Procedimiento para la fabricación de una vacuna antitumoral basada en antígenos de superficie de células endoteliales.

Procedimiento para la producción de una composición peptídica, que comprende antígenos capaces de inducir una respuesta inmune a células endoteliales de vasos del tumor de un individuo

, en el que dicha composición es preparada a partir de células endoteliales vivas de vasos del tumor o vasos de tejidos normales de dicho individuo o de otro individuo, comprendiendo el procedimiento, las fases:

- cultivo de células endoteliales vivas a partir de vasos del tumor o vasos de tejido normal de dicho individuo o células endoteliales alogénicas vivas de vasos del tumor o vasos de tejidos normales con medio acondicionado a partir de un cultivo de células del tumor.

- lavado de dichas células para eliminar medio de crecimiento;

- someter dichas células a tratamiento con una solución de tripsina de 0,00001% a 0,5%;

- recoger los péptidos liberados de la superficie de las células endoteliales, mientras las células endoteliales permanecen vivas durante el tratamiento.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/RU2007/000570.

Solicitante: LOKHOV, PETR GENRIEVICH.

Nacionalidad solicitante: Federación de Rusia.

Dirección: CHERNOMORSKY BULVAR 23/1-45 MOSCOW 113452 FEDERACION RUSA.

Inventor/es: LOKHOV,PETR GENRIEVICH.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K39/00 (Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53))
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K38/00 (Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00))
google+ twitter facebookPin it
Procedimiento para la fabricación de una vacuna antitumoral basada en antígenos de superficie de células endoteliales.
Procedimiento para la fabricación de una vacuna antitumoral basada en antígenos de superficie de células endoteliales.

Texto extraído del PDF original:

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para la fabricación de una vacuna antitumoral basada en antígenos de superficie de células endoteliales SECTOR DE LA INVENCIÓN La invención pertenece a las tecnologías médicas, a saber, a la inmunoterapia de pacientes oncológicos y se podría utilizar en medicina para la terapia de enfermedades oncológicas y para la profilaxis de sus recidivas.

ANTECEDENTES Las restringidas posibilidades de procedimientos quirúrgicos y de la quimioterapia hacen urgente el desarrol o adicional de nuevos procedimientos de tratamiento de pacientes oncológicos. En la actualidad se presta atención a la terapia antiangiogénica cuya forma de acción esta basada en la represión del crecimiento de los vasos de los tumores.

El desarrollo del tumor tiene dos etapas principales: la prevascular y la vascular. Durante la primera etapa el tumor crece recibiendo sustancias nutritivas y oxígeno por medio de su difusión de los vasos del paciente lo que no permite el crecimiento del tumor más allá de un volumen de unos pocos milímetros cúbicos. El crecimiento posterior del tumor requiere su transición a la segunda etapa que se caracteriza por la vascularización del tumor (Folkman J., “What is evidence that tumors are angiogenesis dependent?” J. Natl. Cancer Inst., 1990, v.82, 4-6). La aparición de vasos sanguíneos fomenta fuertemente la nutrición del tumor lo que conduce a su crecimiento intensificado y aumenta la probabilidad de metástasis. (Hanahan D., Folkman J. “Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis”. Cel , 1996, v. 86, 353-364). La utilización de sustancias antiangiogénicas tiene como resultado la prevención del crecimiento de los vasos tumorales y de acuerdo con ello la supresión de la segunda fase de crecimiento.

Una de las formas bien conocidas de prevención del crecimiento es la vacunación del paciente, con el objetivo de superar la tolerancia inmune con respecto a células endoteliales (CE) que recubren la íntima de los vasos. La citotoxicidad celular y humoral resulta en la muerte de las CE lo que impide la formación de vasos en el tumor y como consecuencia provoca la destrucción de las células malignas. Se conocen varios métodos para la preparación de antígenos para dichas vacunas; se encuentran muy próximas a nuestra invención las vacunas basadas en antígenos apropiados de CE.

Documentos de la literatura sugieren el procedimiento de obtener la vacuna basándose en la utilización CE xenogeneica, es decir, utilizando células endoteliales de otras especies biológicas (por ejemplo, Wei Y., “Immunotherapy of tumors with xenogeneic endothelial cells as a vaccine”, Nature Medicine, 2000, v. 6, 1160-1166). El inconveniente de estas vacunas es la presencia de antígenos xenogeneicos y en realidad antígenos lastre lo que conduce a la división de la respuesta inmune entre estos últimos y los antígenos determinando la respuesta específica contra CE.

Según otra fuente de información es conocida la vacuna basada en antígenos alogénicos, es decir, una vacuna producida utilizando las células de otro organismo que pertenece a la misma especie (por ejemplo, Scappaticci F.A., Nolan G.P., “Induction of anti-tumor immunity in mice using a syngeneic endothelial cell vaccine”, Anticancer Res., 2003, v. 23, 1165-1672, authors of this publication compare different variants of EC vaccines). La presencia de antígenos alogénicos en vacunas resulta también en la disminución de la resistencia y la especificidad de respuesta inmune con respecto a antígenos específicos de CE.

