Fragmentos peptídicos del factor HARP que inhiben la angiogénesis.

Péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada de entre:

- la secuencia 13-39 del factor HARP (residuos 13 a 39 5 de SEC ID nº 1); y

- la secuencia 65-97 del factor HARP (SEC ID nº 3).

Fragmentos peptídicos del factor HARP que inhiben la angiogénesis.

La presente invención se refiere a unos fragmentos peptídicos de la proteína HARP que inhiben la angiogénesis.

La terapia actual del cáncer se basa en la radioterapia, la cirugía, a veces muy incapacitante y/o la utilización de fármacos anticancerosos que bloquean las mitosis y que pueden ser muy agresivos, limitando a veces sus usos. No existe actualmente ninguna terapia universal contra esta patología. El papel de la angiogénesis en el crecimiento tumoral ha constituido el objeto de intensas investigaciones y se admite ahora por toda la comunidad científica que el crecimiento tumoral no se puede realizar sin angiogénesis. Este mecanismo se define como un proceso dinámico inducido por un cierto número de factores angiogénicos de los cuales los principales son: el "vascular endothelial growth factor" (VEGF) , el "fibroblast growth factor" (FGF) o el "heparin affin regulator y peptide" (HARP) que están en varios casos sobreexpresados por los tumores en sí. Puesto que un tumor no se puede desarrollar sin neovascularización, la supresión o la inhibición de los factores angiogénicos debe conducir a una regresión del crecimiento tumoral, sea cual sea el tipo de tumor. Hoy en día, varias compañías desarrollan en el tratamiento del cáncer o de las enfermedades proliferativas, una estrategia anti-angiogénesis basada por ejemplo o bien sobre unos inhibidores de factores angiogénicos (o de sus receptores cuando estos están identificados) , o bien induciendo unas micro-trombosis vasculares utilizando la célula endotelial como anclaje de catalizadores de la trombosis, o también utilizando unos agentes peptídicos que inhiben la angiogénesis mediante unos mecanismos no siempre identificados. Estos enfoques no han desembocado todavía en resultados claros y parece que los inhibidores basados en el bloqueo de una sola vía de la angiogénesis inducen unos efectos rebotes agravantes. Estos resultados conducen actualmente a estas compañías a proponer unos cócteles de inhibidores que permiten esperar una destrucción radical y simultánea de los vasos y de las células tumorales.

El papel angiogénico del factor HARP se ha demostrado a través de un conjunto de experimentos realizados in vivo e in vitro (Papadimitriou et al. 2001; Papadimitriou et al., 2000) . Así, en un modelo in vitro en el que se inoculan unas células endoteliales sobre un gel de colágeno, se ha demostrado que la HARP es capaz de inducir a la formación de seudo-capilares que imitan así las primeras etapas de la angiogénesis, es decir la activación de las células endoteliales y su migración a través de una matriz extracelular parcialmente destruida. Reforzando esta observación, un péptido sintético de 43 aminoácidos que corresponde a una parte del dominio C-terminal de la HARP es capaz de estimular la secreción del activador del plasminógeno por unas células endoteliales de aorta de buey (ABAE) y de inhibir la secreción de su inhibidor PAI-1 (Kojima et al., 1995a; Kojima et al., 1995b) . Este activador induce a la división del plasminógeno en plasmina, una proteasa que desempeña un papel clave en la degradación de la matriz extracelular. La HARP comparte esta propiedad con otra proteína que se une a la heparina (Matsubara et al., 1990) : la proteína Midkina (MK) que presenta el 50% de homología de secuencia en aminoácidos con la que constituye una nueva familia de HBGF (Tsutsui et al., 1991) .

