GENERACIÓN DE ARCHIVOS DE DATOS DE CITOMETRÍA DE FLUJO CON UN NÚMERO POTENCIALMENTE INFINITO DE DIMENSIONES DERIVADAS DE LA FUSIÓN DE UN GRUPO DE ARCHIVOS DE DATOS DE CITOMETRÍA DE FLUJO SEPARADOS Y SU RECONSTRUCCIÓN MULTIDIMENSIONAL TANTO CON DATOS DE CITOMETRÍA DE FLUJO MEDIDOS REALMENTE COMO ESTIMADOS.

Un procedimiento para la generación de nuevos archivos de datos de citometría de flujo a partir de archivos de datos originales que contienen datos de parámetros acerca de eventos medidos en diferentes partes alícuotas de la misma muestra,

en el que cada archivo de datos originales comprende datos de parámetros comunes que corresponden a parámetros medidos para todas las partes alícuotas y datos de parámetros no comunes que corresponden a parámetros medidos solo para algunas partes alícuotas, comprendiendo el procedimiento la etapa de: a) fusionar dos o más archivos de datos originales en un archivo; caracterizado por comprender además las etapas de, b) para cada evento del archivo fusionado, estimar los datos de parámetros no comunes que no fueron medidos directamente en el citómetro de flujo basándose en eventos que pertenecen a partes alícuotas para las cuales dicho parámetro no común ha sido medido por el citómetro de flujo, así como una medida de incertidumbre correspondiente, y; c) reconstruir un nuevo archivo de datos que contiene datos de parámetros medidos y datos de parámetros estimados

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E06121243.

Solicitante: UNIVERSIDAD DE SALAMANCA.

Nacionalidad solicitante: España.

Provincia: SALAMANCA.

Inventor/es: ORFAO DE MATOS CORREIA E VALE, JOSE ALBERTO, Pedreira,Carlos Eduardo, Sobral da Costa,Elaine.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 26 de Septiembre de 2006.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • G01N15/14 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 15/00 Investigación de características de partículas; Investigación de la permeabilidad, del volumen de los poros o del área superficial efectiva de los materiales porosos (identificación de microorganismos C12Q). › Investigación por medios electroópticos.

Clasificación PCT:

  • G01N15/14 G01N 15/00 […] › Investigación por medios electroópticos.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.

PDF original: ES-2360365_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere al campo de la citometría de flujo y más particularmente a la generación de nuevos archivos de datos de citometría de flujo con un número potencialmente infinito de dimensiones, teniendo cada evento individual incluido en estos nuevos archivos de datos información asociada que ha sido medida realmente o estimada, para todos los parámetros individuales evaluados. Estos nuevos archivos de datos de citometría de flujo se crean: 1) fusionando un grupo de archivos de datos de citometría de flujo separados que contienen información acerca de eventos medidos en diferentes partes alícuotas procedentes de la misma muestra; estos archivos de datos originales contienen, en común, datos acerca de uno o más parámetros, al mismo tiempo que contienen información acerca de uno o más parámetros diferentes; 2) estimando la magnitud de los valores y de una correspondiente medida de incertidumbre de las variables que difieren entre uno o más de los archivos de datos originales que han sido fusionados para cada evento individual contenido en el archivo de datos fusionado para el que esa variable no fue medida directamente en la citometría de flujo y; 3) reconstruyendo multidimensionalmente el nuevo archivo de datos que contiene tanto los datos reales medidos en la citometría de flujo para cada evento de los archivos de datos originales individuales fusionados como los datos estimados para aquellos parámetros no medidos en un grupo de eventos procedentes de cada uno de los archivos de datos originales. Esta invención permite la generación de archivos de datos que contienen información para eventos celulares individuales procedentes de una muestra acerca de un número más alto de parámetros que aquellos medidos realmente en cada uno de los archivos de datos originales fusionados; el número global de parámetros para los cuales se asignan valores a cada evento celular individual incluido en el nuevo archivo de datos solo está limitado por el número total de parámetros medidos en todo el grupo de archivos de datos fusionados. Esto permite una más potente identificación, enumeración y caracterización de diferentes poblaciones de eventos contenidos en una muestra.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Loken y Terstappen han descrito previamente en la patente de EE.UU. Nº 5.047.321, el análisis multiparamétrico de componentes celulares en un cuerpo fluido compuesto de sangre y médula ósea. Estos autores pudieron discriminar entre diversos componentes celulares de la sangre y la médula ósea, contar el número de células dentro de cada componente y proporcionar un análisis diferencial de cada uno de ellos usando una combinación de dos colorantes de ácido nucleico –el colorante de ADN LDS-751 (Exciton), el colorante de ARN naranja de tiazol (TO, Molecular Probes, Inc)– un anticuerpo monoclonal anti-CD45 marcado fluorescentemente y dos parámetros de dispersión de luz (dispersión de luz frontal y lateral). Este procedimiento permitía la identificación y diferenciación entre glóbulos rojos nucleados, eritrocitos, reticulocitos, plaquetas, linfocitos, monocitos, granulocitos neutrófilos, granulocitos basófilos, granulocitos eosinófilos, y precursores de todas las células nucleadas. A pesar de esto, no pudieron demostrar que con este procedimiento fueran capaces de diferenciar específicamente entre células normales y neoplásicas que coexisten en la misma muestra o de caracterizar además estos subconjuntos de células.