El análogo más próximo se describe en el documento de Okaji Y. y otros (“Vaccination with autologous endothelium inhibits angiogenesis and metastasis of colon cancer through autoimmunity”, Cancer Sci., 2004, v. 95, 1, 85-90). Este último método comprende la utilización de células endoteliales. Este método utiliza CE autólogas, es decir, las células aisladas del organismo vacunado o células de organismos genéticamente idénticos (por ejemplo, células de la misma línea de ratones). Estas vacunas proporcionan una respuesta inmune muy potente y específica determinando el efecto de curación. Sin embargo todas las vacunas obtenidas a partir de las células completas contienen una gran cantidad de material de lastre, es decir, de proteínas citosol, carbohidratos y lípidos. Las sustancias de lastre reducen fuertemente la parte de antígenos de la vacuna, siendo estos antígenos el objetivo potencial para la acción del sistema inmune (antígenos intracelulares no se encuentran disponibles para el efecto del sistema inmune). Se debería observar que un procedimiento ya conocido de preparación de la vacuna no induce la respuesta inmune específica a las CE de los vasos del tumor.

El objetivo de la presente invención es el desarrol o de un procedimiento para la preparación de una composición peptídica basada en antígenos de CE que comprenden antígenos capaces de inducir una respuesta inmune a células endoteliales de vasos del tumor de un individuo, destinadas a superar la tolerancia inmune de organismos a las CE de los vasos del tumor. La base de esta invención es una diferencia bien conocida entre las CE de vasos de tejidos normales, que se encuentran en un estado de reposo en condiciones fisiológicas, y las CE de tumores, que están activadas, es decir, se encuentran en proliferación activa y migración. Es conocido que las CE activadas en comparación con las CE de vasos de tejidos normales tienen una expresión más elevada de muchas proteínas específicas tales como €3 (Gladson C.L. y otros, Am. J. Pathol ., 1996, v. 148, 1423-1434), E-selectina (Volm M. y otros, Clin. Cancer Res., 2000, v. 6, 3236-3240), endoglina (Burrows F. y otros, Clin. Cancer Res., 1995, v. 1, 1623-1634), endosialina (Takahashi K. y otros, J. Clin. Invest., 1994, v. 93, 2357-64) y receptores de VEGF (Boocock C. y otros, J. Natl. Cancer Inst., 1995, v. 87, 506-516). La diferencia de perfiles de expresión de algunas proteínas es conocida por las patentes US2006210975, publicada en 21.09.2006, US2005142138, publicada en 30.06.2005, US2006127902, publicada en 15.06.2006 y la solicitud internacional WO 2004091383, publicada en 28.10.2004. En lo que respecta a la presente invención lo más importante son las diferencias de la superficie de las CE, particularmente de las neutrofilinas, integrinas, receptores, etc. que permiten obtener antígenos específicos para las CE de vasos de los tumores (ver solicitud internacional WO 2004001004, publicada en 31.12.2003).

CARACTERISTICAS DE LA INVENCIÓN El resultado técnico obtenido por la utilización de la invención tal como se describe en esta solicitud consiste en el aumento de la eficiencia del tratamiento contra enfermedad oncológica a causa de los daños infligidos en los vasos del tumor al superar la tolerancia inmune del organismo a las CE de los vasos del tumor. El significado de ello es la superación de la tolerancia, es decir, a las CE activadas que permite provocar daños especialmente en los vasos del tumor.

El resultado técnico indicado anteriormente se obtiene mediante la realización del procedimiento de producción de una composición peptídica que comprende antígenos capaces de inducir una respuesta inmune a las células endoteliales de vasos de los tumores de un individuo, en el que dicha composición es preparada a partir de células endoteliales vivas de vasos del tumor o vasos de tejidos normales de dicho individuo o de otro individuo, comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas: - cultivo de las células endoteliales vivas de vasos del tumor o vasos de tejidos normales de dicho individuo o células endoteliales alogénicas vivas de vasos del tumor o vasos de tejidos normales con medio acondicionado de un cultivo de células del tumor; - lavado de dichas células para eliminar medio de crecimiento; - someter dichas células a tratamiento con 0,00001% a 0,5% de solución de tripsina; - recoger los péptidos liberados de la superficie de las células endoteliales mientras las células endoteliales permanecen vivas durante el tratamiento. De acuerdo con esta invención las CE vivas sufren la acción no mortal para el as de la tripsina, los antígenos segregados se recogen, el tratamiento de las células vivas se repite después de los intervalos necesarios para que las células recuperen sus antígenos de superficie, los antígenos de superficie son acumulados hasta que se obtiene su dosis necesaria para vacunación, controlando la calidad de la composición peptídica preparada.

La forma de realización incluye la utilización de CE activadas.

Las CE activadas recién aisladas de los vasos del tumor podrían ser posiblemente utilizadas.

Si la cantidad de CE aisladas de vasos del tumor es insuficiente el procedimiento adopta la multiplicación de las CE por su cultivo.

