Un mutante de FSH, caracterizado porque se ha introducido un sitio de N-glicosilación en la subunidad alfa deFSH mediante la mutación F17T,

en el que el mutante de FSH comprende la secuencia de aminoácidos SEQ IDNO:3.

Glicoproteínas mutantes.

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de las gonadotropinas, y en particular a su uso en el tratamiento de trastornos 5 reproductivos.

Antecedentes de la invención

Las gonadotropinas son un grupo de glicoproteínas heterodímeras que incluyen hormona estimuladora del folículo (FSH) , hormona luteinizante (LH) y gonadotropina coriónica (CG) . Estas hormonas regulan la función gonadal en el macho y en la hembra. Cada una de estas hormonas está compuesta por dos subunidades unidas de modo

covalente: una subunidad alfa, que es común a FSH, LH y hCG, y una subunidad beta, que es única para cada una de ellas, y que confiere especificidad biológica a cada hormona.

En todas las gonadotropinas, cada subunidad tiene cadenas laterales de oligosacáridos unidas (unidas por N) a asparagina. En la subunidad alfa común de las hormonas humanas, estas están unidas en las posiciones 52 y 78. En ambas FSH y CG humanas, dos cadenas laterales de oligosacáridos unidas por N se unen a la subunidad beta,

en las posiciones 7 y 24 en FSH, y en las posiciones 13 y 30 en hCG. En LH humana, un oligosacárido se une en la posición 30 de la subunidad beta. La hCG tiene adicionalmente cuatro cadenas laterales de oligosacárido unidas (unidas por O) a serina, presente en la porción terminal de carboxilo (CTP) .

Las gonadotropinas desempeñan papeles cruciales en el ciclo reproductivo, y su uso es esencial para las técnicas de reproducción asistida (ART) , tales como fertilización in vitro (IVF) , IVF en conjunción con inyección

intracitoplásmica de esperma (IVF/ICSA) y transferencia de embrión (ET) , así como para inducción de ovulación (OI) en pacientes anovuladoras que se someten a fertilización in vivo ya sea de modo natural o a través de inseminación intrauterina (IUI) .

Típicamente, la ART se lleva a cabo usando hiperestimulación ovárica controlada (COH) para aumentar el número de gametos femeninos. Los regímenes estándar para COH incluyen una fase de regulación a la baja en la que se 25 suprimen las gonadotropinas endógenas mediante administración de una gonadotropina que libera hormona agonista (GnRH) seguida por una fase estimuladora en la que se induce desarrollo folicular (foliculogénesis) mediante administración diaria de FSH, habitualmente 150-225 UI/día aproximadamente. Como alternativa, se inicia la estimulación después de la menstruación espontánea o inducida al tiempo que se previene que ocurra un incremento repentino de LH por enfermedad planificada mediante administración de un antagonista de GnRH (que

se inicia típicamente alrededor del sexto día de la fase estimuladora) . Cuando hay al menos 3 folículos >16 mm (uno de 18 mm) , se administra un bolus único de hCG (5-10.000 UI) para imitar el incremento repentino natural de LH e inducir la ovulación. La recuperación de oocito se planifica para 36-38 horas después de la inyección de hCG.

Típicamente, la OI se lleva a cabo con administración diaria de FSH a una dosis de aproximadamente 75-150 UI/día. Se puede usar regulación a la baja con agonistas de GnRH o antagonistas, aunque menos frecuentemente que en la

indicación de ART. Se administra hCG para imitar el incremento repentino de LH previo a la fertilización in vivo que se consigue bien por relación sexual natural o por IUI.

Los regímenes típicos anteriormente descritos para ART y OI requieren inyecciones diarias de gonadotropinas durante un período prolongado, esto es durante una media de 10 días, y hasta 21 días en algunas pacientes. El desarrollo de preparaciones de FSH de mayor eficacia permitiría que la dosis diaria de FSH se disminuyera, y/o

permitiría el acortamiento del período de tratamiento (esto es menos inyecciones) , y/o permitiría que las inyecciones se administraran menos frecuentemente. Esto haría que los regímenes de ART y OI fueran más cómodos y llevaderos para la paciente.

Además, la ART que usa fertilización in vitro está plagada de posibles contratiempos. Por ejemplo, no todos los folículos producirán oocito viable, no todos los oocitos viables se fertilizarán con éxito, y algunos embriones puede

45 que no sean viables. Aun más, una vez que se seleccionan embriones viables, puede que la transferencia al útero y la implantación no tengan éxito. A fin de maximizar las oportunidades de un nacimiento vivo es por tanto deseable estimular el crecimiento y la maduración de varios folículos, para garantizar la recogida de múltiples oocitos.

