Expresión de IL1RAP en células de leucemia mieloide aguda y crónica.

Un agente que comprende o consiste en un anticuerpo con especificidad para la proteína accesoria del receptor de interleucina 1

(IL1RAP) para su uso en el tratamiento de una leucemia, siendo el agente capaz de inducir citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) de hemocitoblastos patológicos y/o células progenitoras asociadas a una leucemia, en donde las células expresan la IL1RAP.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/GB2010/001612.

Solicitante: Cantargia AB.

Nacionalidad solicitante: Suecia.

Dirección: Medicon Village, Scheelevägen 2 223 81 Lund SUECIA.

Inventor/es: FIORETOS,THOAS, JÄRÅS,MARCUS.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales > C07K16/28 (contra receptores, antígenos celulares de superficie o determinantes celulares de superficie)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K38/00 (Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales > C07K16/30 (de células tumorales)
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Expresión de IL1RAP en células de leucemia mieloide aguda y crónica.

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DESCRIPCIÓN

Expresión de IL1RAP en células de leucemia mieloide aguda y crónica

Campo técnico La presente invención se refiere a los agentes para su uso en el tratamiento y diagnóstico de trastornos neoplásicos hematológicos, tales como leucemia mieloide crónica (CML), leucemia linfoblástica aguda (ALL), el síndrome mielodisplásico (MDS), los trastornos mieloproliferativos (MPD) y leucemia mieloide aguda (AML).

Antecedentes La leucemia mieloide crónica (CML) fue la primera neoplasia humana asociada a una anomalía genética recurrente, el cromosoma Filadelfia (Ph), formado a través de una translocación recíproca entre los cromosomas 9 y 22, dando lugar a la tirosina cinasa constitutivamente activa BCR/ABL11. En la CML, el cromosoma Ph se cree que se origina en los hemocitoblastos hematopoyéticos (HSC), ya que por clonación se pueden encontrar tanto en las células mieloides malignas como en las células linfoides no malignas. El cromosoma Ph se encuentra también en una fracción de la leucemia linfoblástica aguda (ALL) y la leucemia mieloide aguda (AML). La CML se compone de tipos de células heterogéneas de distintas fases de maduración que son mantenidas por un pequeño número de células, denominadas hemocitoblastos CML, que comparten la capacidad de auto-renovación con HSC norma3. Se ha demostrado que los hemocitoblastos CML son al menos parcialmente resistentes a los tratamientos actuales con los inhibidores de la tirosina cinasa4,5 que a pesar del éxito clínico muestran un efecto supresor en lugar de curativo en este trastorno. Por lo tanto, la identificación de una estrategia para focalizar eficientemente los hemocitoblastos de CML es altamente deseable para lograr una cura permanente de dicho trastorno. Dicha estrategia sería identificar una diana en los hemocitoblastos de CML que puedan proporcionar medios novedosos para erradicar los hemocitoblastos de CML. Esta estrategia sería la de identificar un objetivo en LMC las células madre que pueden proporcionar nuevos medios para erradicar las células madre de CML. Informes alentadores en este sentido se han descrito en el trastorno relacionado de la leucemia mieloide aguda (AML), donde los anticuerpos dirigidos < CD123, CXCR4, CD44 o CD47 en los hemocitoblastos AML muestran efectos contra la leucemia en modelos animales de AML6,9. Además, los antígenos asociados a los mastocitos AML, tales como CD96 y CLL-1 han sido identificados10,11, proporcionando candidatos diana adicionales de este trastorno. De manera intrigante, a pesar de ser una de las neoplasias más estudiadas de todos los tiempos, referida como trastorno de cáncer de hemocitoblasto, ningún biomarcador de superficie celular hasta ahora ha sido identificado en la CML que permita una separación prospectiva de los hemocitoblastos CML de HSCs normales, ambos residiendo en la rara población celular CD34+CD38-12,13. La Identificación de tal biomarcador sería instrumental en la caracterización del hemocitoblasto CML, pero también podría ser utilizado en los desarrollos de tratamiento novedosos y para el seguimiento de los efectos terapéuticos sobre células de CML primitivas durante el tratamiento. Majeti et al. (2009) Cell 138:286-299 divulga CD47 como un marcador de pronóstico adverso y diana de anticuerpos terapéutico para hemocitoblastos de leucemia mieloide aguda humana. Los mismos autores informan de que este hallazgo ha sido corroborado mediante análisis de expresión génica en micromatriz (Majeti et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. 106:3396-3401). Por consiguiente, la presente invención pretende proporcionar agentes para el uso en el tratamiento y diagnóstico de trastornos hematológicos neoplásicos, tales como la CML. Además, la invención tiene por objeto proporcionar un agente para su uso en el tratamiento y el diagnóstico de otros trastornos hematológicos neoplásicos, tales como ALL, AML, trastornos mieloproliferativos negativos de cromosoma Ph (MPD), y los síndromes mielodisplásicos (MDS).

