpirimidin-2-il) amino) fenilo] y [4- ( (4-metilpirimidin-2il) amino) fenilo]; R-IV se selecciona del grupo que consiste en [6-metil-2- (fenilamino) pirimidin-4

ilo] y [6-metil-2- (fenilamino) pirimidin-5-ilo]; y R-V es [N- (4, 6-dimetilpirimidin-2-il) -N- (fenil) amino]; L es una cadena hidrocarbonada de 2 a 40 átomos de carbono, donde la cadena es lineal o ramificada, saturada o insaturada, y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre 0 y 10 heteroátomos que se seleccionan del

grupo que consiste en S, O y N; Y es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en −COOH, −NH2, −N3, −CH2Br, −CH2I, −CHO, −SH, −SO3H, −OSO2Ph, −NH−NH2 y −OSO2Ar; con la condición de que:

a) cuando T es [4- ( (4, 6-dimetilpirimidin-2-il) amino) fenilo], -L-Y es diferente de −CH2CH2-NH2; b) cuando T es [4- ( (4, 6-dimetilpirimidin-2-il) amino) fenilo], -L-Y es diferente de −CONHCH2-CO2H; c) cuando T es [4- ( (4-metilpirimidin-2-il) amino) fenilo], -L-Y es diferente de 15 −CHCH3-CO2H; d) cuando T es [6-metil-2- (fenilamino) pirimidin-4-ilo], -L-Y es diferente de −OCH2-CO2H;

e) cuando T es [N- (4, 6-dimetilpirimidin-2-il) -N- (fenil) amino], L es una cadena hidrocarbonada de 2 a 40 átomos de carbono, lineal o 20 ramificada, saturada o insaturada, con la condición de que dicha cadena hidrocarbonada no comprende ningún heteroátomo; f) cuando T es [N- (4, 6-dimetilpirimidin-2-il) -N- (fenil) amino], -L-Y es diferente de - (CH2) 3-NH2.

2. Un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1, caracterizado porque 25 L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono.

3. Un compuesto de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque Y se selecciona del grupo que consiste en −COOH, −CHO, −NH2 y −SH.

4. Un compuesto de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 30 anteriores, caracterizado porque T es [3- ( (4, 6-dimetilpirimidin-2-il) amino) fenilo]

o [4- ( (4, 6-dimetilpirimidin-2-il) amino) fenilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 8 átomos de carbono; e Y se selecciona dentro del grupo que consiste en −COOH, −CHO, −NH2 y−SH.

5. Un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 4, caracterizado porque 5 se selecciona dentro del grupo que consiste en HH

NN

(CH2) 5CO2H N N N

N

(CH2) 5CO2H

y

6. Un compuesto de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1

a 3, caracterizado porque T es [6-metil-2- (fenilamino) pirimidin-4-ilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 8 átomos de carbono; e Y se selecciona dentro del grupo que consiste en −COOH, −CHO, −NH2 y −SH.

7. Un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 6, caracterizado porque es H

HO2C (H2C) 4

N N

N

8. Un compuesto de fórmula (I) según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque T es [N- (4, 6-dimetilpirimidin-2-il) -N- (fenil) amino]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 8 átomos de carbono; e Y se selecciona dentro del grupo que consiste en −COOH, −CHO, −NH2 y −SH.

9. Un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 8, caracterizado porque es (CH2) 4CO2H N N N

10. Un compuesto de fórmula (II) :

[T−L−Z]n−P

(II)

caracterizado porque 5 T se selecciona del grupo que consiste en R-I, R-II, R-III, R-IV y R-V;

HH NN

NN N

N R-I R-II

H H

NN

NN N

N R-III R-IV

NN

N R-V

donde R-I se selecciona del grupo que consiste en [2- ( (4, 6-dimetilpirimidin-2il) amino) fenilo], [3- ( (4, 6-dimetilpirimidin-2-il) amino) fenilo] y [4- ([ (4, 6

dimetilpirimidin-2-il) amino) fenilo]; R-II es [4, 6-dimetil-2- (fenilamino) pirimidin-5-ilo]; R-III se selecciona del grupo que consiste en [2- ( (4-metilpirimidin-2il) amino) fenilo], [3- ( (4-metilpirimidin-2-il) amino) fenilo] y [4- ( (4-metilpirimidin-2il) amino) fenilo];

R-IV se selecciona del grupo que consiste en [6-metil-2- (fenilamino) pirimidin-4ilo] y [6-metil-2- (fenilamino) pirimidin-5-ilo]; y R-V es [N- (4, 6-dimetilpirimidin-2-il) -N- (fenil) amino]; L es una cadena hidrocarbonada de 2 a 40 átomos de carbono, donde la cadena es lineal o ramificada, saturada o insaturada, y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre 0 y 10 heteroátomos que se seleccionan del grupo que consiste en S, O y N; Z es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en −CONH−, −NHCO−, −NHCONH−, −NHCSNH−, −OCONH−, −NHOCO−, −OCSNH−, −SCONH−, −S−, −S−S−, −NH (C=NH) −, −OCO−, −CO−, −CHOH−, −N=N−, −NH−, −NR−,

y

;

P es un polipéptido natural o sintético de peso molecular mayor de 2000 10 daltons; y

n es un número con un valor entre 1 y 500.

