Uso de un transformante que comprende un vector recombinante que comprende un gen que se selecciona del grupo que consiste en un polinucleótido representado por SEQ ID NO 1 y un polinucleótido que codifica para gamma-butirobetaína hidroxilasa representado por SEQ ID NO 2,

para preparar L-carnitina, que comprende la hidroxilación de la gamma-butirobetaína

Campo técnico

La presente invención se refiere al uso de un transformante que comprende un vector recombinante que comprende un polinucleótido, que codifica para -butirobetaína hidroxilasa, para preparar L-carnitina mediante la hidroxilación de -butirobetaína usando la -butirobetaína hidroxilasa codificada por el polinucleótido.

Antecedentes de la técnica

La L-carnitina (3-hidroxi-4-trimetilamino-butirato), que también se conoce como vitamina BT, es un análogo de vitamina natural que es muy importante en el metabolismo humano. Se aisló originalmente L-carnitina de tejido muscular bovino en 1905 por dos científicos rusos, Gulewitsch y Krimberg, y su estructura química se identificó en 1932. La L-carnitina se encuentra en casi todas las células del organismo y transporta ácidos grasos de cadena larga libres y activados a través de la membrana interna de la mitocondria. Debido a que la membrana mitocondrial interna es una barrera impenetrable para los ésteres de acil-CoA, los ácidos grasos de cadena larga libres, activados con ésteres de acil-CoA en el citoplasma, pasan a través de la membrana cuando se esterifican con L-carnitina. Cuando está presente L-carnitina en niveles bajos en los músculos esqueléticos, hígado, corazón y riñones, los ácidos grasos de cadena larga libres son difíciles de utilizar como fuente de energía. Este metabolismo anómalo de la carnitina provoca diversas enfermedades, incluyendo retraso del crecimiento, miocardiopatía y debilidad muscular. Cuando no se sintetiza L-carnitina en cantidades adecuadas en el organismo, la carnitina debe absorberse de los alimentos para evitar síntomas de deficiencia de carnitina. Especialmente en lactantes que no pueden biosintesizar L-carnitina, la L-carnitina es un nutriente esencial.

La L-carnitina se usa como componente activo en preparaciones farmacéuticas. Se requiere complementación exógena de L-carnitina para tratar la deficiencia de carnitina y otras enfermedades, especialmente enfermedades cardíacas. Recientemente, este uso terapéutico de la L-carnitina se ha hecho cada vez más importante (R. A. Frenkel y J. D. Mc Garry, “Carnitine biosyntheis, metabolism and functions”, Academic Press, 1980).

Se ha identificado que la L-carnitina desempeña muchos papeles importantes en el organismo. Sin embargo, los métodos convencionales incluyendo la extracción biológica no son adecuados para la producción en masa de L-carnitina. Un método que puede facilitar la obtención de L-carnitina es utilizar DL-carnitina incluyendo isómeros ópticos. Este método provoca efectos secundarios en el organismo debido a que contiene D-carnitina (Curr. Ther. Res. 28, 195-198, 1980). En muchos casos, la D-carnitina compite con la L-carnitina en el organismo e interrumpe la beta-oxidación mitocondrial de ácidos grasos de cadena larga libres. En pacientes que tienen una función renal notablemente reducida, este metabolismo alterado de ácidos grasos de cadena larga conduce a una inhibición más grave.

Se han realizado muchos esfuerzos para obtener L-carnitina ópticamente pura, que incluyen un método químico de resolución óptica (patente estadounidense n.o 5.166.426), un método biológico que usa microorganismos

o enzimas (patente estadounidense n.o 5.187.093) y un método de producción de L-carnitina usando un compuesto quiral como compuesto de partida (patente estadounidense n.o 6.420.599 B2).

Entre los diversos métodos para obtener L-carnitina, un método biológico que usa microorganismos o enzimas emplea una enzima biológica, gamma-butirobetaína hidroxilasa, para producir L-carnitina ópticamente activa. Se aisló esta enzima en ratones y seres humanos (Rebouche y Engel, J Biol Chem 255:8700-8705, 1980), y se identificó su secuencia de nucleótidos. Los organismos superiores incluyendo los mamíferos utilizan un residuo de aminoácido de proteínas, lisina, como precursor para la biosíntesis de L-carnitina, mientras que Neurospora crassa produce L-carnitina ópticamente pura a partir de lisina libre (Fraenkel, Biol Bull, 104:359-371, 1953). El mecanismo de la biosíntesis de L-carnitina es en resumen tal como sigue. La síntesis de carnitina comienza con la metilación de la lisina mediante S-adenosilmetionina que actúa como donador de metilo, dando como resultado la formación de -N-trimetil-lisina. La trimetil-lisina se transforma enzimáticamente en -hidroxi-trimetil-lisina. A partir de la -hidroxi-trimetil-lisina sintetizada, se forma el trimetilaminobutilaldehído, y se convierte entonces en butirobetaína.