Sumario de la invención La invención proporciona agentes para su uso en el tratamiento del trastorno hematológico neoplásico de la leucemia, y evoluciona directamente del descubrimiento por los inventores que los hemocitoblastos y células progenitoras asociados a trastornos hematológicos neoplásicos, tales como la leucemia mieloide crónica, la cual expresa IL1RAP (también conocida como IL1-RAP) en su superficie En contraste, hemocitoblastos hematopoyéticos sanos normales (así como células progenitoras) no expresan, o muestran niveles de expresión muy bajos, de IL1RAP. Además, los inventores han descubierto que los hemocitoblastos y las células progenitoras de otros trastornos neoplásicos hematológicos, tales como ALL, AML, trastornos mieloproliferativos negativos del cromosoma Ph (MPD), y los síndromes mielodisplásicos (MDS), también están asociados a una sobre-regulación de IL1RAP en su superficie celular. Así, la invención proporciona agentes para su uso en el tratamiento y/o el diagnóstico de trastornos hematológicos neoplásicos asociadas a la sobre-regulación de IL1 RAP en la superficie de los hemocitoblastos y/o células progenitoras. Un primer aspecto de la invención proporciona un agente tal como se define en las reivindicaciones en el presente documento, que comprende o consiste en un anticuerpo con especificidad para la proteína accesoria del receptor de interleucina-1 (IL1 RAP) para uso en el tratamiento de la leucemia.

Por "proteína accesoria del receptor de interleucina-1", "IL1RAP" y "IL1-RAP" se incluyen específicamente la proteína humana IL1 RAP, por ejemplo como se describe en GenBank No. de Acceso AAB84059, Secuencia NCBI deReferencia: NP_002173.1 y UniProtKB/Swiss-Prot No. de Acceso Q9NPH3-1 (véase también Huang et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Science USA. 94 (24), 12829-12832). El IL1RAP también se conoce en la literatura científica como IL1R3, C3orf13, FLJ37788, IL-1RAcP y EG3556. Por "hemocitoblastos patológicos asociados a un trastorno neoplásico hematológico" se incluyen los hemocitoblastos que son responsables del desarrollo de un trastorno neoplásico hematológico en un hemocitoblasto individual, es decir neoplásico. En particular, los hemocitoblastos patológicos pueden ser hemocitoblastos leucémicos (por ejemplo, como se describe en Guo et al., 2008, Nature 453 (7194):529-33). Tal hemocitoblasto se puede distinguir de los hemocitoblastos hematopoyéticos normales por su expresión de la proteína de superficie celular, IL1RAP (véase el ejemplo a continuación) En una realización, los hemocitoblastos patológicos son células CD34+, CD38-. Por "células progenitoras" asociadas a un trastorno hematológico neoplásico se incluyen las células derivadas de hemocitoblastos patológicos que son responsables del desarrollo de un trastorno neoplásico hematológico en un individuo. En particular, las células progenitoras pueden ser células leucémicas progenitoras (por ejemplo, como se describe en los ejemplos siguientes, véaseLa Figura 2B). Tales células progenitoras se pueden distinguir de las células progenitoras hematopoyéticas normales por su mayor expresión de la proteína de superficie celular, IL1RAP (véase el ejemplo a continuación) En una realización, las células progenitoras patológicos son células CD34+, CD38+. Por "desorden hematológico neoplásico” específicamente se incluyen cánceres hematológicos tales como leucemias, así como enfermedades similares a leucemia tales como los trastornos mieloproliferativos (MPD) y los síndromes mielodisplásicos (MDS).

