GLICOPEPTIDOS INMUNOGENOS, CRIBADO, PREPARACION Y APLICACIONES.

- la reacción a la tuberculina muestra que un sujeto se ha sensibilizado, se ha infectado por M. tuberculosis o se ha vacunado por BCG. La tuberculina es en efecto una mezcla de antígenos de M. tuberculosis y por lo tanto es incapaz de realizar el diagnóstico entre una infección por M. tuberculosis y la vacunación por el BCG debido a reacciones cruzadas muy numerosas entre los antígenos de la vacuna y M. tuberculosis. Por otra parte, esta reacción a la tuberculina no permite distinguir una tuberculosis, enfermedad activa, de una infección por M. tuberculosis.

Vacuna

La vacunación por el BCG permite controlar la infección primaria (multiplicación inicial de M. tuberculosis) pero sobre todo la diseminación secundaria de estos bacilos. Contribuye verdaderamente a reducir la incidencia de las infecciones latentes contra las cuales ningún tratamiento eficaz está actualmente disponible. El BCG se ha utilizado para vacunar más de tres mil millones de individuos contra la tuberculosis, sin efectos secundarios particulares. Con ocasión de la vacunación por el BCG hay una multiplicación local de estos bacilos de virulencia atenuada. Se induce una inmunidad celular. Se traduce por una hipersensibilidad de tipo retardada (HSR) dirigida contra las proteínas, antígenos, de micobaterias, es la reacción a la tuberculina, y por una mayor resistencia a la infección por M. tuberculosis. Estas dos respuestas inmunitarias (sensibilización de tipo HSR y mayor resistencia) tienen como soportes linfocitos T que reaccionan con antígenos de micobacterias.

El BCG protege bien contra las formas agudas de la infección (meningitis tuberculosa del niño, por ejemplo). Su eficacia es más variable en los adultos). La existencia de una reactividad cruzada entre el BCG y otras micobacterias no pertenece al complejo tuberculosis así como la ausencia, en el genoma de BCG, de algunos antígenos inmunógenos de Mycobacterium tuberculosis o un perfil de expresión diferente de estos antígenos en el transcurso de la infección podría explicar la eficacia variable del BCG.

Además, el BCG es una cepa viva de virulencia atenuada. Posee por lo tanto un poder patógeno residual que prohíbe el uso en los individuos inmunodeprimidos, especialmente en los sujetos reconocidos por estar infectados por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH).

Para combatir más eficazmente esta infección, sería juicioso disponer de herramientas diagnósticas y de vacunas, especialmente de una vacuna "subunidad", y por lo tanto sin riesgo, a base de antígenos protectores del microorganismo patógeno responsable de esta infección.

Se han hecho en este sentido un cierto número de estudios para encontrar la o las moléculas de este microorganismo patógeno, susceptible(s) de inducir una fuerte respuestas inmunitaria protectora. De este modo, J. Hess et al. (C.R. Acad. Sci. Paris, 1999, 322: 953-958) se han centrado en las propiedades que deberían tener antígenos aptos para ser utilizados como vacuna contra la tuberculosis. En esta revista, subrayan la importancia de usar una combinación de antígenos previamente seleccionados en vez de un único antígeno. Recomiendan especialmente seleccionar estos antígenos sobre la base de criterios tales como la presencia de zonas altamente conservadas entre las diferentes cepas, las diferencias en el perfil de expresión de los genes de zonas altamente conservadas entre las diferentes cepas, las diferencias en el perfil de expresiones de los genes de las cepas virulentas y de las cepas atenuadas, la reactividad respecto de las células efectoras de la respuesta inmunitaria (linfocitos B, T, CD4+, T, CD8+), la capacidad de estos antígenos a ligarse a una mayoría de las moléculas HLA del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH).

Algunos de estos antígenos están presentes en forma de antígenos secretados: MPT59 (30kDa), 85A (32 kDa), MPT64 (23 kDa), hsp71 (71 kfa), MPT51 (24 kDa), MPT63 (16kDa) y ESAT-6 (6 kDa). (Andersen, Infect. Immun, 1994, 62, 2536-2544; Horwitz et al., PNAS, 1995, 92, 1530-1534). Estos antígenos de M. tuberculosis ya se han propuesto como potenciales candidatos de una composición de vacuna ya que son reconocidos preferentemente por linfocitos T CD4+ (Andersen, et al. anteriormente citada; Hortwitz et al. anteriormente citado).

