Producción de glucoproteínas con O-glucosilación reducida.

Un método para producir una proteína que tiene glucosilación O-ligada reducida, que comprende:

(a) proporcionar un ácido nucleico que codifica una glucoproteína y un segundo ácido nucleico que codifica una a1,2-manosidasa;

(b) introducir el ácido nucleico y el segundo ácido nucleico en una célula hospedadora y cultivar la célula hospedadora que contiene el ácido nucleico y el segundo ácido nucleico para producir un cultivo de la célula hospedadora;

(c) poner en contacto el cultivo de la célula hospedadora con uno o más inhibidores de la glucosilación O-ligada mediada por Dol-P-Man:Proteína (Ser/Thr) Manosil Transferasa (Pmt); y

(d) aislar la glucoproteína producida por la célula hospedadora en presencia del uno o más inhibidores de glucosilación O-ligada mediada por Pmt para producir la proteína que tiene glucosilación O-ligada reducida.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2006/043535.

Solicitante: GLYCOFI, INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 21 LAFAYETTE STREET, SUITE 200 LEBANON NH 03766 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: BOBROWICZ,PIOTR, COOK,JAMES W, KETT,WARREN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/705 (Receptores; Antígenos celulares de superficie; Determinantes celulares de superficie)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de péptidos o de proteínas (proteína... > C12P21/06 (preparados por hidrólisis de un enlace peptídico, p. ej. hidrolizados)

PDF original: ES-2534465_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Producción de glucoproteínas con O-glucosilación reducida Antecedentes de la invención

(1) Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para producir proteínas que tienen patrones específicos de glucosilación. En particular, la presente invención se refiere a métodos para producir proteínas que tienen glucosilación O-ligada reducida.

(2) Descripción de la técnica relacionada

Las glucoproteínas median muchas funciones esenciales en seres humanos y otros mamíferos, incluyendo catálisis, señalización, comunicación célula-célula, y reconocimiento y asociación molecular. Las glucoproteínas componen la mayoría de las proteínas no citosólicas en organismos eucariotas (Lis y Sharon, 1993, Eur. J. Biochem. 218:1-27). Muchas glucoproteínas se han explotado para propósitos terapéuticos, y durante las últimas dos décadas, versiones recombinantes de glucoproteínas de originen natural han sido una parte principal de la industria de biotecnología. Ejemplos de proteínas glucosiladas recombinantes usadas como agentes terapéuticos incluyen eritropoyetina (EPO), anticuerpos monoclonales (mAb) terapéuticos, activador de plasminógeno tisular (tPA), interferón-P (IFN-j3), factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), y gonadotropina coriónica humana (hCH) (Cumming et al., 1991, Glycobiology 1:115-13). Variaciones en los patrones de glucosilación de glucoproteínas producidas de forma recombinante han sido recientemente el tópico de mucha atención en la comunidad científica como proteínas recombinantes producidas como enfoque profiláctico y terapéutico potencial en clínica.

En general, las estructuras de glucosilación de oligosacáñdos de glucoproteína variarán dependiendo de la especie hospedadora de las células usadas para producirlos. Las proteínas terapéuticas producidas en células hospedadoras no humanas probablemente contienen glucosilación no humana que puede provocar una respuesta inmunogénica en seres humanos, por ejemplo, hipermanosilación en levaduras (Ballou, 199, Methods Enzymol. 185:44-47); a(1,3)-fucosa y (3(1,2)-xilosa en plantas, (Cabanes-Macheteau et al., 1999. Glycobiology, 9: 365-372); ácido N-glucolilneuramínico en células de ovario de hámster Chino (Noguchi et al., 1995. J. Biochem. 117: 5-62); y, glucosilación Ga1<x-1,3Gal en ratones (Borrebaeck, et al., 1993, Immun. Today, 14: 477-479). Las cadenas de carbohidrato unidas a proteínas en células animales incluyen cadenas de carbohidrato de tipo enlace N-glucósido (también llamados N-glucanos; o glucosilación N-ligada) unidas a un resto de asparagina (Asn) en la proteína y cadenas de carbohidrato tipo enlace O-glucósido (también llamados O-glucanos; o glucosilación O-ligada) unidas a un resto de serina (Ser) o treonina (Thr) en la proteína.

Como las estructuras oligosacáridas de glucoproteínas producidas por células de mamífero no humanas tienden a estar más estrechamente relacionadas con aquellas de glucoproteínas humanas, se producen glucoproteínas más comerciales en células de mamífero. Sin embargo, las células de mamífero tienen varias desventajas importantes como células hospedadoras para la producción de proteínas. Más allá de ser costosos, los procesos para producir proteínas en células de mamífero producen poblaciones heterogéneas de glucoformas, tienen bajos títulos volumétricos, y requieren tanto contención viral en curso como un tiempo significativo para generar líneas celulares estables.