En la patente de EE.UU. Nº 6.287.791, Terstappen y Chen describían un nuevo refinamiento de la patente de EE.UU. Nº 5.047.321, pero no demostraron ninguna caracterización mejor de las diferentes poblaciones de leucocitos.

En la patente de EE.UU. Nº 02380098.0, Orfao describía un procedimiento para el análisis diferencial multidimensional de leucocitos de la sangre, la médula ósea y otros fluidos corporales, que permitía específicamente una identificación adicional de células dendríticas y sus subconjuntos, además de glóbulos rojos nucleados, linfocitos, monocitos, granulocitos neutrófilos, granulocitos basófilos, granulocitos eosinófilos y precursores de todas las células nucleadas.

A su vez, en la patente de EE.UU. Nº 5538855, Orfao describía un procedimiento que permitía un análisis más detallado de los compartimentos linfoides a través de la identificación simultánea de hasta 12 subconjuntos diferentes de células T, B y Nk en la sangre y la médula ósea entre otros tipos de muestras biológicas. El autor usó una tinción combinada para los antígenos CD3, CD19, CD56 (y/o CD16), CD4 y CD8 en una única tinción de 3 colores. Sin embargo, usando este procedimiento no pudo caracterizar más los subconjuntos de células identificados, al mismo tiempo, ni todos los subconjuntos de células no linfoides presentes en una sangre periférica normal pudieron identificarse específicamente (por ejemplo: las subpoblaciones de células dendríticas).

**(Ver fórmula)**

En ninguno de los procedimientos referidos, los procedimientos descritos permitieron directamente una caracterización más detallada de las células identificadas. En tal caso, se requiere el uso de un mayor número de tinciones asociadas con emisiones de fluorescencia distinguibles y de instrumentos de citometría de flujo capaces de medir un mayor número de emisiones de fluorescencia diferentes. En las últimas dos décadas, el número de emisiones de fluorescencia diferentes que pueden medirse simultáneamente por un citómetro de flujo ha aumentado notablemente pasando de 3 hasta 17 colores. Sin embargo, este número aún es limitado ya que frecuentemente se requieren más de 20 marcadores para una caracterización detallada de los componentes celulares presentes en diferentes muestras normales y patológicas. Como ejemplo, la evaluación del repertorio TCRVbeta de células TCRalfa-beta+ T de sangre periférica, requiere típicamente tinción para más de 20 marcadores diferentes dirigidos contra diferentes miembros de las familias de proteínas TCRVbeta; igualmente, el análisis inmunofenotípico de diagnosis rutinaria de muestras leucémicas está basado en la evaluación de los patrones de tinción de médula ósea y/o células sanguíneas para hasta varias decenas de marcadores diferentes (típicamente entre 20 y 40 antígenos). De este modo, incluso con la capacidad de medir simultáneamente 17 emisiones de fluorescencia diferentes, los instrumentos más avanzados de citometría de flujo aún tienen capacidades multicolores limitadas. Como se mencionó anteriormente, el número máximo de emisiones de fluorescencia medidas simultáneamente para un evento individual o para un grupo de eventos contenidos en un archivo de datos de citometría de flujo, depende de la disponibilidad de fluorocromos con emisiones de fluorescencia compatibles, distinguibles y del número máximo de emisiones de fluorescencia que pueden detectarse en el citómetro de flujo. Debido a tal limitación, la tinción de una muestra para un número de marcadores superior al número de emisiones de fluorescencia que el instrumento citómetro de flujo disponible es capaz de medir se hace normalmente en dos o más partes alícuotas separadas medidas una detrás de otra. Como ejemplo de tal estrategia, en la patente de EE.UU. Nº 5.137.809, Loken y Sha describían un procedimiento para un análisis multiparamétrico de componentes celulares en médula ósea. Los autores describían el uso, en una primera etapa, de una combinación de anticuerpos monoclonales marcados cada uno con un fluorocromo diferente, para teñir todos los leucocitos y de más combinaciones para teñir poblaciones seleccionadas de leucocitos, en una segunda etapa. Sin embargo, tales procedimientos no permiten vincular automáticamente y comparar directamente la información sobre la cantidad de dispersión de luz y emisiones de fluorescencia medidas para las células individuales contenidas 1) en partes alícuotas diferentes procedentes de la misma muestra, 2) en muestras diferentes derivadas de tejidos idénticos o diferentes procedentes del mismo individuo o de individuos diferentes, o; 3) en partes alícuotas de muestras diferentes que han sido medidas bajo condiciones diferentes.