Se utiliza tripsina como una proteasa.

Las CE activadas podrían ser aisladas a partir de vasos del tumor y cultivadas en condiciones que mantuvieran su estado activo.

El estado activado de las CE podría ser soportado por co-cultivo con células del tumor.

La otra variante de realización hace posible el mantenimiento del estado activado de las CE por cultivo en presencia de fragmentos de tejidos del tumor.

En la variante preferente de realización las CE activadas son obtenidas a partir de vasos del tumor del propio paciente.

En las otras variantes se podrían utilizar CE activadas de los vasos del tumor de diversos pacientes.

También se podrían utilizar el cultivo de CE activadas por co-cultivo in-vitro con células de tumor.

Las CE podrían ser activadas por las propias células de tumor del paciente.

Otra variante posible incluye la activación de las CE por células de tumor de algún otro paciente. Las CE podrían ser activadas por una línea celular de tumor apropiada.

Otra variante es la utilización de CE activadas in-vitro por la adición del medio acondicionado del cultivo de células de tumor.

El incremento de la respuesta inmune se obtiene cuando se añaden coadyuvantes a los antígenos superficiales.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La invención es ilustrada además por ejemplos específicos de realización y por las figuras correspondientes, que representan lo siguiente.

Figura 1. Esquema de la variante de realización de la preparación de la composición peptídica. Figura 2. Curvas de crecimiento del hepatoma H22 en ratones BALB/c en el primer y segundo grupos experimentales y en el grupo de control (las dimensiones medias del tumor se muestran con desviación estándar). Figura 3. Secciones histológicas de tejidos de tumor del primer grupo (A), segundo grupo (B) y grupo de control (C) de ratones así como sus índices angiogénicos correspondientes; las paredes de los vasos del tumor adoptan coloración oscura (corresponde al color marrón en la foto de color).

REALIZACIONES PREFERENTES DEL PROCEDIMIENTO En la figura 1 se explica la variante de realización del procedimiento. Se aíslan CE vivas del tejido del tumor obtenidas por biopsia o por operación. Se utilizan CE vivas para el inicio del cultivo primario de CE activadas. En caso necesario las células son cultivadas hasta obtener la cantidad necesaria de las mismas.

No solamente se podrían utilizar CE de vasos del tumor que se encuentran en estado activado desde el inicio, sino también CE obtenidas de los vasos de tejidos normales activados por medio acondicionado de un cultivo de células de tumor para la realización del procedimiento descrito en esta solicitud de patente.

El siguiente paso crítico de la invención es el tratamiento de células vivas con tripsina en condiciones suaves (no mortales para las células).

A efectos de obtener lo necesario para la dosis de vacunación de antígenos se repite el procedimiento de tratamiento de las células con tripsina varias veces, con intervalos de tiempo desde algunas horas a algunos días necesarios para la reparación de antígenos superficiales. Los antígenos acumulados de esta forma son tratados de acuerdo con la tecnología de preparación de la composición peptídica específica, es decir, los antígenos podrían ser purificados, concentrados, analizados en cuanto a su composición y modificados o mezclados con coadyuvantes para el incremento de la inmunogenicidad.

La preparación de antígenos para la vacunación de acuerdo con la invención tiene las siguientes ventajas: - todas las ventajas de las auto-vacunas, es decir, su especificidad con respecto al paciente determinado; - todas las ventajas de las vacunas polivalentes, es decir, la multiplicidad de antígenos; - el enriquecimiento de la composición peptídica por los antígenos superficiales de las CE (es mejor utilizar CE activadas) que proporcionan la superación de la tolerancia inmune a las CE de vasos del tumor después de la inmunización; - la posibilidad de obtener una dosis de antígenos necesaria para la vacunación por su acumulación pero no por la proliferación de las CE, lo cual es capital porque los cultivos de células primarias durante su proliferación in-vitro cambian lentamente su estructura antigénica y resultan inutilizables para la vacunación.

La utilización práctica de los antígenos de superficie obtenidos de acuerdo con la presente descripción depende de su identidad con los fragmentos de proteína presentes en la superficie de las CE de los vasos (incluyendo tumores), es decir, de la identidad de las secuencias de aminoácidos y sus modificaciones (por ejemplo, glicosilación). La utilización de los antígenos superficiales de CE activadas obtenidas de acuerdo con la presente invención está condicionada por su identidad con fragmentos de proteína presentes en la superficie de las CE especialmente de los vasos del tumor.

Es sabido que el crecimiento del tumor es imposible sin vascularización del tumor. Los antígenos superficiales de las CE acumuladas y purificadas (activadas preferentemente) mezcladas con el coadyuvante que aumenta la respuesta inmune son inyectadas en humanos o animales. Como resultado de la respuesta inmune celular y humoral que inactiva los antígenos inyectados las CE ya existente o las de nueva aparición en los vasos del tumor sufren una destrucción cruzada, que determina la curación y efectos profilácticos de la inmunización. Para obtener una respuesta inmune completa se llevan a cabo inyecciones reiteradas de antígenos superficiales.