El papel desempeñado por la HARP en la angiogénesis tumoral se ha subrayado también por el equipo de Roy Bicknell. Así, la sobreexpresión de HARP en unas células de carcinoma mamario MCF7 inyectadas a unos ratones "atímicos" conlleva un aumento del tamaño del tumor con respecto a los obtenidos sin sobreexpresión. El aumento del tamaño del tumor está relacionado con la densidad vascular y con una multiplicación de las células endoteliales (Choudhuri et al., 1997) . La proliferación de las células endoteliales es otra etapa clave de la angiogénesis en la que la HARP podría desempeñar un papel crucial. En efecto, a partir de 1991, se ha demostrado que la HARP estimulaba la proliferación de las células endoteliales in vitro (Courty et al., 1991) . Esta actividad mitógena ha podido ser puesta en evidencia en otros modelos: HARP estimula in vitro la formación en agar blando de colonias de células epiteliales SW13 no tumorígenas (Fang et al., 1992) y la sobreexpresión de su ADNc en las células NIH 3T3 (Chauhan et al., 1993) o SW-13 (Fang et al., 1992) induce a la formación de un tumor en el ratón "atímico". Este papel mitogénico está reforzado por la expresión de la molécula en numerosos cánceres. Utilizando unos ensayos de protección con ARNAsa y/o la técnica de transferencia Northern, los ARNm de la HARP se han detectado en las líneas celulares procedentes de cánceres de pecho (T47 Dco, MDA-MB231, MDA-MB361, Hs-578T) (Fang et al., 1992) , de ovario (A1827, PA-1) (Riegel et al., 1994) , de próstata (PC-3) (Vacherot et al., 1999a) y de pulmón (Jager et al., 1997) .

In vivo, en diferentes modelos tisulares, la localización de la HARP está asociada en particular a las células endoteliales de los capilares sanguíneos. Un ARNm de la proteína HARP se ha puesto en evidencia al nivel de las células endoteliales que pertenecen a los capilares sanguíneos de próstata y de glándulas mamarias humanas (Vacherot et al., 1999a; Ledoux et al., 1997) . En el modelo uterino de rata, se ha puesto en evidencia asimismo un aumento del porcentaje de ARNm y de la proteína HARP asociada a la fase progestativa del ciclo. Este resultado se ha confirmado mediante la inyección de progesterona en unas ratas ovariectomizadas. La sobreexpresión inducida por la progesterona es detectable en las células endoteliales capilares del endometrio (Milhiet et al., 1998) . La presencia de la proteína HARP en la superficie de las células endoteliales se ha demostrado asimismo indirectamente durante inyecciones intravenosas de heparina en el ser humano (Novotny et al., 1993) . Recientemente, el grupo de Deuel ha puesto en evidencia un aumento de la expresión del ARNm de la HARP en los microvasos en desarrollo después de una isquemia cerebral en la rata (Yeh et al., 1998) . Los factores de crecimiento HARP y Midkina (MK) son unas moléculas que presentan el 50% de homología y que poseen unas propiedades

mitógenas sobre unas células epiteliales, fibroblásticas y endoteliales. La expresión de cada uno de éstos factores de crecimiento (ARNm, proteína) se ha puesto en evidencia en unos tumores humanos de origen variado (seno, pulmón, ovario, neuroblastoma, estómago, colon) , lo cual sugiere su papel potencial durante la progresión tumoral. Pocos estudios clínicos han evaluado la coexpresión de HARP y de MK, y en particular el porcentaje sanguíneo de estas moléculas angiogénicas en unos pacientes portadores de tumores. Recientemente, se ha desarrollado una dosificación inmunológica para estas dos moléculas, basada en su afinidad con la heparina. La sensibilidad del método es de 80 pg/ml para la HARP y de 40 pg/ml para la MK (Stoica et al., 2001) .

La patente US nº 5.641.743 y la patente US nº 6.103.880 describen de manera general la proteína HARP y la utilización de esta proteína para estimular la angiogénesis.

La solicitud de patente FR 2 799 465 da a conocer un fragmento de HARP con actividad angiogénica.

Se ha demostrado en efecto que la actividad angiogénica de HARP se encontraba a través de un péptido más pequeño. Una secuencia consensual de 18 aminoácidos resultante de la secuencia peptídica de HARP pero que también se encuentra sobre un gran número de factores angiogénicos, posee así por sí misma una actividad angiogénica.

Como la mayoría de los factores de crecimiento, el mecanismo de acción de HARP pasa por una interacción con un receptor membranario con actividad tirosina-quinasa de alta afinidad (KD = 50 pM) denominado "anaplastic lymphoma kinase" o ALK (Stoice et al., 2001) .

Además, la actividad biológica de HARP, como la mayoría de los HBGF, depende también de su interacción con unos glicoaminoglicanos o GAG, de tipo heparanos o condroitina sulfatos (Vacherot et al., 1999b) .

