Expresión mejorada de Factor IX en vectores de terapia génica.

Un polinucleótido que codifica el Factor IX humano que comprende la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 1.

Expresión mejorada de Factor IX en vectores de terapia génica

Campo de la invención Esta invención se refiere al campo de terapia génica en general y más específicamente al uso de vectores de terapia génica para administrar genes útiles en el tratamiento de hemofilia y trastornos de almacenamiento lisosomal.

Antecedentes La hemofilia es un trastorno genético hemorrágico recesivo enlazado a X causado por una deficiencia de un factor de coagulación sanguíneo. Existen dos tipos básicos de hemofilia; hemofilia A y hemofilia B. La hemofilia A está causada por una deficiencia en el factor de coagulación sanguíneo conocido como Factor VIII y afecta a aproximadamente 17.000 personas en los Estados Unidos. La hemofilia B está causada por una deficiencia en el factor de coagulación sanguíneo conocido como Factor IX y afecta a aproximadamente uno de cada 34.500 hombres. Las presentaciones clínicas de ambas hemofilias se caracterizan por episodios de hemorragia espontánea y prolongada. Los pacientes con frecuencia sufren hemorragias articulares que conducen a artropatía incapacitante. El tratamiento actual se dirige a la detención de los episodios hemorrágicos con infusiones intravenosas de factores de coagulación obtenidos de plasma o, para hemofilia A, Factor VIII recombinante. Sin embargo, la terapia está limitada por la disponibilidad de factores de coagulación, sus semividas cortas in vivo y el coste elevado del tratamiento.

La terapia génica ofrece la promesa de un método nuevo para tratar hemofilia. Ambos tipos de hemofilia son candidatos teóricos excelentes para terapia génica ya que cada uno tiene una patología molecular razonablemente sencilla y se debería poder remediarse mediante la administración de un gen único. La terapia génica satisfactoria para hemofilia requiere niveles suficientemente elevados de expresión del factor deficiente para generar una respuesta terapéutica.

Varios grupos de investigadores han conducido investigación con vectores de terapia génica diseñados para expresar el Factor IX, pero no han sido capaces de conseguir una producción estable de niveles terapéuticos de estos factores en seres humanos. Recientemente, se han usado vectores autocomplementarios para aumentar la expresión génica heteróloga mediante el aumento de la eficacia de transducción. Véase la Patente de los Estados Unidos Pub. Nº 2004/0029106, Wang, Z. et al., "Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adenoassociated virus vectors in vitro and in vivo", Gene Therapy 10: 2105-2111 (2003) ; McCarty, D. M. et al., "Adenoassociated virus terminal repeat (TR) mutant generates self-complementar y vectors to overcome the rate-limiting step to transduction in vivo", Gene Therapy 10: 2112-2118 (2003) ; McCarty, D. M. et al, "Self-complementar y recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis", Gene Therapy 8: 1248-1254 (2001) . Sin embargo, los casetes de expresión específica en hígado actualmente en uso en terapia génica de AAV superan la capacidad de estos vectores AAVsc. Véase Ziegler, R. J. et al., "AAV2 vector harboring a tiver-restricted promoter facilitates sustained expression of therapeutic levels of alpha-galactosidase and the induction of immune tolerance in Fabr y mice", Mol. Therap. 9 (2) : 231-240 (Feb. 2004) ; Miao, C. H. et al., "Inclusion of the hepatic locus control region, an intron, and untranslated region increases and stabilizes hepatic factor IX gene expression in vivo but not in vitro", Mol. Ther. 1 (6) : 522-32 (2000) . El documento WO0198482 describe construcciones de expresión génica de Factor IX.

Por lo tanto sigue existiendo una necesidad de potenciar la producción de Factor IX humano in vivo usando vectores de terapia génica para conseguir niveles terapéuticamente eficaces.

Sumario de la invención La invención en su sentido más amplio es como se define en las reivindicaciones. La presente invención comprende un componente básico útil para mejorar la expresión del Factor IX en vectores de terapia génica. Este componente es una secuencia codificante específica del Factor IX (SEC ID Nº: 1) diseñada para la expresión óptima del Factor IX humano (SEC ID Nº: 2) en una célula de mamífero, en particular una célula humana. También se proporcionan casetes de expresión y vectores de terapia génica que contienen este componente.

Este componente es una región de control reguladora transcripcional útil para regular la expresión selectiva de genes incluyendo pero sin limitación Factor IX humano en células hepáticas. Esta región de control reguladora transcripcional consiste básicamente en una versión más pequeña de un potenciador específico de hígado conocido y un promotor conocido, los cuales ambos se han reducido de tamaño por el inventor a la vez que conservan su función. La secuencia de nucleótidos de esta región de control reguladora transcripcional se proporciona en SEC ID Nº: 3, con los nucleótidos 1-192 representando la región potenciadora y los nucleótidos 193-447 que representan la región promotora. Estas regiones potenciadora y promotora se pueden usar por separado o en conjunto para regular la expresión de una secuencia de nucleótidos unida operativamente tal como un gen de interés o una molécula antisentido. Esta región de control reguladora transcripcional se puede usar en vectores con capacidad limitada de inserciones, tales como en vectores de terapia génica autocomplementarios. El uso de esta región en un vector autocomplementario permite que este tipo de vector se use para expresar Factor IX humano. Los casetes de expresión y los vectores de terapia génica que contienen este componente también se proporcionan.