Así, en la presente invención, el trastorno hematológico neoplásico es una enfermedad o trastorno leucémico, es decir un cáncer de la sangre o médula ósea, que puede ser agudo o crónico. En una realización, el trastorno neoplásico hematológico puede estar asociado a células que comprenden un gen de fusión BCR/ABL1. Por ejemplo, los hemocitoblastos patológicos y/o células progenitoras pueden comprender un gen de fusión BCR/ABL1. En una realización relacionada, el trastorno hematológico neoplásico puede estar asociado a células que comprenden un cromosoma Filadelfia (Ph). Por ejemplo, los hemocitoblastos patológicos y/o células progenitoras pueden comprender un cromosoma Ph. Por "cromosoma Ph" en este contexto se entiende una anormalidad cromosómica específica resultante de una translocación recíproca entre el cromosoma 9 y 22, específicamente designada t(9,22)(q34,q11). Un ejemplo de un trastorno neoplásico hematológico asociada a células que contienen un cromosoma Ph es o leucemia mieloide crónica, o mielógena (CML).

Sin embargo, se apreciará por las personas expertas en la técnica que los agentes de la invención también pueden ser utilizados en el tratamiento y/o el diagnóstico de trastornos hematológicos neoplásicos que no están asociados a células que comprenden un cromosoma Filadelfia (Ph) (pero sin embargo muestran sobre-regulación de IL1RAP). Tales trastornos neoplásicos hematológicos que se asocian con las células que no contienen un cromosoma Ph incluyen los síndromes mielodisplásicos (MDS) y los trastornos mieloproliferativos (MPD) tales como la policitemia vera (PV), trombocitosis esencial (ET) y la mielofibrosis (MF). Más específicamente, el trastorno hematológico neoplásico puede ser seleccionado del grupo que consiste en la leucemia mieloide crónica (CML), los trastornos mieloproliferativos (MPD), el síndrome mielodisplásico (MDS), leucemia linfoblástica aguda (ALL) y leucemia mieloide aguda (AML).

En una realización particularmente preferida, el trastorno hematológico neoplásico es la leucemia mieloide crónica (CML). Se apreciará por las personas expertas en la técnica que la unión del agente a IL1RAP presente en la superficie de los hemocitoblastos patológicos y/o células progenitoras puede dar lugar a una modulación (es decir, un aumento o disminución) de una actividad biológica de IL1RAP. Sin embargo, tal efecto modulador no es esencial; los agentes de la invención provocan un efecto terapéutico y profiláctico simplemente en virtud de la unión a IL1RAP en la superficie de los hemocitoblastos patológicos y/o células progenitoras, que a su acciona el sistema inmune para inducir la muerte celular (por ADCC).

Por "actividad biológica de IL1RAP" se incluye una interacción o evento de señalización que involucra IL1RAP sobre los hemocitoblastos patológicos y/o células progenitoras.Por ejemplo, en una realización, el agente es capaz de bloquear la unión de uno o más co-receptores de IL1RAP (tal como IL1R1, ST2, C-KIT y/o IL1RL2).

Tal inhibición de la actividad biológica de IL1RAP por un agente de la invención puede ser en su totalidad o en parte. Por ejemplo, el agente puede inhibir la actividad biológica de IL1 RAP por lo menos 10 %, preferiblemente por lo menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %, y lo más preferiblemente por 100 % en comparación con la actividad biológica de IL1RAP en hemocitoblastos patológicos y/o células progenitoras que no han sido expuestas al agente. En una realización preferida, el agente es capaz de inhibir la actividad biológica de IL1RAP en un 50 % o más en comparación con la actividad biológica de IL1RAP en hemocitoblastos patológicos y/o células progenitoras que no han sido expuestas al agente. Asimismo, se apreciará que la inhibición del crecimiento y/o la proliferación de los hemocitoblastos patológicos y/o células progenitoras puede ser en su totalidad o en parte. Por ejemplo, el agente puede inhibir el crecimiento y/o la proliferación de los hemocitoblastos patológicos y/o células progenitoras por lo menos por 10 %, preferiblemente por lo menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %, y lo más preferiblemente por el 100 % en comparación con el crecimiento y/o la proliferación de los hemocitoblastos patológicos y/o células progenitoras que no han sido expuestos al agente.

Del mismo modo, se apreciará que la inducción de la diferenciación de los hemocitoblastos patológicos y/o células progenitoras puede ser en cualquier grado. Por ejemplo, el agente puede inducir la diferenciación de los hemocitoblastos patológicos y/o células progenitoras por lo menos por 10 %, preferiblemente por lo menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %, y más preferiblemente por el 100 % en comparación con la diferenciación de los hemocitoblastos patológicos y/o células progenitoras que no han sido expuestos al agente. En la presente invención, el agente es capaz de matar los hemocitoblastos patológicos y/o células progenitoras. En particular, el agente puede ser capaz de inducir la muerte de hemocitoblastos y/o células progenitoras mediante la inducción de apoptosis por citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC).