Así, la actividad mitógena de la HARP está potencializada en presencia de heparina, de heparano sulfato y de condroitina sulfato de tipo A y B. Un tratamiento celular con heparinasa invalida la actividad mitógena de la HARP. Esta actividad puede entonces ser restaurada en presencia de heparina. Un estudio que se basa en las relaciones entre la estructura... [Seguir leyendo]

1. Péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada de entre:

- la secuencia 13-39 del factor HARP (residuos 13 a 39 de SEC ID nº 1) ; y

- la secuenci.

6. 97 del factor HARP (SEC ID nº 3) .

2. Péptido según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho péptido consiste en los residuos 13 a 39 de la secuencia SEC ID nº 1.

3. Péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos por lo menos 80% idéntica a la secuencia SEC ID nº 2 o nº 3, y que presenta una actividad de inhibición de la angiogénesis, y una capacidad para fijarse a los glicoaminoglicanos (GAG) .

4. Péptido según la reivindicación 3, cuya secuencia difiere de la secuencia SEC ID nº 2 o nº 3 por la sustitución conservativa de por lo menos un aminoácido.

5. Ácido nucleico que consiste en una secuencia que codifica para un péptido tal como el definido en una de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Ácido nucleico según la reivindicación 5, que consiste en la secuencia SEC ID nº 5 o SEC ID nº 6.

7. Procedimiento de producción de un péptido tal como el definido en una de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende la síntesis de dicho péptido por vía química.

8. Procedimiento de producción de un péptido tal como el definido en una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que un vector que contiene un ácido tal como el definido en una de las reivindicaciones 5 o 6, se transfiere a una célula hospedante que se cultiva en unas condiciones que permiten la expresión del péptido correspondiente.

9. Composición farmacéutica que comprende un péptido tal como el definido en una de las reivindicaciones 1 a 4, y uno o varios excipientes farmacéuticamente aceptables.

10. Composición según la reivindicación 9, que comprende además un péptido que tiene la secuencia de aminoácido.

11. 136 del factor HARP o un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos por lo menos 80% idéntica a la secuencia SEC ID nº 4, y que presenta una actividad de inhibición de la angiogénesis, y una capacidad para fijarse al receptor ALK.

11. Composición según la reivindicación 10, que comprende:

- el péptido que consiste en los residuos 13 a 39 de la secuencia SEC ID nº 1;

- el péptid.

6. 97 de secuencia SEC ID nº 3; y

- el péptid.

11. 136 de secuencia SEC ID nº 4.

12. Composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico que consiste en una secuencia que codifica para un péptido tal como el definido en unas de las reivindicaciones 1 a 4.

13. Composición según la reivindicación 12, que comprende además un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica para un péptido tal como el definido en la reivindicación 10.

14. Composición según la reivindicación 13, que comprende:

- un ácido nucleico que codifica para el péptido que consiste en los residuos 13-39 de la secuencia SEC ID nº 10;

- un ácido nucleico que codifica para el péptid.

6. 97 de secuencia SEC ID nº 3;

- un ácido nucleico que codifica para el péptid.

11. 136 de secuencia SEC ID nº 4.

15. Composición según la reivindicación 13 o 14, en la que dichos ácidos nucleicos son llevados por un único vector.

16. Péptido tal como el definido en una de las reivindicaciones 1 a 4, para su utilización en el tratamiento de una patología asociada a una angiogénesis seleccionada de entre un tumor, una lesión ocular, la poliartritis reumatoide y una enfermedad de piel.

17. Péptido según la reivindicación 16, en el que el péptido tal como el definido en una de las reivindicaciones 1 a 4, está asociado a un péptido que tiene la secuencia de aminoácido.

11. 136 del factor HARP o a un péptido que

consiste en una secuencia de aminoácidos por lo menos 80% idéntica a la secuencia SEC ID nº 4, y que presenta una actividad de inhibición de la angiogénesis, y una capacidad para fijarse al receptor ALK.

18. Ácido nucleico tal como el definido en una de las reivindicaciones 5 o 6, para su utilización en el tratamiento de

una patología asociada a una angiogénesis seleccionada de entre un tumor, una lesión ocular, la poliartritis reumatoide y una enfermedad de la piel.

19. Ácido nucleico según la reivindicación 18, en el que el ácido nucleico tal como el definido en una de las

reivindicaciones 5 o 6, está asociado a un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica para un 10 péptido tal como el definido en la reivindicación 10.