Método de preparación de una variante de la enzima fitasa, comprendiendo dicho método las siguientes etapas secuenciales:

a) seleccionar al menos una enzima fitasa madre, en donde la al menos una enzima fitasa madre es un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en:

un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se presenta en la SEQ ID n.º 3 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80% con ésta;

un polipéptido que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248;

un polipéptido que se puede obtener mediante la expresión de la SEQ ID n.º 2 o una secuencia nucleotídica que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248 o una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con ésta; y

un polipéptido que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248 y en donde el péptido se obtiene mediante la expresión de la SEQ ID n.º 2 o de una secuencia de nucleótidos que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248 o de una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con ésta,

en donde dicho polipéptido tiene actividad fitasa, en donde dicho polipéptido tiene una actividad específica de al menos 300 U/mg, en donde dicha actividad específica se determina mediante la incubación de dicho polipéptido en una solución que contiene fitato a 2 mM, CaCl2 a 0,8 mM en tampón de acetato de sodio a 200 mM a pH 3,5, a una temperatura de 37 °C;

b) generar al menos una variante de fitasa mediante la introducción de al menos una alteración de dicha enzima fitasa madre que es una inserción, una deleción o una sustitución o combinación de las mismas, de un resto aminoacídico en dicha enzima fitasa madre para obtener al menos una variante de la enzima fitasa;

c) escrutar en busca de dicha al menos una variante de la enzima fitasa para identificar una variante de la enzima fitasa mejorada que, en comparación con la enzima fitasa madre, tiene al menos una o varias propiedades mejoradas seleccionadas entre:

i. mayor termoestabilidad; y/o

ii. mayor actividad específica; y/o 30

iii. mayor estabilidad proteolítica;

d) preparar dicha variante mejorada de la enzima fitasa

Fitasas.

La presente descripción se refiere a las fitasas, secuencias nucleotídicas para las mismas, métodos de producción de fitasas y su uso.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo de las enzimas para aditivos de productos alimenticios. Más específicamente, la presente invención se refiere a las fitasas que se pueden utilizar para mejorar la digestión del fosfato de los alimentos y de los piensos para consumo animal.

ANTECEDENTES TÉCNICOS Y TÉCNICA PREVIA

El fitato es la principal forma de almacenamiento del fósforo en los cereales y en las legumbres. Sin embargo, los animales monogástricos, tales como el cerdo, las aves de corral y los peces, no son capaces de metabolizar ni absorber el fitato (o ácido fítico) y, por consiguiente, se excreta, lo que conduce a la contaminación fosfórica en las áreas de producción intensiva de ganado. Además, el ácido fítico también actúa como un antinutriente en los animales monogástricos al quelar los metales tales como calcio, cobre y cinc.

Para proporcionar fosfatos suficientes para el crecimiento y la salud de estos animales, se les añade el fosfato inorgánico en la dieta. Tal adición puede ser costosa e incrementa adicionalmente los problemas de contaminación.

Mediante la acción de la fitasa, el fitato se hidroliza por lo general para dar fosfatos de inositol inferiores y fosfato inorgánico. Las fitasas son útiles como aditivos en los piensos para consumo animal porque mejoran la disponibilidad del fósforo orgánico para el animal y disminuyen la contaminación fosfórica del medio ambiente (Wodzinski, R. J., Ullah A. H., Adv. Appl. Microbiol. 42, 263-302 (1996) ) .

En la bibliografía se han descrito una serie de fitasas de origen fúngico (Wyss M. et al. Appl. Environ. Microbiol. 65 (2) , 367-373 (1999) ; Berka R. M. et al. Appl. Environ. Microbiol. 64 (11) , 4423-4427 (1998) ; Lassen S. et al. Appl. Environ. Microbiol. 67 (10) , 4701-4707 (2001) ) y bacteriano (Greiner R. et al., Arch. Biochem. Biophys. 303 (1) , 107113 (1993) ; Kerovuo et al., Appl. Environ. Microbiol. 64 (6) , 2079-2085 (1998) ; Kim H. W. et al. Biotechnol. Lett. 25, 1231-1234 (2003) ; Greiner R. et al. Arch. Biochem. Biophys. 341 (2) , 201-206 (1997) ; Yoon S. J. et al., Enzyme and microbioal technol. 18, 449-454 (1996) ; Zinin N. V. et al., FEMS Microbiol. Lett. 236, 283-290 (2004) ) .