11. Un compuesto de fórmula (II) según la reivindicación 10, caracterizado porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono.

12. Un compuesto de fórmula (II) según una cualquiera de las reivindicaciones

10 o 11, caracterizado porque Z se selecciona del grupo que consiste en −CONH−, −NHCO−, −NH−, −S−,

y

.

13. Un compuesto de fórmula (II) según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, hemocianina, β-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa.

14. Un compuesto de fórmula (II) según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque T es [3- ( (4, 6-dimetilpirimidin-2-il) amino) fenilo] o [4- ( (4, 6-dimetilpirimidin-2il) amino) fenilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono;

Z se selecciona del grupo que consiste en −CONH−, −NHCO−, −NH−, −S−, y

; y

P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, hemocianina, β-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa.

15. Un compuesto de formula (II) según la reivindicación 14, caracterizado porque T es [3- ( (4, 6-dimetilpirimidin-2-il) amino) fenilo] o [4- ( (4, 6dimetilpirimidin-2-il) amino) fenilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 5

átomos de carbono; Z es −CONH−; P se selecciona del grupo que consiste en albúmina y peroxidasa; y n es un valor seleccionado entre 1 y 50.

16. Un compuesto de fórmula (II) según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque T es [6-metil-2- (fenilamino) pirimidin-4-ilo];

L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono; Z se selecciona del grupo que consiste en −CONH−, −NHCO−, −NH−, −S−, y

; y

P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, hemocianina, β-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa.

17. Un compuesto de formula (II) según la reivindicación 16, caracterizado porque T es [6-metil-2- (fenilamino) pirimidin-4-ilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 4 átomos de carbono; Z es −CONH−; P se selecciona del grupo que consiste en albúmina y peroxidasa; y n es un valor seleccionado entre 1 y 50.

18. Un compuesto de fórmula (II) según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque T es [N- (4, 6-dimetilpirimidin-2-il) -N- (fenil) amino];

L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono; Z se selecciona del grupo que consiste en −CONH−, −NHCO−, −NH−, −S−, y

; y

P se selecciona del grupo que consiste en albúmina, tiroglobulina, hemocianina, β-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa y oxidasa.

19. Un compuesto de formula (II) según la reivindicación 18, caracterizado porque T es [N- (4, 6-dimetilpirimidin-2-il) -N- (fenil) amino]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 4 átomos de carbono; Z es −CONH−; P se selecciona del grupo que consiste en albúmina y peroxidasa; y n es un valor seleccionado entre 1 y 50.

20. Un compuesto de fórmula (III) : [T−L−Z]m−Q

(III) caracterizado porque T se selecciona del grupo que consiste R-I, R-II, R-III, R-IV y R-V;

HH NN

NN N

N R-I R-II

HH NN

NN N

N R-III R-IV

NN N

R-V

donde R-I se selecciona del grupo que consiste en 2- ( (4, 6-dimetilpirimidin-2il) amino) fenilo], [3- ( (4, 6-dimetilpirimidin-2-il) amino) fenilo] y [4- ( (4, 6dimetilpirimidin-2-il) amino) fenilo];

R-II es [4, 6-dimetil-2- (fenilamino) pirimidin-5-ilo]; R-III se selecciona del grupo que consiste en [2- ( (4-metilpirimidin-2il) amino) fenilo], [3- ( (4-metilpirimidin-2-il) amino) fenilo] y [4- ( (4-metilpirimidin-2il) amino) fenilo]; R-IV se selecciona del grupo que consiste en [6-metil-2- (fenilamino) pirimidin-4

ilo] y [6-metil-2- (fenilamino) pirimidin-5-ilo];y R-V es [N- (4, 6-dimetilpirimidin-2-il) -N- (fenil) amino]; L es una cadena hidrocarbonada de 2 a 40 átomos de carbono, donde la cadena es lineal o ramificada, saturada o insaturada, y dicha cadena hidrocarbonada comprende entre 0 y 10 heteroátomos que se seleccionan del

grupo que consiste en S, O y N; Z es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en −CONH−, −NHCO−, −NHCONH−, −NHCSNH−, −OCONH−, −NHOCO−, −OCSNH−, −SCONH−, −S−, −S−S−, −NH (C=NH) −, −OCO−, −CO−, −CHOH−, −N=N−, −NH−, −NR−,

Q es un marcador no isotópico; y m es un número entero con un valor entero entre 1 y 1000.

21. Un compuesto de fórmula (III) según la reivindicación 20, caracterizado 25 porque L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono.