Los métodos de detección de interacciones entre una entidad química de prueba y IL1RAP son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo los métodos de ultrafiltración con espectroscopía de masas de rociado de iones/HPLC u otros métodos físicos y analíticos pueden ser utilizados. Además, los métodos de Transferencia de Energía de Resonancia de Fluorescencia (FRET) pueden ser utilizados, en los que la unión de dos entidades marcadas fluorescentes puede medirse mediante la medición de la interacción de los marcadores fluorescentes, cuando estén en proximidad cercana entre sí. Los métodos alternativos para detectar la unión de IL1RAP a las macromoléculas, por ejemplo ADN, ARN, proteínas y fosfolípidos, incluyen un ensayo de resonancia de plasmones superficiales, por ejemplo como se describe en Plant et al., 1995, Analyt Biochem 226(2), 342-348. Tales métodos pueden hacer uso de un polipéptido que tiene el marcador, por ejemplo con un marcador radiactivo o fluorescente. Otro método de identificación de una entidad química que es capaz de unirse a IL1RAP es una en donde se expone la proteína al compuesto y cualquier unión del compuesto a la proteína es detectada y/o medida. La constante de unión para la unión del compuesto al polipéptido puede ser determinada. Los métodos adecuados para detectar y/o medir (cuantificar) la unión de un compuesto a un polipéptido son bien conocidos por los expertos en la técnica y pueden realizarse, por ejemplo, utilizando un método capaz de funcionamiento de alto rendimiento, por ejemplo un método basado en un circuito integrado. La nueva tecnología, llamada VLSIPS™, ha permitido la producción de circuitos integrados muy pequeños que contienen cientos de miles o más de las diferentes sondas moleculares.

Estos circuitos integrados biológicos tienen sondas dispuestas en hileras, cada una de las sondas tiene asignado un lugar específico. Los circuitos integradosbiológicos se han producido en los que cada lugar tiene una escala de, por ejemplo, diez micrómetros. Los circuitos integrados se pueden utilizar para determinar si las moléculas diana interactúan con cualquiera de las sondas en el circuito integrado. Después de exponer la matriz a las moléculas diana en condiciones de prueba seleccionadas, los dispositivos de escaneo pueden examinar cada ubicación de la matrizy determinar si una molécula diana ha interactuado con la sonda en ese lugar. Otro método de identificación de compuestos con una afinidad de unión para IL1RAP es el sistema híbrido de dos levaduras, donde los polipéptidos de la invención se pueden utilizar para "capturar" proteínas que se unen a IL1RAP. El sistema híbrido de dos levaduras se describe en Fields & Song, Nature 340:245-246 (1989).

En la presente invención, el agente comprende o consiste en un anticuerpo con especificidad de unión para la IL- 1RAP. Por "anticuerpo" se incluyen moléculas de anticuerpos sustancialmente intactas, así como anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos (en donde por lo menos un aminoácido está mutado en relación con los anticuerpos naturales humanos), anticuerpos de cadena simple, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos de cadenas pesadas, homodímeros y heterodímeros de los anticuerpos de cadenas pesadas, y derivados de los mismos.

También se incluyen dentro del alcance de la invención versiones modificadas de los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, por ejemplo, modificados por la unión covalente de polietilenglicol u otro polímero adecuado (véase más adelante). Los métodos de generación de anticuerpos son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, los anticuerpos pueden ser generadas a través de uno cualquiera de varios métodos que emplean la inducción de la producción in vivo de moléculas de anticuerpo, el cribado de bibliotecas de inmunoglobulina (Orlandi et al, 1989 Proc Natl Acad Sci. U.S.A. 86:3833-3837, Winter et al, 1991, Nature 349 293-299) o la generación de moléculas de anticuerpos monoclonales por líneas celulares en cultivos. Estos incluyen, pero no se limitan a, la técnica del hibridoma, la técnica del hibridoma de células B humanas, y la técnica del hibridoma del virus de Epstein-Barr (EBV) (Kohler et al, 1975 Nature 256:4950497, Kozbor et al, 1985 J Immunol Methods 81:31-42, Cote et al, 1983 Proc Natl Acad Sci U.S.A.

