Formulación de proteínas.

Una composición acuosa que comprende una metaloproteína cuya actividad biológica y/o estructura tridimensional dependen de la retención de un ión de calcio en un sitio de unión en la proteína, y también

(i) comprende iones de calcio a una concentración de 0,01 a 20 mM;

(ii) comprende ligandos débiles que tienen una constante de estabilidad para un complejo con ión de calcio de log K< 0,5; y

(iii) está exenta de ligandos de fuerza media que tienen una constante de estabilidad para un complejo con ión de calcio de log K de entre 0,5 y 2; y

(iv) está exenta de ligandos fuertes que tienen una constante de estabilidad para un complejo con ión de calcio de log K >2; o comprende tal ligando fuerte a una concentración no mayor que la concentración total de los iones de calcio;

cuya composición comprende un sistema tampón basado en TRIS e ión benzoato como ligandos débiles, en la que todas las constantes de estabilidad se miden a 25 °C.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2009/055317.

Solicitante: Arecor Limited.

Nacionalidad solicitante: Reino Unido.

Dirección: 2 Cambridge Science Park Cambridge CB4 0FE REINO UNIDO.

Inventor/es: JEZEK,JAN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/96 (Estabilización de una enzima por formación de un aducto o de una composición; Formación de conjugaciones de enzimas)

PDF original: ES-2476790_T3.pdf

 

google+ twitter facebook

Fragmento de la descripción:

Formulaciïn de proteïnas Campo de la invenciïn Esta invenciïn se refiere a la estabilidad de las proteïnas, en particular a la estabilidad de las metaloproteïnas que pueden unir iones de calcio en su estructura tridimensional, en particular a la estabilidad de tales proteïnas en sistemas acuosos, por ejemplo en disoluciïn acuosa, en forma de gel acuoso o en un estado que no es lïquido, tal

como en estado sïlido en el que hay presente agua libre o retenida, p.ej. en estado congelado o tras la eliminaciïn parcial de agua, tal como mediante secado o liofilizaciïn.

Antecedentes de la invenciïn Muchas molïculas biolïgicas y sistemas supramoleculares, por ejemplo las proteïnas, las partïculas similares a virus o los virus atenuados, son inestables y son susceptibles a la degradaciïn estructural y la pïrdida consiguiente de actividad mientras estïn almacenados, en particular en disoluciones acuosas. Los procesos implicados en la degradaciïn de proteïnas se pueden dividir en fïsicos (es decir, procesos que afectan a las interacciones no covalentes, tales como la pïrdida de estructura cuaternaria, terciaria o secundaria, la agregaciïn, adsorciïn superficial) y quïmicos (es decir, procesos que implican un cambio covalente, tales como la desamidaciïn, oxidaciïn, alteraciïn de puentes disulfuro, etc.) . Las velocidades de los procesos de degradaciïn en general son proporcionales a la temperatura. Las molïculas biolïgicas y los sistemas supramoleculares, por lo tanto, en general son mïs estables a temperaturas inferiores.

Las metaloproteïnas son una clase de proteïnas que contienen uno o mïs iones metïlicos en su estructura. El iïn metïlico puede ser parte de un componente quïmico mïs complejo (p.ej. grupo hemo) que estï unido en la estructura de la proteïna. De manera alternativa, el iïn metïlico puede estar unido directamente a una o mïs cadenas laterales de los aminoïcidos en la estructura de la proteïna por medio de diversas interacciones no covalentes (interacciones de coordinaciïn, puentes de hidrïgeno, interacciones electrostïticas, etc.) . Aunque en ciertos casos el metal puede ser esencial para la actividad biolïgica de la proteïna, en otros casos desempeïa solamente un papel estructural. Aunque en ciertos casos, por ejemplo en la molïcula de Factor VIII, el metal forma un puente entre dos subunidades de la proteïna, en otros casos, por ejemplo en el antïgeno protector recombinante del carbunco, el metal se halla encerrado en una subunidad. Es probable que la pïrdida del metal de la estructura de la proteïna afecte a la funciïn y/o la estructura de la proteïna. Dependiendo de la posiciïn del metal en la molïcula de proteïna, la pïrdida del metal puede conducir a la separaciïn fïsica de dominios clave o a cambios conformacionales en un dominio. Por lo tanto, para mantener la estructura nativa de la proteïna, es muy importante mantener la proteïna en una formulaciïn en la que se mantengan ïptimamente las interacciones de uniïn entre el metal y la estructura de aminoïcidos de la proteïna.