22. Un compuesto de fórmula (III) según una cualquiera de las reivindicaciones 20 o 21, caracterizado porque Z se selecciona del grupo que consiste en −CONH−, −NHCO−, −NH−, −S−,

y

. 23. Un compuesto de fórmula (III) según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, caracterizado porque Q se selecciona del grupo que consiste en biotina, fluoresceína o uno cualquiera de sus derivados, un fluoróforo de cianina, un fluoróforo de rodamina, un fluoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio y micro-o nanopartículas de oro coloidal, de carbón o de látex.

24. Un compuesto de fórmula (III) según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, caracterizado porque T es [3- ( (4, 6-dimetilpirimidin-2-il) amino) fenilo] o [4- ( (4, 6-dimetilpirimidin-2

il) amino) fenilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono; Z se selecciona del grupo que consiste en −CONH−, −NHCO−, −NH−, −S−,

y

; y

Q se selecciona del grupo que consiste en biotina, fluoresceína o uno cualquiera de sus derivados, un fluoróforo de cianina, un fluoróforo de rodamina, un fluoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio y micro-o nanopartículas de oro coloidal, de carbón o de látex.

25. Un compuesto de fórmula (III) según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, caracterizado porque T es [6-metil-2- (fenilamino) pirimidin-4-ilo]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono;

Z se selecciona del grupo que consiste en −CONH−, −NHCO−, −NH−, −S−, y

; y

Q se selecciona del grupo que consiste en biotina, fluoresceína o uno cualquiera de sus derivados, un fluoróforo de cianina, un fluoróforo de rodamina, un fluoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio y micro-o nanopartículas de oro coloidal, de carbón o de látex.

26. Un compuesto de fórmula (III) según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, caracterizado porque T es [N- (4, 6-dimetilpirimidin-2-il) -N- (fenil) amino]; L es una cadena hidrocarbonada lineal de 2 a 20 átomos de carbono;

Z se selecciona del grupo que consiste en −CONH−, −NHCO−, −NH−, −S−, y ; y

Q se selecciona del grupo que consiste en biotina, fluoresceína o uno cualquiera de sus derivados, un fluoróforo de cianina, un fluoróforo de rodamina, un fluoróforo de cumarina, un bipirilo de rutenio, luciferina o uno cualquiera de sus derivados, un éster de acridinio y micro o nanopartículas de oro coloidal, de carbón o de látex.

27. Un anticuerpo generado en respuesta a un compuesto de fórmula (II) tal 20 como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 19.

28. Método de análisis in vitro de pirimetanil en una muestra que comprende las siguientes etapas:

a. poner en contacto la muestra con el anticuerpo descrito en la reivindicación 27;

b. incubar la muestra y el anticuerpo del paso (a) durante un periodo de tiempo adecuado para que tenga lugar una reacción inmunoquímica; y

c. determinar la existencia de reacción inmunoquímica tras la incubación del paso (b) .

29. Método de análisis de pirimetanil según la reivindicación 28, caracterizado porque la determinación de la reacción inmunoquímica en el paso (c) se realiza mediante un inmunoensayo competitivo, usando como competidor un compuesto de formula (II) tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 19.

30. Método de análisis de pirimetanil según la reivindicación 28, caracterizado porque la determinación de la reacción inmunoquímica en el paso (c) se realiza mediante un inmunoensayo competitivo, usando como competidor un compuesto de formula (III) tal como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26.

31. Kit de detección de pirimetanil, caracterizado porque comprende al menos un anticuerpo tal como se define en la reivindicación 27 y un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un compuesto de fórmula (II) tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 10 a 19 y un compuesto de fórmula (III) tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26.

H

(CH2) 5CO2H NN m-NH2-Ph- (CH2) 5CO2H N

8h 70% 2 PMm6

N N Cl

H

NN

p-NH2-Ph- (CH2) 5CO2H N

(CH2) 5CO2H

30h 75% 3 PMp6

Fig. 1

O (CH2) 4CO2CH3 (CH2) 4CO2CH3

O ClCO (CH2) 4CO2CH3

Pd (AcO) 2O

O

O

O MgCl2, Py-Cl2CH2

Et3N, THF O OO

90%

97% 56

H

HN N

HH

.HNO3 N N

i) NaOH, MeOH N N NH2 60ºC, 1h N

N Na2CO3, CH3OH

ii) HCOOH 75ºC, 24h (CH2) 4CO2CH3 (CH2) 4CO2H

90% 70%

PMb5

Fig. 2

i) LiOH, THF-H2O

H Br (CH2) 4CO2CH3 (CH2) 4CO2CH3 (CH2) 4CO2H 25ºC, 24h

NN ii) KHSO4-H2O

NN NaH NN

DMF, 25ºC, 72h N N

N 60%

10 11 PMn5

Fig. 3

Fig. 4

PMm6#1PMm6#2PMp6#1 PMp6#2 PMb5#1 PMb5#2 PMn5#1 PMn5#2 Anticuerpo

Fig. 5

Absorbancia 492 nm

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

[Pirimetanil] (nM)

Fig. 6