80:2026-2030, Cole et al, 1984. MoI Cell Biol. 62:109-120). Anticuerpos monoclonales adecuados para antígenos seleccionados se pueden preparar por técnicas conocidas, por ejemplo las descritas en "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques”, H Zola (CRC Press, 1988) y en "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", JGR Hurrell (CRC Press, 1982).

Las personas expertas en la técnica apreciarán que para la terapia humana o diagnóstico, los anticuerpos humanos o humanizados se utilizan preferiblemente. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de murino) son anticuerpos quiméricos diseñados genéticamente o fragmentos de anticuerpos que tienen preferiblemente porciones mínimas derivadas de anticuerpos no humanos. Los anticuerpos humanizados incluyen los anticuerpos en los que las regiones determinantes complementarias de un anticuerpo humano (anticuerpo receptor) se sustituyen por los residuos de una región complementaria determinante de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata o conejo que tiene la funcionalidad deseada En algunos casos, los residuos del marco Fv del anticuerpo humano son sustituidos por los correspondientes residuos no humanos. Los anticuerpos humanizados pueden comprender también los residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la región de complementariedad importada determinante o secuencias de marco. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de por lo menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente la totalidad de la regiones determinantes de complementariedad corresponden a esas de un anticuerpo no humano y todas, o sustancialmente todas, de las regiones de marco corresponden a esas de una secuencia consenso humana relevante. Los anticuerpos humanizados opcionalmente también incluyen por lo menos una porción de una región constante del anticuerpo, tal como una región Fc, normalmente derivada de un anticuerpo humano (véase, por ejemplo, Jones et al., 1986. Nature 321:522-525; Riechmann et al.,1988, Nature 332:323-329; Presta, 1992, Curr.Op. Struct. Biol. 2:593-596. Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. Generalmente, el anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en él a partir de una fuente que es no humana. Estos residuos amino ácidos no humanos, a menudo referidos como residuos importados, por lo general se toman de un dominio variable importado. Humanización puede realizarse esencialmente como se describe (véase, por ejemplo, Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Reichmann et al., 1988. Nature 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536I; US 4,816,567), reemplazando las regiones de complementariedad humana determinantes con las correspondientes regiones de complementariedad determinantes de roedor. Por consiguiente, dichos anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos, en los que sustancialmente menos que un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados pueden ser normalmente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de la región de complemetariedad determinante y posiblemente algunos residuos de marco están sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. Los anticuerpos humanos también pueden ser identificados mediante diversas técnicas conocidas en la técnica, incluidas las bibliotecas de presentación de fagos (véase, por ejemplo, Hoogenboom & Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al, 1991, J. Mol. Biol. 222:581; Cole et al., 1985, En: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77; Boerner et al, 1991. J. Immunol. 147:86-95). Una vez que se obtienen anticuerpos adecuados, pueden ser probados para la actividad, por ejemplo mediante ELISA.

Además del anticuerpo, los agentes de la invención puede comprender además una porción para aumentar la vida media in vivo del agente, tal como pero no limitado a polietilenglicol (PEG), albúmina de suero humano, grupos de glicosilación, los ácidos grasos y dextrano. Tales porciones adicionales pueden ser conjugadas o combinadas de otro modo con la porción de unión utilizando métodos bien conocidos en la técnica.

Asimismo, se apreciará que los agentes de la invención pueden comprender además una porción citotóxica. Por ejemplo, la porción citotóxica puede comprender o consistir de un radioisótopo, tal como astatina-211, bismuto- 212, bismuto-213, yodo-131, itrio-90, lutetio-177, samario-153 y paladio-109.

Alternativamente, la porción citotóxica puede comprender o consistir de una toxina (tal como saporina o caliqueamicina).

En una alternativa más, la porción citotóxica puede comprender o consistir de un agente quimioterapéutico (tal como un antimetabolito). De igual manera, se apreciará que los agentes de la invención pueden comprender además una porción detectable.

