Genes control para la normalización de datos de análisis de expresión génica.

Procedimiento para la normalización de una expresión de ARNm en varias muestras de sangre que comprende:

a) una comparación de los valores de expresión de uno o varios ácidos nucleicos seleccionados de SEC ID 22 a SEC ID 97 a través de distintas muestras de sangre;

b) derivación de una medida de estabilidad génica para la normalización de valores de expresión de uno o varios ácidos nucleicos

, seleccionados de SEC ID 22 a SEC ID 97 a través de varias muestras de sangre; y

c) una normalización de la expresión de otros ácidos nucleicos, que se aislaron de varias muestras de sangre, basándose en la etapa b).

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10196834.

Solicitante: Analytik Jena AG.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: Konrad-Zuse-Strasse 1 07745 Jena ALEMANIA.

Inventor/es: RUSSWURM,Stefan, SALUZ,Hans,Peter, DEIGNER,Hans-Peter.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)

PDF original: ES-2524643_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Genes control para la normalización de datos de análisis de expresión génica La presente invención se refiere a un procedimiento para la normalización de una cantidad de ARNm en varias muestras de acuerdo con la reivindicación 1, a un kit con una selección de secuencias de acuerdo con la reivindicación 9, a un uso de ácidos nucleicos como genes contra! para la normalización da dalas de análisis de expresión génica de acuerdo con la reivindicación 10 asl como a conjuntos de genes control para la normalización de análisís de expresión génica de acuerdo con la reivindicación 11 y 12.

Igual Que antes existe una necesidad de identificar genes, en particular de células sangufneas, que muestran variación sólo mínima en su expresíón en condiciones distintas. Estos denominados genes ·constitutivos· se usan como referencias, controles internos y valores de referencia en la cuantificación de la expresión génica y de ARN y ARNm con procedimientos tales como inmuno\ransferencia tipo Northem, ensayo de protección de ribonucleasa. electroforesis capilar, micromatrices y PCR en tiempo real cuantitativa asi como por medio de otros procedimientos para la medición directa de la transcripción y medición tras amplificación anterior.

A continuación se resumen los términos genes constitutivos y genes control de expresión en el término genes control. Esta simplificación se realiza por motivos de legibilidad y no representa ninguna limitación de la invención.

Una normalización de datos cuantitativos por medio de genes control tiene numerosas posibilidades de uso. Los genes control permiten una identificación de genes cuya actividad se regula de manera diferencial en distintos estados patOlógicos así como el desarrollo de diagnósticos que se basan en esto.

Un gen control es un gen que muestra modificación mínima de la expresión y transcripción a través de distintas muestras de ARN y con ello sirve como control para la medición de actividades génicas variables a través de distintas muestras. Ningun gen muestra actividad no modificada por todos los tejidos. Por tanto existe una alta necesidad de nuevos genes control. en particular para sangre, dado que los valores de expresión de sangre se usan de manera diagnóstica.

Aunque distintos genes control se conocen en la bibliografía [1]. no se conocen genes control y sus transcritos asi como su uso combinado para la normalización de la expresión génica y la transcripción de muestras de sangre completa y células sanguíneas. Los transcritos (también ARNm y microARN así como otros ARN) con concentración conslante en células sanguineas y en células de órganos y tejidos periféricos que están localizados en la sangre completa, representan una condición previa para la normalización de actividades génicas y para la determinación de las modificaciones de otras actividades génicas y por consiguiente una condición previa para el diagnóstico basado en sangre. Del mismo modo están publicados ya distintos estudios para la medición de la actividad génica para el diagnósticolpronóstico de SIRS y septicemia, por ejemplo [2 , 3], sin embargo no se ha descrito aun un uso y una cuantificación de estas señales de actividad génica por medio de genes control de sangre.

Por consiguiente existe una necesidad de genes control de sangre y células sanguíneas robustos y Que dispongan de una estabilidad, que permita una normalización y cuantificación de la expresión géniC<:1 de genes o agrupaciones de genes especificos de enfermedad.

El punto de partida para la invención dada a conocer en la presente solicitud es el conocimiento de que se detectan actividades génicas de distintos genes, que se producen en células sanguíneas, en muestras de un individuo durante las apariciones de enfermedad tlpicas de septicemia (que corresponden a la definición en (4) ) , no se diferencian de las actividades génicas de los mismos genes de individuos, en los que no se diagnosticó septicemia y pueden usarse conjuntamente o de manera individual como genes control para la normalización de actividades génicas de células sanguíneas y para la determinación de la concentración de transcritos de sangre. Esto permite la normalización y la cuantificación relativa de las actividades de otros genes, lo que puede usarse para el diagnóstico, pronóslico, terapia y control de desarrollo.

Por consiguiente, la presente invención se basa en el objetivo de facilitar medios y procedimientos que posibiliten un punto de referencia para la diferenciación de modificaciones de expresión génica condicionada por la enfermedad y con ello un diagnóstico o control de desarrollo de la terapia.

De manera técnica de procedimiento se soluciona este objetivo mediante las características de la reivindicación 1.

El objetivo se soluciona además mediante un kit de acuerdo con la reivindicación 9 así como un uso de acuerdo con la reivindicación 10 Y mediante conjuntos de genes control de acuerdo con las reivindicaciones 11 y 12.