Todos los procedimientos descritos anteriormente permitían la identificación de un número variable de poblaciones diferentes de leucocitos normales presentes en la sangre, la médula ósea y otras muestras y solo permiten la identificación de subpoblaciones seleccionadas de células dependiendo de la combinación específica de anticuerpos monoclonales y los colorantes de ácidos nucleicos usados; no obstante, no pudieron proporcionar un procedimiento para la identificación... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para la generación de nuevos archivos de datos de citometría de flujo a partir de archivos de datos originales que contienen datos de parámetros acerca de eventos medidos en diferentes partes alícuotas de la misma muestra, en el que cada archivo de datos originales comprende datos de parámetros comunes que corresponden a parámetros medidos para todas las partes alícuotas y datos de parámetros no comunes que corresponden a parámetros medidos solo para algunas partes alícuotas, comprendiendo el procedimiento la etapa de:

a) fusionar dos o más archivos de datos originales en un archivo;

caracterizado por comprender además las etapas de,

b) para cada evento del archivo fusionado, estimar los datos de parámetros no comunes que no fueron medidos directamente en el citómetro de flujo basándose en eventos que pertenecen a partes alícuotas para las cuales dicho parámetro no común ha sido medido por el citómetro de flujo, así como una medida de incertidumbre correspondiente, y;

c) reconstruir un nuevo archivo de datos que contiene datos de parámetros medidos y datos de parámetros estimados.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que antes de fusionar los archivos de datos originales, dos o más partes alícuotas de una muestra son teñidas por separado con un panel de anticuerpos monoclonales.

3. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que la muestra contiene células normales, células neoplásicas o una mezcla tanto de células normales como neoplásicas.

4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra contiene sangre periférica.

5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra comprende médula ósea.

6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra contiene líquido espinal.

7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra comprende ganglio linfático.

8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra comprende líquido ascítico.

9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra comprende efusión pleural.

10. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra comprende líquido sinovial.

11. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra comprende una suspensión de células individuales preparada a partir de tejido sólido.

12. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el panel de reactivos está formado por dos o más combinaciones de anticuerpos monoclonales directamente conjugados a fluorocromos.

13. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que las diferentes combinaciones de anticuerpos monoclonales conjugados a fluorocromos usadas para teñir distintas partes alícuotas de la muestra consisten en reactivos de anticuerpos monoclonales que son idénticos en todas las combinaciones y reactivos de anticuerpos monoclonales que solo se usan en una cualquiera o parte de todas las combinaciones de reactivos de anticuerpos monoclonales usadas para teñir la muestra.

14. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que cada combinación de reactivos de anticuerpos monoclonales contiene, además de los anticuerpos monoclonales, otras sondas que consisten en fluorocromos específicos para la medición de colorantes de colorantes de ácidos nucleicos, mitocondrias y otros componentes celulares y funciones celulares.

15. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que cada anticuerpo

monoclonal en cada combinación está conjugado a un fluorocromo diferente y cada combinación de anticuerpos monoclonales tiene, en común, uno o más reactivos de anticuerpos monoclonales conjugados a fluorocromos.

16. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el número de emisiones de fluorescencia en cada combinación de múltiples anticuerpos monoclonales comprende dos

**(Ver fórmula)**

o más fluorocromos diferentes, cada uno vinculado a un anticuerpo monoclonal diferente, cuya emisión de fluorescencia es distinguible de la de los otros reactivos de anticuerpos monoclonales conjugados a fluorocromos en la combinación.

17. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que una combinación de fluorocromos compatibles se selecciona de isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE), proteína peridinina clorofila (PerCP), aloficocianina, alexa flúor 488, alexa 647, alexa flúor 610, alexa 710, alexa flúor 405, cianina 5 (Cy5), cianina 5.5 (Cy5.5), azul Pacífico (PB), amarillo cascada, azul cascada y conjugados de los mismos unidos a PE, a APC, o a PerCP, puntos cuánticos o cualquier fluorocromo compatible adicional o tándem de fluorocromos.

18. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que se almacena un archivo de datos para cada parte alícuota de la muestra medida en el citómetro de flujo.

19. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que se almacena un archivo de datos que contiene datos para dos o más partes alícuotas de la muestra medidas en el citómetro de flujo.

20. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que se mide un número idéntico de eventos para cada parte alícuota de la muestra.

21. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que se miden diferentes números de eventos para cada parte alícuota de la muestra.

22. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que tanto los archivos de datos originales como el archivo de datos fusionado consisten en matrices de datos en las que cada dato de parámetro diferente medido relacionado con las características de dispersión de la luz y las emisiones de fluorescencia de una célula se coloca en una columna diferente y los datos sobre cada evento celular medido se colocan en una línea diferente.

23. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que los archivos de datos originales y los eventos contenidos en cada uno de dichos archivos de datos se pegan en una secuencia relacionada directamente con la secuencia en la que fueron medidos en el citómetro de flujo.

24. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que los archivos de datos originales y los eventos contenidos en cada uno de dichos archivos de datos se pegan en una secuencia relacionada inversamente con la secuencia en la que fueron medidos en el citómetro de flujo.

25. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que los archivos de datos originales y los eventos contenidos en cada uno de dichos archivos de datos se pegan en una secuencia que no está relacionada con la secuencia en la que fueron medidos en el citómetro de flujo.

26. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en el que la secuencia de parámetros en las columnas del archivo de datos fusionado está relacionada directamente con la secuencia en la que fueron medidos en el citómetro de flujo.

27. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en el que la secuencia de parámetros en las columnas del archivo de datos fusionado está relacionada inversamente con la secuencia en la que fueron medidos en el citómetro de flujo.

28. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, en el que la secuencia de parámetros en las columnas del archivo de datos fusionado no está relacionada con la secuencia en la que fueron medidos en el citómetro de flujo.

29. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, en el que el número global de parámetros estimados para los cuales se asignan valores a cada evento celular individual incluido en el nuevo archivo de datos fusionado es igual o inferior al número total de parámetros que difieren entre dos o más de las partes alícuotas de la muestra medidas en el citómetro de flujo.

30. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 29 en el que se usan procedimientos de estimación estadística basados en la similitud para calcular los valores y una medida de incertidumbre

correspondiente para parámetros no comunes.

31. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, en el que para calcular los valores y una medida de incertidumbre correspondiente para parámetros no comunes, se usan todos los parámetros comunes.

32. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, en el que para calcular los valores y una medida de incertidumbre correspondiente para parámetros no comunes, solo se usa una parte de los parámetros comunes.

33. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32, en el que para calcular los valores y una medida de incertidumbre correspondiente para parámetros no comunes, se usan todos los eventos del archivo de datos fusionado.

34. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32, en el que para calcular los valores y una medida de incertidumbre correspondiente para parámetros no comunes, solo se usa parte de todos los eventos del archivo de datos fusionado.

35. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, en el que el cálculo de los valores y una medida de incertidumbre correspondiente para parámetros no comunes, se realiza para eventos individuales.

36. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, en el que el cálculo de los valores y una medida de incertidumbre correspondiente para parámetros no comunes, se realiza para un grupo de dos o más eventos.

37. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36, en el que uno o más de los parámetros medidos en una o más partes alícuotas de la muestra se estiman y usan como un control de calidad interno del procedimiento de estimación.

38. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37, en el que el nuevo archivo de datos que contiene los datos medidos y los datos estimados se analiza usando programas de software de citometría de flujo convencionales.

 

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