En contraposición, en la indicación de OI el objetivo es obtener no más de tres y preferiblemente un folículo dominante (para evitar embarazos múltiples) .

50 Algunas pacientes que se someten a ART y OI presentan un número reducido de folículos que crecen cuando se tratan con preparaciones de FSH convencionales. Esto es un factor limitante del éxito al someterse a ART, porque limita el número de embriones disponibles para la transferencia y/o la crioconservación. También puede ser un factor limitante del éxito en pacientes que se someten a IUI, en la que es importante obtener más de un folículo. Pacientes que presentan este tipo de respuesta incluyen pacientes por encima de aproximadamente 33-35 años de edad,

55 pacientes con elevada línea de base de FSH, elevada línea de base de estradiol o reducida línea de base de

inhibina b.

En el macho, la espermatogénesis depende de la estimulación de las células de Sertoli por la FSH. La deficiencia de FSH da como resultado la oligospermia, y por tanto la infertilidad. El tratamiento de la infertilidad del macho con preparaciones convencionales de FSH requiere inyecciones de FSH tres veces a la semana durante hasta 18 meses.

En el documento WO 01/58493 (Maxygen) se describen moléculas de FSH modificadas, que tienen sitios de glicosilación adicionales. Se prueba un ejemplo de moléculas de FSH modificadas y se informa que tienen bioactividad reducida y un período de semidescomposición in vivo aumentado. El documento WO 01/58493 describe una variante de FSH con una mutación F17N en la subunidad alfa. Esta mutación introduce un tripéptido de consenso Asn17-Phe18-Ser19, en el que Asn17 está glicosilada.

El desarrollo de preparaciones de FSH con capacidad potenciada para estimular foliculogénesis, es una necesidad permanente. También existe necesidad de nuevas preparaciones de FSH para tratar a pacientes con baja respuesta a FSH. También son deseables preparaciones de FSH de período de semidescomposición más largo, que permitan protocolos más cortos de tratamiento y/o dosis acumulativas menores y/o dosificación menos frecuente, para ART, OI e infertilidad masculina.

Resumen de la invención:

Los inventores han diseñado nuevos mutantes de FSH con glicosilación aumentada y más largos períodos de semidescomposición para uso en tratamiento de trastornos reproductivos en pacientes humanos. El uso de una preparación mutante de FSH de la invención permite el uso de dosis acumulativas más bajas de FSH para conseguir un resultado clínico igual o mejor.

Por consiguiente, la invención proporciona una FSH mutante que muestra actividad de FSH, teniendo la FSH mutante al menos un sitio de glicosilación adicional, en comparación con FSH de tipo nativo, sitio de glicosilación que tiene un glicano. La invención proporciona además moléculas de ácido nucleico que codifican la FSH mutante. También se incluye en la invención un vector que contiene alguno de los ácidos nucleicos de la presente invención.

La presente invención también se dirige a células hospedadoras recombinantes que expresan una FSH mutante de la invención, en particular una célula hospedadora transformada con un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de FSH que codifica la FSH mutante. En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición que incluye una FSH mutante y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Todavía más, la invención proporciona un procedimiento para producir una FSH mutante. El procedimiento incluye proporcionar una célula que contiene un ácido nucleico de FSH mutante, por ejemplo, un vector que incluye un ácido nucleico de mutante de FSH, y cultivar la célula en condiciones suficientes para que exprese el mutante de FSH.... [Seguir leyendo]

1. Un mutante de FSH, caracterizado porque se ha introducido un sitio de N-glicosilación en la subunidad alfa de FSH mediante la mutación F17T, en el que el mutante de FSH comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:3.

2. Una composición que comprende un mutante de FSH según la reivindicación 1 y al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

3. El uso de un mutante de FSH según la reivindicación 1 para la fabricación de una medicina para tratamiento de la infertilidad de un mamífero estimulando la foliculogénesis, o induciendo hiperestimulación ovárica.

4. Un mutante de FSH según la reivindicación 1 para uso en el tratamiento de la infertilidad de un mamífero 10 estimulando la foliculogénesis, o induciendo hiperestimulación ovárica.

5. Una secuencia de nucleótidos que codifica un mutante de FSH de la reivindicación 1.

6. Un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 5.

7. Una célula hospedadora que comprende un vector según la reivindicación 6.

8. Una célula hospedadora de la reivindicación 7 que es eucariota.

9. Una célula hospedadora de la reivindicación 7 que es de mamífero.

10. Un procedimiento para producir un mutante de FSH, que comprende someter a una célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 a cultivo en condiciones que conducen a la expresión de dichos mutantes.