Sigue el primer ejemplo de realización del procedimiento de preparación de la composición peptídica contra hepatoma humano H22 inoculado en ratones en base a las CE activadas autólogas.

El cultivo de CE autólogas se obtiene a partir de vasos del hígado de ratones BALB/c de acuerdo con Belloni y otros (Microvasc. Res., 1992, vol. 43, 20-45). La activación de las CE es llevada a cabo por adición del medio de crecimiento acondicionado a partir de células H22 en medio de crecimiento de CE en la proporción de 1:3. En los días 5º-7º después de la activación las CE son utilizadas para obtener antígenos superficiales de acuerdo con el siguiente protocolo.

1. El medio de crecimiento es retirado del recipiente con el cultivo de CE activadas, la monocapa de células es lavada no menos de tres veces con solución fisiológica estéril (la mitad del volumen del medio de crecimiento). El lavado es llevado a cabo para la eliminación de los restos del medio de crecimiento. La fase siguiente que también es crucial es el tratamiento de las células con una concentración vital para dichas células de proteasa, siendo tripsina la preferente como proteasa (actividad ~3000 U/mg). 2. La solución a 0,0001% de la tripsina es añadida a la monocapa de células utilizando 1 ml de la solución para cada 25 cm2 de superficie del recipiente. 3. El recipiente es incubado a 37ºC. Entre 5-7 minutos de incubación se retira la solución de tripsina que contiene los antígenos superficiales separados.

4. Se añade un medio de crecimiento recién preparado que contiene el suero (usualmente 10%) y sigue el cultivo. 5. Para la fabricación de la dosis necesaria para la vacuna se acumulan los antígenos superficiales, se repiten las etapas 1-4 a intervalos de 24 horas, la calidad de la composición peptídica se controla por comprobación de la adecuación del cultivo de las CE activadas para el objetivo de obtener antígenos específicos de los vasos del tumor.

Las condiciones del tratamiento de las células con tripsina podrían variar significativamente, por ejemplo, de unos pocos minutos a varias docenas de minutos, pudiendo variar la concentración de tripsina de 0,00001% a 0,5%, adoptándose las condiciones individualmente para cada cultivo primario de CE. Si la actividad de la tripsina difiere de la facilitada en la descripción su concentración se calcula de acuerdo con la proporción directa a su actividad.

Inmediatamente antes del tratamiento con tripsina las células deben ser lavadas, por ejemplo, con solución fisiológica para eliminar los restos del medio de crecimiento. Los antígenos liberados bajo tratamiento de tripsina son fragmentos de proteínas superficiales, siendo recogidos por cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, decantación por pipeta.

Durante el procedimiento del cultivo la composición antigénica de las CE de las células cultivadas varia, lo cual conduce a discrepancia entre antígenos del cultivo celular y antígenos de las CE superficiales de los vasos del tumor del paciente. Para impedir la fabricación de una composición peptídica no adecuada se comprueba la adecuación del cultivo de CE para la acumulación de antígenos de acuerdo con el método de evaluación de los cultivos celulares que se describe en la Patente de Eurasia nº 009326 “Method for testing a cell culture quality”.

Es sabido que el tratamiento de las células con concentraciones de proteasa no mortales (para ellas) conduce a la separación de los antígenos de las células superficiales (ver, por ejemplo, la Patente de Eurasia nº 009325 “Tumor vaccines, a method for producing a tumor vaccine and a method for carrying out anti-tumor immunotherapy”). Por lo tanto, de acuerdo con esta invención la acción de la tripsina conduce a la liberación de antígenos de superficie de las CE en la solución. Los antígenos de CE superficiales (fragmentos de las proteínas de superficie) liberados bajo la acción de tripsina son principalmente los adecuados para la inmunización y son utilizados para la vacunación de pacientes oncológicos.

Se debe observar que la recogida de la solución de tripsina que contiene antígenos separados de las proteínas de superficie de las células es mejor que se lleve a cabo antes del momento de desacoplamiento de las células de la superficie del recipiente y aquello ayudará a prevenir la aparición de células en la solución de antígeno y, por lo tanto evitará la innecesaria etapa de purificación.

Las células no perecen después del tratamiento vital de tripsina en concentración apropiada, lo que facilita la posibilidad de reiterar el tratamiento del cultivo de CE primario con tripsina para la acumulación de la necesaria dosis de antígenos para vacunación.

Durante los intervalos entre el tratamiento de tripsina, las células son incubadas de acuerdo con el protocolo de cultivo (es decir, a 37ºC en el incubador de CO2, medio de crecimiento con el suero y necesario para las adiciones de mantenimiento de estado activo).

Los antígenos de superficie acumulados son tratados de acuerdo con la tecnología de fabricación de la composición peptídica, es decir, podrían ser sometidos a purificación, concentración, análisis de composición y también modificación o mezcla con coadyuvantes para el aumento de la inmunogenidad.