Igualmente se ha propuesto aislar, a partir de los antígenos de M. tuberculosis, péptidos que contienen epítopes capaces de ser presentados por una molécula de clase II del CMH y de ser reconocidos por los linfocitos T CD4+ específicos; tales epítopes han sido sin embargo reseñados para dos proteínas: ESAT-6 (Olsen et al., Eur. j. Immunol., 2000, 30, 1724-1732) y MPT-39 (Mustafa et al., Inf. Immunol., 2000, 68, 2933-3940).

Se han hecho diversas observaciones por los Inventores (Romains et al., Inf Immun. 1993, 61 742-750; Romain et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 1993, 90: 5322-5326):

- un glicopéptido de 39 aminoácidos cuya secuencia (SEQ ID NO:1) es la que se extiende de las posiciones 1 a 39 de la secuencia de la proteína Apa y en la cual al menos uno de los residuos treonina en posición 10, 18 y 27 de la SEQ I NO:1 está ligado a una di- o trimannosa por un enlace glicosídico,

- un glicopéptido de 26 aminoácidos cuya secuencia (SEQ ID NO:2) es la que se extiende de las posiciones 261 a 2869 de la secuencia de la proteína Apa (secuencia C-terminal) y en la cual al menos el residuo treonina en posición 17 de la SEQ I NO:2 está ligado a una di- o trimannosa por un enlace glicosídico, y

- un glicopéptido de 35 aminoácidos cuya secuencia (SEQ ID NO:3) es la que se extiende de las posiciones 169 a 203 de la secuencia de la proteína Rv 1796 y en la cual al menos uno de los residuos treonina en posición 4, 5, 7, 13, 15, 23 y 25 de la SEQ I NO:3 está ligado a una di- o trimannosa por un enlace glicosídico.

7. Glicopéptido inmunógeno procedente de M. tuberculosis, caracterizado porque está constituido por el epítope T glicosilado de 14 a 25 aminoácidos tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

8. Procedimiento de síntesis de un glicopéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

- preparación, en solución, de aminoácidos neutros glicosilados, unidos a una di- o a una trimannosa por un enlace glicosídico,

- síntesis, sobre soporte sólido, del gligopéptido procedente de una glicoproteína de M. tuberculosis con la ayuda de los aminoácidos necesarios para la obtención de la secuencia peptídica de dicho glicopéptido y de los aminoácidos neutros glicosilados, obtenidos anteriormente, y

- corte del glicopéptido del soporte sólido.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque dicho aminoácido neutro se selecciona en el grupo constituido por la serina y la treorina.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque dichos glicopéptidos presentan las siguientes secuencias (T representa una treorina O-glicosilada, funcionalizada por 2 o 3 residuos mannosa y Ac representa una función acetato):

SEQ ID NO:1:

H2N-DPEPAPPVPTTAASPPSTAAAPPAPATPVAPPPPAAANT-CONH2

SEQ ID NO:2:

AcNH-PAPAPAPAGEVAPTPTTPTPQRTLPA-COOH

SEQ ID NO:3:

AcNH-TIPTTETPPPPQTVTLSPVPPQTVTVIPAPPPEEG-CONH2,

dicho procedimiento comprende las siguientes etapas:

        i)        preparación, en solución, de treoninas O-glicosiladas funcionalizadas por 2 o 3 residuos mannosa,

        ii)        síntesis, sobre soporte, de los péptidos que corresponden a las secuencias SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3 anteriormente mencionadas, con la ayuda de los aminoácidos necesarios para la obtención de estas secuencias y de las treoninas O-glicosiladas obtenidas en la etapa i),

        iii)        corte de los péptidos del soporte sólido, y

        iv)        introducción, por síntesis química, de una función amida a nivel del extremo C-terminal de los péptidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3., y de una función acetato a nivel del extremo N-terminal de los péptidos SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque las treoninas funcionalizadas por residuos mannosa se preparan por las siguientes etapas:.