Por ejemplo, las enzimas fitasa mutantes de E. coli y las variantes naturales de las mismas se conocen a partir de la patente internacional WO 2004/015084, y las fitasas producidas por Citrobacter braakii se conocen a partir de la patente internacional WO2004/085638. Se han dado a conocer otras fitasas bacterianas mediante métodos de muestreo y escrutinio (Zinn N. V. et al., Biotechnologia, Glavnoe Upravlenie Mikrobiologiceskoj Promy Lennosti Pri, 2, 3-10 (2003) ) .

No obstante, hasta la fecha, ninguna de estas fitasas presenta las propiedades necesarias para el uso eficaz como suplemento de los piensos para consumo animal. En particular, las fitasas fúngicas tienden a ser proteolíticamente inestables (Igbasan F. A. et al, Arch. Anim. Nutr. 53, 353-373 (2000) ) y, por lo tanto, son vulnerables a la degradación, mientras que la mayor parte de las fitasas bacterianas tienen una estrecha especificidad de sustrato por el fitato a solas y degradan mal los fosfatos de inositol de grados intermedios de fosforilación (Greiner R. et al., Arch. Biochem. Biophys. 303 (1) , 107-113 (1993) ; Kerovuo J. et al., Biochem. J. 352, 623-628 (2000) ) .

Por consiguiente, se necesitan fitasas mejoradas.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

En un aspecto amplio, la presente invención se refiere a los métodos para preparar fitasas procedentes de una bacteria y las formas modificadas de la misma. En particular, la invención se refiere a los métodos para preparar fitasas procedentes de la bacteria Buttiauxella sp. y formas modificadas/variantes de la misma seleccionadas y/o modificadas genéticamente para que tenga mejores características que la enzima de tipo silvestre (enzima madre) .

La presente invención es ventajosa porque da a conocer métodos para preparar nuevas fitasas que tienen propiedades que las hacen particularmente útiles y eficaces como enzimas para piensos. En particular, la invención se refiere a los métodos para preparar polipéptidos de fitasa nuevos purificados y/o aislados como se describe en la presente memoria, o un fragmento funcional, o variantes o formas modificadas de los mismos, o una forma modificada de los mismos. También se describen en la presente memoria las secuencias de ácido nucleico que codifican dichas fitasas.

Para ser eficaz como aditivo enzimático para alimentos o para pienso para consumo animal, la fitasa tiene que combinar una serie de propiedades diferentes. Para poder degradar el ácido fítico en el medio ácido del estómago de un animal, tiene que permanecer activa a pH bajo, preferentemente a lo largo de un amplio margen de valores de pH. Además, tiene que tener una elevada actividad específica y preferentemente una termoestabilidad elevada para permitir que la proteína resista las temperaturas altas utilizadas de forma habitual en la preparación de productos alimenticios para consumo animal tales como los piensos granulados.

También es importante que la enzima tenga una amplia especificidad de sustrato que le permita hidrolizar no sólo el fitato, sino también los productos intermedios de la degradación del fitato, tales como pentafosfatos, tetrafosfatos y trifosfatos de inositol. Los estudios sobre la degradación del fitato en los cerdos demuestran que estos oligofosfatos de inositol permanecen en su mayor parte insolubles en el intesto delgado y en el grueso y, por consiguiente, inaccesibles a las fosfatasas alcalinas producidas por el animal y la microflora intestinal (Schlemmer U. et al. Arch. Anim. Nutr. 55, 255-280 (2001) ) . Se han identificado variaciones de los perfiles de especificidad de sustrato en diferentes enzimas. Por ejemplo, los trifosfatos de inositol generados por la fitasa de B. subtilis son esencialmente resistentes a la hidrólisis posterior por esta enzima [Kerovuo J. et al., Biochem. J. 352, 623-628 (2000) ].

También se describe en la presente memoria un plásmido o un sistema de vector, o un transformante o un organismo transgénico que comprende una nueva fitasa como se describe en la presente memoria o una forma modificada de la misma.

También se describen en la presente memoria organismos transgénicos modificados para que expresen una nueva fitasa como la descrita en la presente memoria o una forma modificada de la misma y, por consiguiente, sean capaces de producir una fitasa. La presente invención da a conocer medios y métodos para producir fitasas mediante biotecnología y su uso como complemento para los piensos.

Los aspectos de la presente invención se presentan en las reivindicaciones y en el comentario que viene a continuación.

Para facilidad de referencia, estos y otros aspectos de la presente invención se explican ahora en los encabezamientos de apartados apropiados. No obstante, las enseñanzas en cada apartado no se limitan necesariamente a cada apartado en particular. Tal y como se utiliza con referencia a la presente invención, la terminología «producir», «que produce», «producido», «producible», «producción» es sinónima de la terminología correspondiente «preparar», «que prepara», «preparado», «preparación», «generado», «generación» y «preparable».