En las otras variantes de realización de dicha invención, el procedimiento de tratamiento de las células con tripsina, se podría acoplar con el proceso de subcultivo de las células (tratamiento de las células con tripsina, recogida de las células y separación).

La solución de tripsina podría ser preparada utilizando solución fisiológica estéril y utilizando también cualquier sal o tampón apropiados.

Este procedimiento (destinado a su aplicación) para la preparación de una composición peptídica, que comprende antígenos capaces de inducir una respuesta inmune en células endoteliales de vasos del tumor de un individuo, se podría aplicar a cualquier variación de cultivo de CE, en particular, a los cultivos sobre matriz o sobre sustrato, siendo posibles diferentes combinaciones de co-cultivo para utilizar también como CE aisladas recientemente.

Además, la invención se muestra mediante un segundo ejemplo del procedimiento de preparación de composición peptídica comprendiendo antígenos capaces de inducir una respuesta inmune a las células endoteliales de vasos del tumor de un individuo utilizando el cultivo primario de CE activadas, aisladas de los vasos del cáncer de colon humano.

1. Un fragmento de tejido de tumor de colon, obtenido durante la ablación quirúrgica del tumor fue colocado en un tubo estéril con medio RPMI 1640 conteniendo antibióticos, que fue transportado al laboratorio. 2. En condiciones estériles, el tejido del tumor es trasladado a platillo Petri, lugares de necrosis, coágulos de sangre y restos de grasa y tejidos conectivos son retirados mecánicamente. 3. El tejido del tumor es cortado en pequeños trozos mediante tijeras. 4. Los fragmentos del tejido del tumor son incubados en solución al 0,2% de colagenasa a 37ºC, en un volumen suficiente para cubrir los fragmentos del tumor. 5. La solución de colagenasa es descartada y se lavan suavemente fragmentos de tejido del tumor con solución de PBS. 6. Se añaden tres ml de RPMI 1640, se reducen los fragmentos de tejido del tumor en pequeños conjuntos de células por medio de empapado intensivo y soplado a través del extremo de la pipeta.

7. Las agrupaciones más grandes se dejan caer al fondo, las células restantes son trasladadas a un nuevo tubo y centrifugadas a 170 g a temperatura ambiente. 8. La pastil a de células es resuspendida en medio RPMI 1640. 9. 1 ml de la suspensión de células es centrifugado en el gradiente Percoll durante 20 minutos a 670 g a temperatura ambiente.

10. La fracción de células que corresponde a gradiente Percoll con densidad 1,033-1,047 (corresponde a CE) se recoge, se añaden 10 ml de RPMI 1640, la mezcla es resuspendida y las células son recogidas por centrifugación de 5 minutos a 170 g. 11. Las CE son resuspendidas en medio de crecimiento (RPMI 1640, heparina, factor de crecimiento endotelial, medio acondicionado de células tumorales, 10% de suero fetal de vaca) y cultivadas en el recipiente de cultivo. 12. El crecimiento del medio es descartado hacia fuera del recipiente, las células son lavadas tres veces con solución fisiológica o solución PBS utilizando la mitad del volumen del medio de cultivo. Como resultado, las trazas del suero que se originan del medio de crecimiento deben ser eliminadas. 13. Se añade a las células 0,0001% de solución de la tripsina (actividad –3000 U/mg) utilizando 1 ml de la solución para cada 25 cm2 de la superficie del recipiente. 14. El recipiente es incubado a 37ºC. Entre 5 y 7 minutos de incubación, la solución que contiene los antígenos de superficie liberados es recogida. Durante la retirada de la solución del recipiente flask CE deben permanecer fijadas al fondo del recipiente. Si bajo el efecto de la tripsina, una parte de las células se ha desacoplado de la superficie del recipiente y flotan en el líquido, la solución debe ser sometida a centrifugación a 400 g durante 5 minutos, utilizando el sobrenadante libre de células. 15. Para la inactivación de los restos de tripsina en el recipiente con las CE, es necesario añadir nuevo medio de cultivo que contiene suero de vaca, continuando la incubación a 37ºC y 5% de CO2. 16. La solución obtenida de acuerdo con el punto 14 es sometida a concentración utilizando un concentrador en vacío a 45ºC. Previamente la solución debe ser desalada en cualquier forma apropiada, por ejemplo, cromatografía de fase inversa, por filtración de gel, etc. 17. Para la acumulación de las cantidades necesarias de antígenos se reiteran los puntos 12-16 a intervalos de tiempo desde unas pocas horas a unos pocos días, durante cuyo periodo se controla la calidad de la composición peptídica en preparación por medio de la evaluación de las CE con respecto a su adecuación para la obtención de antígenos específicos para los vasos del tumor del paciente.

En la variante preferente de realización de la invención, las CE son co-cultivadas con células del tumor que proceden del mismo tumor del que se han aislado las CE.

En otra variante de realización de la invención se co-cultivan las CE con células tumorales procedentes del tumor de otro paciente o son co-cultivadas con la línea específica de células tumorales.