La invención describe la identificación de nuevos genes control de sangre, sondas de micromatriz adecuadas y cebadores para PCR y su uso, también en combinación, para la normalización de datos de expresión cuantitativos de sangre y células sanguíneas en micromatrlces, ensayos de PCR en tiempo real y otros sistemas con o sin amplificación y con distintas posibilidades de visualización para la determinación así como su uso para el diagnóstico de modificaciones condicionadas patológicamente en inflamaciones locales de distinta localización yen la reacción sistémica a continuación tal como SIRS, septicemia, septicemia grave con fallo orgánico.

En estos estudios es importante de manera decisiva la normalización de análisis de expresión génica. Para los fines 5 de la presente invención debe entenderse por normalización lo siguiente:

' Por una normalización se entiende hacer comparables las mediciones de distintas matrices o experimentos de PCR

o en particular de RT·PCR, reduciéndose o eliminándose la variabilidad técnica. Dentro de estos experimentos existe una multiplicidad de fuentes Que pueden falsificar las mediciones. Las posibles fuentes perturbadoras técnicas son una eficiencia distinta en la transcripción inversa, el marcado o las reacciones de hibridación as; como problemas con las matrices, efectos de carga en los reactivos o condiciones espeCificas de laboratorio".

El procedimiento de acuerdo con la invención está caracterizado por Que puede diferenciarse en una muestra de sangre de individuo la actividad de uno o varios genes Que van a someterse a estudio mediante detección de la 15 presencia y de la cantidad del producto génico con respecto a las cantidades de los productos génicos delos genes control enlre SIRS y septicemia.

Para ello se dan a conocer genes control y secuencias génicas de sangre y células sanguineas asl como cebadores y sondas derivados de los mismos, que pueden usarse para la determinación, visualización y normalización y 20 cuantificación de actividades génicas y transcritos. Las secuencias de las sondas de oligonucleótidos en una realización preferente están expuestas en la tabla 1 y corresponden al protocolo de secuencias adjunto de Sec ID 1 a Sec ID 7, las secuencias de cebadores usadas en la tabla 2 corresponden al protocolo de secuencias adjunto de Sec ID 8 a Sec ID 21. A este respecto, las secuencias de las sondas de oligonucleótidos pueden adoptar también otras secuencias, en una realización preferente de una longitud de 50-100 nucleótidos, que se unen específicamente a transcritos de los genes expuestos en la tabla 3 con secuencias de Sec ID 22 a Sec ID 97. La longitud de las secuencias usadas en procedimientos de amplificación tal como... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento para la normalización de una expresión de ARNm en varias muestras de sangre que comprende:

a) una comparación de los valores de expresión de uno o varios ácidos nucleicos seleccionados de SEC ID 22 a SEC ID 97 a través de distintas muestras de sangre; b) derivación de una medida de estabilidad génica para la normalización de valores de expresión de uno o varios ácidos nucleicos, seleccionados de SEC ID 22 a SEC ID 97 a través de varias muestras de sangre; y

cl una normalización de la expresión de otros ácidos nucleicos, que se aislaron de varias muestras de sangre, basándose en la etapa b) .

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que el ARNm se amplifica, en el que mediante transcripción inversa con ayuda de un cebador oligo-dT se transcribe ARNm en AONc y las cadenas de AONc

producidas de manera complementaria al ARNm usado se usan como molde para reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) .

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que los ácidos nucleicos se amplifican por medio de PCR o PCR en tiempo real.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-3, en el que los valores de expresión de los ácidos nucleicos se determinan por medio de procedimientos de hibridación.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1·4, en el que la medición de los valores de expresión de los 25 ácidos nucleicos se realiza en disolución o en ácidos nucleicos que están inmovilizados en un soporte.

6. Procedimiento segun la reivindicación 5, en el que el soporte es una micromatriz, partícula, perla, vidrio, metal o membrana.

7. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1-6, en el qve los ácidos nucleicos están acoplados al soporte de manera indirecta a través de otros componentes de unión tales como anticuerpos, anligenos, oligonucleótidos, balizas molecvlares o enzimas.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1·7, en el que los valores de expresión de los ácidos nucleicos determinados in vitro a partir de una muestra de paciente se usan como parámetro de entrada para la fabricación de software para la descripción del pronóstico individual de un paciente, para fines de diagnóstico, para decisiones de terapia y/o sistemas de gestión de dalos de pacientes.

9. Uso de ácidos nucleicos, seleccionados del grupo que está constituido por: SEC ID 22·86, 88, 92, 94 Y 97 como 40 gen control para la normalización de datos de análisis de expresión génica de muestras de sangre.

10. Uso de un conjunto de genes control para la normalización de datos de análisis de expresión génica de muestras de sangre de un paciente, en el que el conjunto de genes control comprende las siguientes secuencias de ácido nuclelco: SEC ID 32, SEC ID 38, SEC ID 64, SEC ID 82 Y SEC ID 94.

. Uso de un conjunto de genes control para la normalización de datos de análisis de expresión génica de muestras de sangre de un paciente, en el que el conjunto de genes control comprende las siguientes secuencias de ácido nuclelco: SEC ID 49, SEC ID 59, SEC ID 67, SEC ID 76 YSEC ID 95.