Tal y como se usa con referencia a la presente invención, la terminología «expresión», «expresa», «expresado» y «expresable» es sinónima de la terminología correspondiente «transcripción», «transcribe», «transcrito» y «transcribible».

Tal y como se usa con referencia a la presente invención, la terminología «transformación» y «transfección» se refieren a un método que introduce secuencias de ácido nucleico en hospedadores o células hospedadoras, tejidos u órganos.

Otros aspectos que se refieren a las secuencias nucleotídicas que se pueden utilizar en los métodos de la presente invención incluyen: una construcción que comprende las secuencias de la presente invención; un vector que comprende las secuencias para uso en la presente invención; un plásmido que comprende las secuencias para uso en la presente invención; una célula transformada que comprende las secuencias para uso en la presente... [Seguir leyendo]

1. Método de preparación de una variante de la enzima fitasa, comprendiendo dicho método las siguientes etapas secuenciales:

a) seleccionar al menos una enzima fitasa madre, en donde la al menos una enzima fitasa madre es un polipéptido seleccionado entre el grupo que consiste en:

un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que se presenta en la SEQ ID n.º 3 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 80% con ésta;

un polipéptido que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248;

un polipéptido que se puede obtener mediante la expresión de la SEQ ID n.º 2 o una secuencia nucleotídica que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248 o una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con ésta; y

un polipéptido que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248 y en donde el péptido se obtiene mediante la expresión de la SEQ ID n.º 2 o de una secuencia de nucleótidos que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248 o de una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con ésta,

en donde dicho polipéptido tiene actividad fitasa, en donde dicho polipéptido tiene una actividad específica de al menos 300 U/mg, en donde dicha actividad específica se determina mediante la incubación de dicho polipéptido en una solución que contiene fitato a 2 mM, CaCl2 a 0, 8 mM en tampón de acetato de sodio a 200 mM a pH 3, 5, a una temperatura de 37 °C;

b) generar al menos una variante de fitasa mediante la introducción de al menos una alteración de dicha enzima fitasa madre que es una inserción, una deleción o una sustitución o combinación de las mismas, de un resto aminoacídico en dicha enzima fitasa madre para obtener al menos una variante de la enzima fitasa;

c) escrutar en busca de dicha al menos una variante de la enzima fitasa para identificar una variante de la enzima fitasa mejorada que, en comparación con la enzima fitasa madre, tiene al menos una o varias propiedades mejoradas seleccionadas entre:

d) preparar dicha variante mejorada de la enzima fitasa.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido está aislado y/o purificado.

3. Método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que dicho polipéptido tiene un máximo de actividad alrededor de pH 3 a 6, en donde dicha actividad se determina mediante la incubación de dicho polipéptido en una solución que contiene fitato a 2 mM, CaCl2 a 0, 8 mM en tampón de acetato de sodio a 200 mM a una temperatura de 37 °C.

4. Método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que dicho polipéptido tiene un máximo de actividad a aproximadamente pH 4 a 5, en donde dicha actividad se determina mediante la incubación de dicho polipéptido en una solución que contiene fitato a 2 mM, CaCl2 a 0, 8 mM en tampón de acetato de sodio a 200 mM a una temperatura de 37 °C.

5. Método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que dicho polipéptido tiene un máximo de actividad a aproximadamente pH 4, 5, en donde dicha actividad se determina mediante la incubación de dicho polipéptido en una solución que contiene fitato a 2 mM, CaCl2 a 0, 8 mM en tampón de acetato de sodio a 200 mM a una temperatura de 37 °C.

6. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende mutaciones en al menos una de las siguientes posiciones, numeradas de acuerdo con la numeración en la SEQ ID n.º 3: K 59, T 70, A 122, D 125, T 167, H 193, F 197, T 204, T 209, A 211, S 221, I 223, S 225, K 240, A 242, D 244, A 268, S 281, Q 289, A 294, N 303, I 336 o N 351.

7. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho polipéptido comprende una o varias de las siguientes mutaciones: K 59 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o T 70 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W, o Y; o A 122 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o D 125 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o T 167 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W, o Y; o H 193 A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o F 197 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o T 204 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W, o Y; o T 209 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W, o Y; o A 211 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o S 221 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o D 223 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o G 225, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, o Y; o K 240 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o A 242 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o D 244 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o A 268 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M; N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o S 281 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o Q 289 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W, o Y; o A 294 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o N 303 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o

I 336 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, o Y; o N 351 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, o Y.

8. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende al menos una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en: K59E; T167V; K240T; T167I; K240E; D244C; Q289Y; T209K o F197S.

9. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende una combinación de mutaciones seleccionadas entre el grupo que consiste en: D125E/H193R; o A294E/N303K; o 5 T167I/K240T; o D223E/K240E/N351D; o T167I/K240T/A294E/N303K; o T167I/K240E/A242S/A294E/N303K; o A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A294E/N303K; o 10 A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K; o A122T/D125E/H193R/F197S/T209K/A211P/S221N/G225A/K240E/A294E/N303K; o D125E/T167I/1H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K; o A122T/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K/I336F; o N70Y/D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K. 15 10. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho polipéptido comprende la

combinación de las mutaciones: A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K.

11. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en el que dicho polipéptido es una

variante de la enzima fitasa que tiene mayor estabilidad térmica y/o mayor actividad específica y/o mayor estabilidad 20 proteolítica que la enzima fitasa codificada por la SEQ ID n.º 2.

12. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que durante la etapa b) se genera una población de variantes de la enzima fitasa y en la etapa c) se escruta al menos una proporción de dicha población de variantes de la enzima fitasa.

13. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la etapa a) comprende someter

a mutagénesis una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima fitasa madre, y la etapa b) comprende expresar la secuencia de nucleótidos mutada obtenida en la etapa (a) en una célula hospedadora, y la etapa c) comprende el escrutinio de las células hospedadoras, o de un extracto (s) de las mismas, para identificar una variante mejorada de la enzima fitasa con dicha propiedad o propiedades mejoradas.

14. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que, después de la etapa c) , y

opcionalmente la etapa d) , comprende adicionalmente al menos una ronda posterior de repetición de las etapas a) a c) , y opcionalmente la etapa d) .

15. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que la etapa c) comprende el escrutinio de las células hospedadoras que expresan una variante mejorada de la enzima fitasa que, en comparación con dicha enzima fitasa madre, tiene una diferencia de termoestabilidad de al menos 2, 5 °C, en donde

la diferencia de la termoestabilidad se calcula sustrayendo la temperatura de inactivación de la enzima fitasa madre de la temperatura de inactivación de la enzima fitasa mejorada, en donde la temperatura de inactivación es la temperatura a la que la actividad residual es del 50% después de la incubación durante 10 min y el posterior enfriamiento a temperatura ambiente, en comparación con la actividad residual después de la incubación durante el mismo tiempo en las mismas condiciones a temperatura ambiente.

16. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la etapa c) comprende el escrutinio de las células hospedadoras que expresan una variante mejorada de la enzima fitasa que, en comparación con dicha enzima fitasa madre, tiene una estabilidad frente a la pepsina de al menos el 30% de actividad residual, en donde la actividad residual se calcula comparando la actividad medida a pH 3, 5, 37 °C, después de la incubación durante 2 horas a pH 2, 0 con pepsina a 0, 25 mg/ml, CaCl2 a 1 mM y SAB a 5 mg/ml a 37 °C, con la actividad después de la incubación durante 2 horas a pH 5, 0, CaCl2 a 1 mM y SAB a 5 mg/ml a 37 °C sin pepsina.

17. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que la etapa c) comprende el escrutinio de las células hospedadoras para identificar las que expresan una variante mejorada de la enzima fitasa que, en comparación con dicha enzima fitasa madre, tiene una proporción de la actividad específica de al menos el 110%.

18. Método de preparación de una variante de la enzima fitasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que la fitasa madre comprende la secuencia de aminoácidos que se presenta en la SEQ ID n.º 3 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 85% con ella.

19. Método de preparación de una variante de la enzima fitasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que la fitasa madre comprende una polipéptido que se puede obtener mediante la expresión de la SEQ ID n.º 2 o una secuencia de nucleótidos que se puede obtener de la cepa P1-29 de Buttiauxella sp. depositada con el número de acceso NCIMB 41248 o una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 85% con ella.

20. Método de preparación de una variante de la enzima fitasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que la fitasa madre comprende un polipéptido que se puede obtener de una molécula de ácido nucleico aislada que se hibrida a la SEQ ID n.º 2 en condiciones rigurosas a 50 °C y en SSC a 0, 2X.

21. Método de preparación de una variante de la enzima fitasa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que la fitasa madre comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID n.º 3.

SDS-PAGE de P1-29

Distancia de migración, mm

Figura 1

Perfil de actividad de la fitasa de P1-29 con el pH

0, 0 1, 0 2, 0 3, 0 4, 0 5, 0 6, 0 7, 0 8, 0

Figura 2

P1-29

Figura 3