En otra variante de realización de la invención, las CE son co-cultivadas con fragmentos del tumor utilizados para el aislamiento de las CE, o son co-cultivadas con los fragmentos de tumor de algún otro paciente.

En otra variante de realización de la invención, las CE activadas proceden de otro paciente (CE alogénicas).

Los antígenos de superficie de las CE cultivadas obtenidas de acuerdo con la presente invención, deben ser específicas para las CE del tumor del donante. Sin embargo, el cultivo distorsiona el fenotipo de las células a causa de la imposibilidad de crear in-vitro las mismas condiciones en las que las células del tumor están creciendo en el organismo del paciente. Por lo tanto, la adecuación del cultivo de las CE para la acumulación de antígenos para la vacunación se debe controlar de forma obligada, y también se debe llevar a cabo de acuerdo con el procedimiento descrito en la patente antes mencionada de Eurasia “Método para comprobación de la calidad de un cultivo de células”.

Para corroborar la actividad antitumoral del compuesto peptídico que comprende antígenos capaces de inducir respuesta inmune a células endoteliales de vasos del tumor obtenidas de acuerdo con dicha invención, se llevó a cabo el experimento modelo sobre ratones utilizándose tres grupos de ratones BALB/c (6 machos por grupo) de la misma edad y peso.

Se prepararon antígenos de acuerdo con la primera forma de realización de la invención utilizando cultivos de CE autólogas activadas y no activadas. Los antígenos aislados fueron desalados por filtración de gel sobre Sephadex G- 10 y posteriormente concentrados en el concentrador al vacío.

Los ratones fueron inyectados por vía subcutánea con un mil ón de células H22 de hepatoma. Al séptimo día después de la inyección, los ratones fueron vacunados por inyección subcutánea de 150 mg de antígenos previamente mezclados con coadyuvante de Freund completo con una proporción de 1:1 (v/v). Las inmunizaciones subsiguientes fueron llevadas a cabo durante 4 semanas utilizando coadyuvante de Freund incompleto una vez por semana. Los animales del primer grupo experimental fueron inoculados con la composición peptídica preparada de acuerdo con la primera forma de realización de la invención, es decir, con la utilización de CE activadas autólogas. Se inocularon animales del segundo grupo con la composición peptídica preparada de acuerdo con la primera forma de realización de la invención utilizando CE autólogas pero no activadas. El grupo de control fue inyectado con PBS mezclado con coadyuvante de Freund utilizando el mismo esquema.

Durante tres meses después de la inoculación de los tumores, se observó su crecimiento en grupos de control y experimentales. Los resultados de las mediciones (ver figura 2) demuestran la reducción y desaparición de tumores en animales de grupos experimentales, lo que demuestra el marcado efecto antitumoral de la composición peptídica que contiene antígenos de CE de superficie, observándose el efecto más pronunciado con la composición peptídica elaborada sobre la base de antígenos de superficie de CE activadas.

Para la corroboración del mecanismo de acción antivasos de la composición peptídica, se midieron índices angiogénicos (cantidad de vasos por 1000 células tumorales) en tumores del grupo de control y grupo experimental utilizando cortes histológicos y procedimiento de inmunoencimas de muerte de las paredes de los vasos del tumor.

Fragmentos recién aislados de tejidos de tumor, tomados en el día 30 después de la inoculación del tumor fueron fijados en solución de formaldehído al 10% en PBS (pH 7,0-7,2) y embebidos en parafina. Se prepararon secciones de un grosor de 4 mm para la investigación inmunohistoquímica. Para revelar vasos, las secciones fueron objeto de tinción con anticuerpos murinos a CD31 humano utilizando el protocolo estándar avidina-bitotina-peroxidasa. Se retiró la parafina con etanol. La actividad de la peroxidasa indogénica fue bloqueada con 3% de peróxido de hidrógeno. La unión no específica de anticuerpos fue prevenida con una solución de BSA al 3% en PBS. Las secciones fueron incubadas a continuación con anticuerpos primarios a CD31, anticuerpos biotinilados a IgG murino y complejo estreptavidina-biotina-peroxidasa. Las secciones fueron teñidas con solución recién preparada de diaminobencidina y post-teñidas con hematoxilina. Después de cada etapa, las secciones fueron lavadas con PBS. Como control negativo se utilizaron secciones teñidas de acuerdo con el procedimiento anteriormente descrito en las que los anticuerpos primarios fueron sustituidos por IgG murina.

La figura 3 muestra las secciones histológicas de tumores del primer grupo (A) y segundo grupo (B) experimentales y del grupo de control (C), correspondiendo a estos grupos, los índices angiogénicos (AI) iguales a 16, 32 y 80. Esto confirma la inhibición de la vascularización como resultado de la vacunación por los antígenos de superficie de las CE, indicando que la inhibición más fuerte corresponde a la composición peptídica basada en CE activadas.

Se debe enfatizar que los resultados del experimento modelo no están restringidos a la utilización animal porque los mecanismos de respuesta inmune son idénticos, tanto en humanos como en animales.