Está bien reconocido que las glucoformas particulares en una proteína pueden afectar profundamente a las propiedades de la proteína, incluyendo su farmacocinética, farmacodinámica, interacción con receptor, y propiedades de direccionamiento específicas de tejido (Graddis et al., 22. Curr Pharm Biotechnol. 3: 285-297). Por ejemplo, se ha demostrado que diferentes patrones de glucosilación de Ig están asociados con diferentes propiedades biológicas (Jefferis y Lund, 1997, Antibody Eng. Chem. Immunol., 65: 111-128; Wright y Morrison, 1997, Trends Biotechnol., 15: 26-32). Se ha demostrado adicionalmente que la galactosilación de una glucoproteína puede variar con las condiciones de cultivo celular, que pueden volver algunas composiciones de glucoproteína inmunogénicas dependiendo del patrón específico de galactosa en la glucoproteína (Patel et al., 1992. Biochem J. 285: 839-845). Sin embargo, como no se sabe cuál o cuáles glucoformas específicas contribuyen a una función biológica deseada, la capacidad de enriquecer glucoformas específicas en glucoproteínas es muy deseable. Como diferentes glucoformas están asociadas con diferentes propiedades biológicas, la capacidad de enriquecer glucoproteínas que tengan una glucoforma específica puede usarse para dilucidar la relación entre una glucoforma específica y una función biológica específica de la glucoproteína. Además, la capacidad de enriquecer glucoproteínas que tengan una glucoforma específica posibilita la producción de glucoproteínas terapéuticas que tengan especificidades particulares. Por tanto, la producción de composiciones de glucoproteína que estén enriquecidas en glucoformas particulares es muy deseable.

Aunque la vía de glucosilación N-ligada se ha sometido a mucho análisis, el proceso y función de glucosilación enligada aún no está tan bien comprendido. Sin embargo, se sabe que en contraste con la glucosilación N-ligada, la O- glucosilación es un evento post-traduccional, que sucede en el c/'s-Glogi (Varki, 1993, Glycobiol., 3: 97-13). Aunque

no parece existir una secuencia aceptora consenso para glucosilación O-ligada como para la glucosilación N-ligada, una comparación de secuencias de aminoácidos respecto a una gran cantidad de sitios de glucosilación O-ligada de varias glucoproteínas muestra una frecuencia aumentada de restos de prolina en las posiciones -1 y +3 respecto a los restos glucosilados y un marcado aumento de restos de serina, treonina y alanina (Wilson et al., 1991, Biochem. J., 275: 529-534). Tramos de restos de serina y treonina en glucoproteínas, también pueden ser sitios potenciales para O-glucosilación.

Una familia de genes que tiene un papel de glucosilación O-ligada son los genes que codifican la Dol-P- Man:Proteína (Ser/Thr) Manosil Transferasa (Pmt). Estos genes altamente conservados se han identificado tanto en eucariotas superiores tales como seres humanos, roedores, insectos y similares así como en eucariotas inferiores tales como hongos y similares. Levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris codifican hasta siete genes PMT que codifican homólogos Pmt (revisado en Willer et al. Curr. Opin. Struct. Biol. 23 Oct;13(5): 621-3.). En levaduras, la glucosilación O-ligada empieza por la adición de la mañosa inicial a partir de dolicol- fosfato mañosa a un resto de serina o treonina de una glucoproteína naciente en el retículo endoplasmático por uno de los siete genes de O-manosil transferasa. Aunque parece haber siete genes PMT que codifican homólogos Pmt e levaduras, la O-manosilación de proteínas fúngicas y heterólogas secretadas en levaduras es principalmente dependiente de los genes que codifican Pmt1 y Pmt2, que parecen funcionar como heterodímeros. PMT1 y PMT2y sus productos proteicos, Pmt1 y Pmt2, respectivamente, parecen estar altamente conservados entre especies.

Tanner et al. en la patente de Estados Unidos N2 5.714.377 describe los genes PMT1 y PMT2 de Saccharomyces cerevisiae y un método para preparar proteínas recombinantes que tengan glucosilación O-ligada reducida que usa células fúngicas en que uno o más genes PMT se han modificado genéticamente de modo que se produzcan proteínas recombinantes, que tienen glucosilación O-ligada reducida.