Descripción de la lista de secuencias SEC ID Nº: 1 es la secuencia codificante de nucleótidos del Factor IX humano optimizado para expresión.

SEC ID Nº: 2 es la secuencia de aminoácidos del Factor IX humano codificado por SEC ID Nº: 1.

SEC ID Nº: 3 es la secuencia de nucleótidos de la región reguladora útil para regular la expresión del Factor IX. Los nucleótidos 1-192 se obtienen a partir de una región de control hepática de Apolipoproteína E que actúa como un potenciador específico de hígado. Los nucleótidos 193-447 se obtienen a partir de una región promotora de alfa-1 antitripsina humana. Véase Miao, C. H. et al., "Inclusion of the hepatic locus control region, an intron, and untranslated region increases and stabilizes hepatic factor IX gene expression in vivo but not in vitro", Mol. Ther. 1 (6) : 522-32 (2000) .

Descripción de la Figura Figura 1. Estructura de vectores FIXh AAVr. Los vectores descritos en el Ejemplo 1 se muestran esquemáticamente como los mismos se empaquetan en el virión, mostrando los vectores AAVsc como dímeros. AAVss-HCR-AATh-FIX que consiste en la región de control humana de apolipoproteína E/locus del gen C-l (HCR) y el promotor de a1 antitripsina humana (AATh) , un intrón compuesto de 1 actina de pollo/1 globina de conejo (IVS) , ADNc de FIX humano de 1, 6 kb (FIXh) y una señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovina (BGpA) flanqueada por las repeticiones terminales internas de AAV (ITR mostradas como un bucle de horquilla) . El vector scAAV-LP1-hFIXco autocomplementario que contiene (i) el promotor LP1 que consiste en elementos de núcleo específicos de hígado a partir de HCR (pares de bases 134 a 442 del registro de Genbank HSU32510) y AATh (pares de bases 1747 a 2001 del registro de Genbank K02212) (ii) intrón de antígeno t pequeño de SV40 modificado (pares de bases 4644 a 4552, registro de Genbank J02400) (iii) FIXh optimizado con codón (hFIXco) y (iv) poliA tardío de SV40 (SV40 LpA, pares de bases 2600 a 2733 de GenBank J02400) y (v) un trs 3’ suprimido (Ltrs) . scAAV-LP1-hFIX contiene el ADNc de FIX humano de tipo silvestre a partir del cual se ha suprimido la región no traducida 3’ (LhFIX) en lugar de hFIXco. AAVss-LP1-hFIXcoS tiene ITR 5’ y 3’ intactas y además contiene 760 pb de secuencia de relleno no codificante a partir de la 1-lactamasa (Lbla) .

Descripción detallada de la invención Definiciones:

“Potenciador” significa un polinucleótido que puede estimular la actividad promotora y de ese modo aumentar el nivel de expresión de un gen de interés unido operativamente, secuencia antisentido, etc. con relación al nivel de expresión que se produce en ausencia de potenciador. Los potenciadores pueden aumentar la expresión de secuencias unidas operativamente de una manera específica de tejido o temporal.

“Casete de expresión” significa un conjunto completo de secuencias de control incluyendo secuencias de inicio,

promotoras y de terminación... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido que codifica el Factor IX humano que comprende la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 1.

2. Un casete de expresión diseñado para la expresión de Factor IX humano que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1.

3. Un vector de terapia génica diseñado para la expresión de Factor IX humano que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1.

4. El vector de terapia génica de la reivindicación 3, donde el vector de terapia génica comprende un vector de virus adeno-asociado (AAV) .

5. El vector de terapia génica de la reivindicación 4, donde el vector de AAV comprende un vector de tipo 2 de AAV pseudotipificado con proteína de cápside de serotipo 5 de AAV.

6. El vector de terapia génica de la reivindicación 4, donde el vector de AAV comprende un vector de tipo 2 de AAV pseudotipificado con proteína de cápside de serotipo 8 de AAV.

7. Un gen recombinante diseñado para la expresión del Factor IX humano en una célula, que comprende la secuencia codificante del Factor IX humano expuesta en SEC ID Nº: 1.

8. Un polinucleótido que codifica el Factor IX humano que comprende la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 1 para su uso como un medicamento.

9. Uso de un polinucleótido que codifica el Factor IX humano que comprende la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 1 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de hemofilia B.

10. Un polinucleótido que codifica el Factor IX humano que comprende la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 1 para su uso en el tratamiento de hemofilia B.