El procedimiento de administración de los antígenos y su dosis calculada para 1 kg de peso conserva su significado en casos de inmunización de humanos, pero el esquema de inmunización (dosis, número de inyecciones repetidas y también los coadyuvantes utilizados) se podrían individualizar para cada paciente particular teniendo en cuenta la gravedad del desarrollo de la enfermedad, la fase de la enfermedad oncológica, el grado de vascularización del tumor, la aptitud del organismo para una marcada respuesta inmune a antígenos en paralelo con quimioterapia.

A continuación se indica el ejemplo de la forma de obtener una composición peptídica, que comprende antígenos capaces de inducir una respuesta inmune a células endoteliales de vasos del tumor basándose en antígenos CE de superficie, siendo preparada la composición peptídica de acuerdo con la segunda variante de realización de la invención para la vacunación antitumoral de humanos.

La composición peptídica, consiste en 1 mg de una mezcla de antígenos (preparada de acuerdo con la segunda variante de realización de la invención) disuelta en 0,5 ml de PBS y mezclada con 1 ml de coadyuvante Montanide ISA-51 (es el coadyuvante de la firma “Syntex” desarrollado sobre la base de una emulsión agua-aceite y conteniendo escualeno, Plunoric L121, Tween 80).

Una dosis de la composición peptídica es inyectada al paciente de forma subcutánea cada semana durante tres semanas y una vez al mes durante cinco meses.

La eficiencia de la vacunación se comprueba por la intensidad de la inmunidad a los antígenos de superficie inyectados. En el 2º-3º día después de la inyección se evalúa la reacción de hipersensibilidad contra antígenos inyectados, teniendo en cuenta la dimensión del punto rojo en el lugar de inyección. Como índice base, se acepta la dimensión en el lugar de la primera inyección. El incremento evidente de la reacción de hipersensibilidad después de vacunación repetida, indica el desarrollo de respuesta inmune.

La inyección intravenosa o intramuscular, de la composición peptídica es también posible, siendo también posible la inyección de la composición peptídica sin el coadyuvante.

El desarrollo de la respuesta inmune después de la utilización de la composición peptídica preparada de acuerdo con el procedimiento de aplicación se debe a la presencia de antígenos de CE de superficie en las composiciones peptídicas. La pluralidad de antígenos, es decir, de los fragmentos de proteínas de superficie presentes en la composición peptídica hace posible la respuesta inmune contra todas las células que tienen en su superficie proteínas con las secuencias de aminoácidos.

La preparación de la composición peptídica de acuerdo con este procedimiento podría ser realizada utilizando, no solamente las CE activadas del propio paciente, sino utilizando también las CE de otro paciente.

En ambos casos, se consigue el efecto de curación a causa de la presencia en la superficie de las CE de los vasos de los tumores de diferentes pacientes de los antígenos con idénticas secuencias de aminoácidos. E incluso cuando se utilizan composiciones autopeptídicas, preparadas de acuerdo con el mismo procedimiento, los efectos son más pronunciados porque en este caso, la composición peptídica contiene antígenos que son individuales para las CE de los vasos del tumor del paciente específico.

El efecto de la curación se consigue también en el caso de utilización de las CE de tejidos normales activados por medio acondicionado procedente de un cultivo celular de un tumor. Este efecto es explicado por la presencia de antígenos de superficie comunes a todas las CE y asimismo por el carácter parcialmente común de los cambios en la composición de antígenos de las CE después de su activación por medio acondicionado procedente de un cultivo de células del tumor.

Se debe observar que la utilización de composiciones peptídicas obtenidas de acuerdo con este procedimiento, que se propone como aplicación, permite aumentar la eficacia de tratamiento muchas veces en comparación con la utilización de vacunas monovalentes.

La utilización de la composición peptídica preparada de acuerdo con el procedimiento de aplicación, proporciona la posibilidad de superar la tolerancia inmune del organismo a las CE de vasos del tumor, porque la composición está enriquecida con antígenos específicos para las CE de los vasos del tumor.

Se crea esta posibilidad a causa del tratamiento de tripsina de las células con una concentración de tripsina vital para estas células (no mortal). La utilización de la concentración vital de tripsina, permite separar por segmentación solamente los antígenos superficiales de las CE y evitar la muerte de las células seguida de la destrucción de sus membranas plasmáticas, lo que conduce a la contaminación de la composición peptídica por contenido citoplasmático, particularmente con una masa de proteínas intracelulares, que no son útiles para la vacunación. Este procedimiento es sabido que disminuye la parte de antígenos específicos de los vasos del tumor en vacunas ya conocidas, conduciendo a la inducción de respuesta inmune no direccionada y como consecuencia, a la disminución de su especificidad contra antígenos de superficie en especial.

Por lo tanto, la utilización de la composición enriquecida con antígenos de superficie, la composición peptídica preparada de acuerdo con la presente invención, permite aumentar la eficiencia de la terapia antitumoral.