Galagan et al. enseñan la secuencia completa del genoma de Neurospora crassa incluyendo una secuencia que codifica para una proteína no caracterizada supuesta, que tiene una secuencia representada por SEQ ID NO.2. Sin embargo, no se enseña que esta proteína tenga alguna actividad -butirobetaína hidroxilasa (-BBH) (Galagan J.

E. et al., Nature, 422:859-868, 2003).

La patente estadounidense 4.371.618 A da a conocer que puede producirse L-carnitina usando los productos de liberación de Neurospora crassa y que las esporas de Neurospora crassa comprenden gammabutirobetaína hidroxilasa.

Una secuencia de nucleótidos que codifica para -butirobetaína hidroxilasa, derivada de Neurospora crassa y que produce L-carnitina usando -butirobetaína, producida a través del mecanismo anteriormente mencionado, como precursor, no ha se ha identificado antes de la presente invención.

Descripción de la invención

Basándose en estos antecedentes, los presentes inventores identificaron un gen que codifica para butirobetaína hidroxilasa derivada de Neurospora crassa, y produjeron con éxito L-carnitina a partir de butirobetaína mediante un método biológico empleando -butirobetaína hidroxilasa expresada usando el gen.

Breve descripción de los dibujos

Los anteriores y otros objetos, características y otras ventajas de la presente invención se entenderán más claramente a partir de la siguiente descripción detallada tomada en conjunto con los dibujos adjuntos, en los que:

La figura 1 muestra los resultados de SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida) de sobrenadantes de centrífuga de lisados celulares de Escherichia coli (E. coli) BL21 que no contiene el gen de -butirobetaína hidroxilasa (-BBH) y E. coli BL21 que contiene el gen de -BBH e inducido por IPTG (isopropil--Dtiogalactopiranósido);

La figura 2 muestra los resultados de una electroforesis en gel de agarosa al 0,8% de un gen de ADNc de BBH clonado en pT7-7;

La figura 3 es una alineación de secuencias múltiple en el que se alinea una secuencia de aminoácidos de -BBH de Neurospora crassa frente a la del ser humano, rata y -BBH derivada de Pseudomonas;

La figura 4 es una presentación esquemática de un plásmido pT7-BBH2; y

La figura 5 es un diagrama esquemático de un procedimiento de producción de L-carnitina a partir de butirobetaína.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

En un aspecto, la presente invención se proporciona el uso de un transformante según la reivindicación 1.

Con el fin de obtener un gen que codifique para -butirobetaína hidroxilasa derivada del hongo filamentoso Neurospora crassa, los presentes inventores compararon en primer lugar genes heterogéneos que codifican para butirobetaína hidroxilasa para encontrar regiones conservadas. Se realizó una búsqueda de homología entre las regiones conservadas y las secuencias génicas completas de N. crassa, registradas en la base de datos de genes. A partir de genes que tienen secuencias parcialmente similares, se seleccionó un gen candidato que mostraba actividad -butirobetaína hidroxilasa. Con el fin de clonar el gen candidato, se sintetizaron cebadores específicos para el gen. Se preparó una biblioteca de ADNc de Neurospora crassa y se examinó para detectar el gen diana usando los cebadores sintetizados. Se insertó el clon de ADNc así obtenido en un vector apropiado. Se transformó el vector recombinante resultante en Escherichia coli, y se encontró que la clonación del gen fue exitosa mediante experimentos usando el transformante. Se indujo la expresión de la proteína del gen portado por el vector recombinante mediante tratamiento con IPTG y se analizo mediante SDS-PAGE.... [Seguir leyendo]

1. Uso de un transformante que comprende un vector recombinante que comprende un gen que se selecciona del grupo que consiste en un polinucleótido representado por SEQ ID NO 1 y un polinucleótido que codifica para gamma-butirobetaína hidroxilasa representado por SEQ ID NO 2, para preparar L-carnitina, que comprende la hidroxilación de la gamma-butirobetaína.

2. Uso de un transformante según la reivindicación 1, en el que el transformante es Escherichia coli.

3. Uso de un transformante según la reivindicación 2, en el que el transformante es Escherichia coli KCCM10557.