a₂) preparación de derivados de mannosa de fórmulas (I) y (II):

en las cuales P₁ y P₂, que pueden ser iguales o diferentes, representan grupos protectores de una función hidroxilo, y X representa una función activada, tal como un átomo de bromo,

b₂) reacción del derivado de fórmula (I) con el derivado de fórmula (II), y a continuación activación del compuesto obtenido, que conduce a la obtención de un derivado activado que comprende dos residuos mannosa y que responde a la fórmula (III):

en la cual P₁ P₂ y X son tal como se han definido respecto de las fórmulas (I) y (II),

c₂) eventualmente, reacción del compuesto de fórmula (III) con un derivado de mannosa de fórmula (I) tal como se define en a₂), y a continuación activación del compuesto obtenido, que conduce a la obtención de un derivado activado que comprende tres residuos mannosa y que responde a la fórmula (IV):

en la cual P₁ P₂ y X son tal como se han definido respecto de las fórmulas (I) y (II),

d₂) condensación del compuesto de fórmula (III) o del compuesto de fórmula (IV) con una treonina convenientemente protegida de fórmula (V):

en la cual P₃ representa un grupo protector de una función amina primaria y P₄ representa un grupo protector de una función carboxilo,

que conducen respectivamente a la obtención de una treonina glicosilada de fórmula (VI) o (VII):

en las cuales P₁, P₂, P₃ y P₄ son tales como se han definido anteriormente.

12. Procedimiento de selección y de cribado de glicopéptidos inmunógenos a partir de la secuencia peptídica de glicoproteínas de M. tuberculosis, caracterizado porque comprende al menos las siguientes etapas:

a₃) búsqueda y selección en la secuencia peptídica de dichas glicoproteínas de al menos una secuencia de 14 a 25 aminoácidos, que contiene al menos un aminoácido neutro unido a una di- o una trimannosa y al menos el 15% de prolina, estando una de las prolinas situada en posición -1 a -4, respecto de la posición de dicho aminoácido;

b₃) preparación del/de los glicopéptido(s) seleccionado(s) en la etapa a₃) según el procedimiento de las reivindicaciones 8 a 11, y

c₃) selección de los glicopéptidos cuya actividad antigénica es al menos 10 veces superior, preferiblemente al menos 30 veces superior a la de un péptido testigo de igual secuencia.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque previamente a la etapa a₃), comprende una etapa de preselección de al menos una glicoproteína antigénica.

14. Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque dicho aminoácido neutro se selecciona en el grupo constituido por la serina y la treonina.

15. Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque en la etapa c₃), la actividad antigénica de dicho glicopéptido se evalúa por medición de la actividad de los linfocitos T CD4+ de animales inmunizados por Mycobacterium bovis BCG o por una fracción antigénica de M. tuberculosis.

16. Glicopéptido tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque es susceptible de obtenerse por el procedimiento de selección y de cribado según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 o el procedimiento de síntesis según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.

17. Composición inmunógena apta para inducir una inmunidad humoral y/o celular, caracterizada porque comprende al menos un glicopéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o 16 o un glicopéptido de secuencia SEQ ID NO:11, asociado a al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.

18. Composición de vacuna apta para inducir una inmunidad humoral y/o celular, caracterizada porque comprende al menos un glicopéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o 16 o un glicopéptido de secuencia SEQ ID NO:11, asociado a al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable y eventualmente a al menos un coadyuvante

19. Composición inmunógena o de vacuna según la reivindicación 17 o la reivindicación 18, caracterizada porque dicho glicopéptido se asocia a una proteína o un fragmento de proteína que comprende al menos un epítope B, un epítope T de tipo CD4+ o un epítope T de tipo CD8+.

20. Anticuerpo, caracterizado porque se dirige específicamente contra uno o varios de los glicopéptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o 16.

21. Reactivo de diagnóstico, caracterizado porque comprende un glicopéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o 16, un glicopéptido de secuencia SEQ ID NO:11 o un anticuerpo según la reivindicación.

22. Procedimiento de detección de la tuberculosis, caracterizado porque comprende la puesta en contacto de una muestra biológica de un paciente susceptible de estar por de Mycobacterium tuberculosis, con un reactivo de diagnóstico, según la reivindicación 21 y la detección de la formación de un complejo anticuerpos-microorganismo presente en la muestra biológica o glicopéptido(s)-anticuerpos presentes en la muestra.

23. Procedimiento de detección de la tuberculosis, caracterizado porque comprende la detección, in vitro, de linfocitos T CD4+ que reconocen un glicopéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o 16, por cualquier técnica apropiada.

24. Procedimiento según la reivindicación 23, caracterizado porque dicha técnica de detección se selecciona en el grupo constituido por los ensayos de proliferación de linfocitos T y de dosificaciones inmunoenzimáticas de citoquinas específicas de linfocitos T CD4+.