El documento WO2007/109221 describe un mïtodo para reducir la agregaciïn de una proteïna en una formulaciïn de proteïnas que comprende aïadir metionina a la formulaciïn a una concentraciïn de alrededor de 0, 5 mM a alrededor de 145 mM.

Smith et al (1990) J Biol Chem 265 (22) 13335-13343 describe una disoluciïn que contiene peroxidasa de rïbano 45 recombinante que incluye TRIS-HCl, EDTA y CaCl2 (vïase la Tabla 1) .

Josic et al (1994) J Chromatograph B 662, 181-190 describe una disoluciïn de purificaciïn de Factor VIII que comprende TRIS-HCl, CaCl2, lisina y NaCl (vïase la pïg. 184, columna de la izquierda) .

Gwinn et al (2006) Protein Expression and Purification 45, 30-36 describe la purificaciïn del antïgeno protector de Bacillus anthracis.

Shi et al (2008) Biotechnol. Lett. 30, 181-186 describe la purificaciïn de catalasa secretora recombinante de Bacillus subtilis.

Sekiya et al (1995) J Biol Chem 270 (24) 14325-14331 describe una disoluciïn acuosa de Factor IX humano que comprende TRIS-HCl, NaCl, BSA y diversas concentraciones de iones Mg2+ y Ca2+.

Sumario de la invenciïn 60 La presente invenciïn se basa en el descubrimiento de varios aspectos deseables de las formulaciones de proteïnas, en particular la estabilidad de las metaloproteïnas que pueden unir iones de calcio en su estructura tridimensional. La puesta en prïctica de algunos o todos estos aspectos da como resultado una estabilizaciïn considerable de esas molïculas durante el almacenamiento.

Descripciïn de la invenciïn Existen varias subclases de metaloproteïnas. Una subclase importante son las proteïnas que contienen el iïn de calcio (Ca2+) en su estructura terciaria. Estas proteïnas a menudo tienen funciones biolïgicas importantes. Los ejemplos de proteïnas que contienen calcio comercialmente importantes incluyen algunos de los factores sanguïneos implicados en la cascada de la coagulaciïn sanguïnea (p.ej., Factor VIII, Factor VIIa) , diversas glucosidasas, antïgeno protector recombinante del carbunco (rPA) , ciertas peroxidasas, etc. Otra subclase de metaloproteïnas son las proteïnas que contienen grupo hemo, tales como catalasa o peroxidasa. En estos casos el metal (hierro) estï unido en una estructura mïs compleja (grupo hemo) , que a su vez estï unido en la estructura terciaria de la proteïna. Otros diversos metales pueden ser una parte esencial de la estructura de la proteïna, tales como zinc, cobre o magnesio.

Los detalles exactos de las interacciones entre los iones metïlicos y los residuos de aminoïcidos en la estructura terciaria de una proteïna se pueden obtener muy fïcilmente de diversos recursos disponibles de dominio pïblico, tales como el Banco de Datos de Proteïnas (http://pdbbeta.rcsb.org/pdb/home/home.do) . Asï, por ejemplo, la siguiente informaciïn se puede obtener de la pïgina de Internet del banco de datos de proteïnas con respecto al antïgeno protector recombinante del carbunco (Petosa et al.: Anthrax protective antigen; cïdigo 1ACC) . Cada molïcula de rPA contiene dos iones de calcio. Los iones de calcio se unen a varias cadenas laterales de aminoïcidos en uno de los cuatro dominios de la molïcula rPA. Las interacciones de uniïn son de naturaleza no covalente, e incluyen puentes de hidrïgeno, interacciones electrostïticas e interacciones de coordinaciïn. Se han identificado interacciones de iones de calcio con las cadenas laterales de los aminoïcidos siguientes en el dominio de rPA: Asp177, Asp179, Asn180, Asp181, Asp185, Glu188, Ser222, Glu224, Lys225 y Asp235. Los aminoïcidos con grupos carboxïlicos en sus cadenas laterales, es decir, Aspartato (Asp) o Glutamato (Glu) , parecen ser especialmente eficaces formando interacciones de uniïn con el iïn de calcio en las estructuras de la proteïna debido a su carga y a varios pares de electrones libres disponibles.