Ng et al. en la solicitud... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para producir una proteína que tiene glucosilación O-ligada reducida, que comprende:

(a) proporcionar un ácido nucleico que codifica una glucoproteína y un segundo ácido nucleico que codifica una a1,2-manosidasa;

(b) introducir el ácido nucleico y el segundo ácido nucleico en una célula hospedadora y cultivar la célula hospedadora que contiene el ácido nucleico y el segundo ácido nucleico para producir un cultivo de la célula hospedadora;

(c) poner en contacto el cultivo de la célula hospedadora con uno o más inhibidores de la glucosilación O-ligada mediada por Dol-P-Man:Proteína (Ser/Thr) Manosil Transferasa (Pmt); y

(d) aislar la glucoproteína producida por la célula hospedadora en presencia del uno o más inhibidores de glucosilación O-ligada mediada por Pmt para producir la proteína que tiene glucosilación O-ligada reducida.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la a-1,2-manosidasa comprende el dominio catalítico de una a-1,2- manosidasa unido de forma funcional a una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido señal de di rece ion amiento celular no asociado normalmente con el dominio catalítico.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el cultivo se cultiva durante un tiempo suficiente para proporcionar una multiplicidad de las células hospedadoras que tienen el ácido nucleico y el segundo ácido nucleico antes de poner en contacto el cultivo con el uno o más inhibidores de glucosilación O-ligada mediada por Pmt.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el cultivo se cultiva en presencia del uno o más inhibidores de glucosilación O-ligada mediada por Pmt.

5. El método de la reivindicación 1, en el que el cultivo se cultiva durante un tiempo suficiente para proporcionar una multiplicidad de las células hospedadoras que tienen el ácido nucleico y el segundo ácido nucleico antes de poner en contacto el cultivo con el uno o más inhibidores de glucosilación O-ligada mediada por Pmt y un inductor de los promotores para inducir la expresión de la proteína y la a1,2-manosidasa y aislar la glucoproteína producida por la célula hospedadora en presencia del uno o más inhibidores y el inductor para producir la proteína que tiene glucosilación O-ligada reducida.

6. El método de la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico que codifica la glucoproteína y el segundo ácido nucleico que codifica la a-1,2-manosidasa están unidos de forma funcional a un promotor inducible.

7. El método de la reivindicación 6, en el que el cultivo se pone en contacto con un inductor de los promotores para inducir la expresión de la proteína y la a1,2-manosidasa durante un tiempo antes de poner en contacto el cultivo con el uno o más inhibidores de glucosilación O-ligada mediada por Pmt y aislar la glucoproteína producida por la célula hospedadora en presencia del uno o más inhibidores y el inductor para producir la proteína que tiene glucosilación O-ligada reducida.

8. El método de la reivindicación 1, en el que el cultivo se cultiva durante un tiempo suficiente para proporcionar una multiplicidad de las células hospedadoras antes de inducir la expresión de la proteína y la una o más enzimas a-1,2- manosidasa para producir la glucoproteína que tiene glucosilación O-ligada reducida.

9. El método de la reivindicación 1, en el que la expresión de la proteína se induce durante un tiempo antes de inducir la expresión de la una o más enzimas a-1,2-manosidasa para producir la glucoproteína que tiene glucosilación O-ligada reducida.

1. El método de la reivindicación 1, en el que la expresión de la una o más enzimas a-1,2-manosidasa capaces de inhibir la glucosilación O-ligada se induce durante un tiempo antes de inducir la expresión de la glucoproteína para producir la glucoproteína que tiene glucosilación O-ligada reducida.

11. El método de la reivindicación 1, en el que el uno o más inhibidores se seleccionan entre el grupo que consiste en: ácido 5-[[3,4-bis(fenilmetoxi)fenil]metileno]-4-oxo-2-tioxo-3-tiazolidinaacético; ácido 5-[[3-(1-feniletoxi)-4-(2- feniletoxi)]fenil]metileno]-4-oxo-2-tioxo-3-tiazolidinaacético; y ácido 5-[[3-(1 -fenil-2-hidroxi)etoxi)-4-(2- feniletoxi)]fenil]metileno]-4-oxo-2-tioxo-3-tiazolidinaacético.

12. El método de la reivindicación 1, en el que la a-1,2-manosidasa es de Trichoderma reesei, Saccharomyces sp. o Aspergillus sp.

13. El método de la reivindicación 1, en el que la célula hospedadora es una célula fúngica o una célula de levadura.

14. El método de la reivindicación 1, en el que la célula hospedadora se selecciona entre el grupo que consiste en K. lactis, Pichia pastoris, Pichia methanolic, y Hansenula.

15. El método de la reivindicación 1, en el que la célula hospedadora es una célula de levadura o un hongo filamentoso que se ha modificado genéticamente para producir glucoproteínas con una glucoforma predominante de N-glucano.

16. El método de la reivindicación 1, en el que las células hospedadoras se han modificado genéticamente para

producir glucoproteínas en el que el patrón de N-glucosilación es de tipo humano o humanizado.