Además, el aumento de la eficiencia de la inmunoterapia se obtiene por la utilización de antígenos de superficie preparados por la acumulación de antígenos obtenida a partir de CE idénticas. Este procedimiento de la preparación de la composición peptídica, permite obtener por toda utilización de la tripsina, los antígenos de una composición prácticamente sin cambios y acumular la cantidad de antígenos necesaria para la vacunación. La incorporación en la composición peptídica de antígenos específicos solamente para los vasos del tumor particulares está asegurada por la posibilidad de control de la calidad de la composición peptídica.

Se describen los siguientes elementos: 1. Procedimiento de preparación de una vacuna para tumores que consiste en el tratamiento de células endoteliales vivas con proteasa en condiciones suaves (no mortales para las células), recogida de los antígenos de superficie de las células que se han liberado, tratamiento repetido de células vivas con proteasa con intervalos de tiempo necesarios para la recuperación de antígenos de superficie por las células, acumulación de los antígenos liberados hasta que se obtiene la cantidad necesaria de antígenos, control de la calidad de la vacuna.

2. Procedimiento, de acuerdo con el punto 1, en el que se utilizan células endoteliales activadas. 3. Procedimiento de los puntos 1 ó 2, en el que se utilizan células endoteliales recién aisladas de vasos de tejidos del tumor. 4. Procedimiento del punto 1, en el que se cultivan células endoteliales para su multiplicación. 5. Procedimiento del punto 1, en el que se utiliza tripsina como proteasa.

6. Procedimiento, según cualquiera de los puntos 1, 2 ó 4, en el que se aíslan células endoteliales activadas de vasos del tumor y se cultivan en condiciones que mantienen su estado activado. 7. Procedimiento, según cualquiera de los puntos 1, 2, 4 ó 6, en el que el estado activado de las células endoteliales durante el cultivo es soportado por co-cultivo con células del tumor. 8. Procedimiento, según cualquiera de los puntos 1, 2, 4 ó 6, en el que el estado activado de las células endoteliales durante el cultivo está soportado por co-cultivo con fragmentos de tejido del tumor. 9. Procedimiento, según cualquiera de los puntos 1, 2 ó 4, en el que se utilizan las células endoteliales activadas de los vasos tumorales del propio paciente. 10. Procedimiento, según cualquiera de los puntos 1, 2 ó 4, en el que se utilizan células endoteliales activadas de vasos del tumor de otro paciente.

11. Procedimiento, según cualquiera de los puntos 1, 2 ó 4, en el que se utiliza el cultivo de células endoteliales activadas a través de co-cultivo in-vitro con células del tumor. 12. Procedimiento, según cualquiera de los puntos 1, 2, 4 u 11, en el que las células endoteliales son activadas por las células del tumor del propio paciente. 13. Procedimiento, según cualquiera de los puntos 1, 2, 4 u 11, en el que las células endoteliales son activadas por las células de tumor de otro paciente. 14. Procedimiento, según cualquiera de los puntos 1, 2, 4 u 11, en el que las células endoteliales son activadas por las línea celular del tumor. 15. Procedimiento, según cualquiera de los puntos 1, 2 ó 4, en el se utiliza el cultivo de células endoteliales activadas in-vitro por edición de sustancias de activación en el medio de crecimiento.

16. Procedimiento, según cualquiera de los puntos 1, 2, 4 ó 15, en el que las células endoteliales son activadas por, como mínimo un factor de activación. 17. Procedimiento, según cualquiera de los puntos 1, 2, 4 ó 16, en el que las células endoteliales son activadas utilizando el factor de crecimiento del endotelio de los vasos (VEGF). 18. Procedimiento, según cualquiera de los puntos 1, 2 ó 4, en el se utiliza el cultivo de células endoteliales activadas in-vitro por edición de medio de crecimiento acondicionado del cultivo de células del tumor. 19. Procedimiento del punto 1, en el que se añaden coadyuvantes a los antígenos de superficie.

APLICABILIDAD INDUSTRIAL Por lo tanto, la invención proporciona la posibilidad de obtener antígenos de superficie de CE y llevar a cabo en base a los mismos la inmunoterapia de enfermedades oncológicas, en especial vacunación.

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la producción de una composición peptídica, que comprende antígenos capaces de inducir una respuesta inmune a células endoteliales de vasos del tumor de un individuo, en el que dicha composición es preparada a partir de células endoteliales vivas de vasos del tumor o vasos de tejidos normales de dicho individuo o de otro individuo, comprendiendo el procedimiento, las fases: - cultivo de células endoteliales vivas a partir de vasos del tumor o vasos de tejido normal de dicho individuo o células endoteliales alogénicas vivas de vasos del tumor o vasos de tejidos normales con medio acondicionado a partir de un cultivo de células del tumor. - lavado de dichas células para eliminar medio de crecimiento; - someter dichas células a tratamiento con una solución de tripsina de 0,00001% a 0,5%; - recoger los péptidos liberados de la superficie de las células endoteliales, mientras las células endoteliales permanecen vivas durante el tratamiento.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, que comprende la etapa de mezclar un coadyuvante con la composición peptídica.