Una formulaciïn tïpica de una molïcula biolïgica o sistema supramolecular (p.ej. una proteïna terapïutica o una vacuna) contiene un tampïn (por ejemplo fosfato o citrato) y en general uno o mïs de los componentes siguientes: modificadores de la tonicidad (en general, sales inorgïnicas o aminoïcidos) , tensioactivos (por ejemplo, Polisorbato 80) y carbohidratos o polialcoholes (por ejemplo, sacarosa) . Ciertas formulaciones comerciales de proteïnas que contienen calcio comprenden el catiïn de calcio, en general en forma de cloruro cïlcico. Asï, por ejemplo, Kongenate, uno de los productos de factor VIII recombinante disponible comercialmente, contiene cloruro cïlcico 2 3 mM, junto con histidina (18 -23 mM) , glicilglicina (21 - 25 g/L) , sacarosa (0, 9 -1, 3%) y polisorbato 80 (35 μg/mL) . Este ejemplo demuestra que en general se aprecia la importancia... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una composiciïn acuosa que comprende una metaloproteïna cuya actividad biolïgica y/o estructura tridimensional dependen de la retenciïn de un iïn de calcio en un sitio de uniïn en la proteïna, y tambiïn 5

(i) comprende iones de calcio a una concentraciïn de 0, 01 a 20 mM;

(ii) comprende ligandos dïbiles que tienen una constante de estabilidad para un complejo con iïn de calcio de log K < 0, 5; y

(iii) estï exenta de ligandos de fuerza media que tienen una constante de estabilidad para un complejo con 10 iïn de calcio de log K de entre 0, 5 y 2; y

(iv) estï exenta de ligandos fuertes que tienen una constante de estabilidad para un complejo con iïn de calcio de log K > 2; o comprende tal ligando fuerte a una concentraciïn no mayor que la concentraciïn total de los iones de calcio;

cuya composiciïn comprende un sistema tampïn basado en TRIS e iïn benzoato como ligandos dïbiles, en la que todas las constantes de estabilidad se miden a 25 ïC.

2. Una composiciïn segïn la reivindicaciïn 1, que comprende un ligando fuerte a una concentraciïn no mayor

que la concentraciïn total de los iones de calcio, por lo que el ligando fuerte no estï disponible en forma libre. 20

3. Una composiciïn segïn la reivindicaciïn 2, en la que la concentraciïn del ligando fuerte es < 1 mM.

4. Una composiciïn segïn la reivindicaciïn 3, en la que la concentraciïn del ligando fuerte es < 0, 1 mM.

5. Una composiciïn segïn cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en la que el ligando fuerte es EDTA.

6. Una composiciïn segïn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la concentraciïn de dichos iones de calcio es 0, 05 a 10 mM.

7. Una composiciïn segïn la reivindicaciïn 6, en la que la concentraciïn de dichos iones de calcio es 0, 2 a 5 mM.

8. Una composiciïn segïn cualquier reivindicaciïn precedente, que comprende ademïs un polialcohol o un carbohidrato.

9. Una composiciïn acuosa segïn la reivindicaciïn 1, que tiene un pH de alrededor de 6, 5, que comprende factor VIII de la coagulaciïn sanguïnea y los aditivos siguientes:

(i) un sistema tampïn que comprende TRIS e iïn benzoato,

(ii) una fuente de iïn de calcio a una concentraciïn de 1 a 20 mM, 40 (iii) cloruro sïdico a una concentraciïn de 50 mM a 1 M,

(iv) polisorbato 80.

10. Una composiciïn acuosa segïn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para el uso en la terapia.

11. Una composiciïn acuosa segïn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 que es una composiciïn farmacïutica.

12. Un recipiente sellado que contiene una composiciïn segïn cualquier reivindicaciïn precedente.

13. Un recipiente segïn la reivindicaciïn 12, que incluye un espacio de cabeza que asegura la eliminaciïn parcial o 50 sustancial de los gases disueltos de la composiciïn.

14. Un recipiente segïn la reivindicaciïn 13, en el que el espacio de cabeza contiene nitrïgeno o un gas noble.