Por ejemplo, la porción detectable puede comprender o consistir de un radioisótopo, tal como tecnitio-99m, indio- 111, galio-67, galio-68, arsénico-72, zirconio-89, yodo-12 o talio-201. Alternativamente, la porción detectable comprende o consiste en un isótopo para magnético, tal como gadolinio-157, manganeso-55, disprosio-162, cromio-52 o hierro-56. Las porciones citotóxicas y detectables pueden ser conjugadas o combinadas de otro modo con el anticuerpo utilizando métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, la terapia inmunoconjugada existente, ozogamicina gemtuzumab [nombre comercial: Mylotarg®], comprende un anticuerpo monoclonal ligado a la citotoxina caliqueamicina). También se describe en el presente documento una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de un agente tal como se define en relación con el primer aspecto de la invención junto con un amortiguador, diluyente, portador, adyuvante o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Compuestos adicionales también pueden ser incluidos en las composiciones, incluyendo, agentes quelantes tales como EDTA, citrato, EGTA o glutatión. Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar de una manera conocida en la técnica que es suficientemente estable durante el almacenamiento y adecuada para la administración a humanos y animales, por ejemplo, las composiciones farmacéuticas pueden ser liofilizadas, por ejemplo, mediante liofilización, secado por aspersión, enfriado por aspersión, o mediante el uso de formación de partículas a partir de formación de partículas supercríticas.

"Farmacéuticamente aceptable" se refiere a un material no tóxico que no disminuye la eficacia de la actividad de unión a Il1RAP del agente de la invención. Estos amortiguadores, portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica (véase Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, AR Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) y el Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed. Pharmaceutical Press (2000).

El término "amortiguador" significa una solución acuosa que contiene una mezcla de ácido-base con el propósito de estabilizar el pH. Ejemplos de amortiguadores son Trizma, Bicina, Tricina, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, fosfato, carbonato, acetato, citrato, glicolato, lactato, borato, ACES, ADA, tartrato, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, cacodilato, CHES, DIPSO, EPPS, etanolamina, glicina, HEPPSO, imidazol, ácido imidazolelactico, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO y TES. El término "diluyente" significa una solución acuosa o no acuosa con el fin de diluir el agente en la preparación farmacéutica. El diluyente puede ser una o más de solución salina, agua, polietilenglicol, propilenglicol, etanol o aceites (por ejemplo, aceite de cártamo, aceite de maíz, aceite de cacahuate, aceite de semilla de algodón o aceite de ajonjolí). El término "adyuvante" significa cualquier compuesto añadido a la formulación para aumentar el efecto biológico del agente de la invención. El adyuvante puede ser una o más sales de zinc, cobre o plata con aniones diferentes, por ejemplo, pero no se limitan a fluoruro, cloruro, bromuro, yoduro, tiocianato, sulfito, hidróxido, fosfato, carbonato, lactato, glicolato, citrato, borato, tartrato, y acetatos de composición acilo diferente. El adyuvante puede ser también polímeros catiónicos tales como éteres de celulosa catiónicos, ésteres de celulosa catiónicos, ácido hialurónico desacetilado, quitosano, dendrímeros catiónicos, polímeros sintéticos catiónicos tales como poli(vinil imidazol), y polipéptidos catiónicos tales como polihistidina, polilisina, poliarginina, y péptidos que contienen estos aminoácidos.

El excipiente puede ser uno o más de carbohidratos, polímeros, lípidos y minerales. Ejemplos de carbohidratos incluyen lactosa, glucosa, sacarosa, manitol, y ciclodextrinas, que se añaden a la composición, por ejemplo, para facilitar la liofilización. Ejemplos de polímeros son el almidón, éteres de celulosa, celulosa carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetil celulosa, hidroxietil celulosa, etilhidroxietilcelulosa, alginatos, carragenanos, ácido hialurónico y sus derivados, ácido poliacrílico, polisulfonato, polietilenglicol/óxido de polietileno, copolímeros de óxido de polietileno/óxido de polipropileno, alcohol polivinílico/acetato de polivinilo de diferente grado de hidrólisis, y polivinilpirrolidona, todos de diferente peso molecular, que se añaden a la composición, por ejemplo, para el control de viscosidad, para lograr bioadhesión, o para proteger el lípido de la degradación química y proteolítica. Ejemplos de lípidos son ácidos grasos, fosfolípidos, mono-, di-, y triglicéridos, ceramidas, esfingolípidos y glicolípidos, todos de diferente longitud de cadena acilo y la saturación, lecitina de huevo, lecitina de soya, huevo hidrogenado y lecitina de soya, que se añaden a la composición por razones similares a las de los polímeros. Ejemplos de minerales son talco, óxido de magnesio, óxido de zinc y óxido de titanio, que se añaden a la composición para obtener beneficios tales como reducción de la acumulación de líquido o propiedades ventajosas de pigmento. Los agentes de la invención pueden formularse en cualquier tipo de composición farmacéutica conocida en la técnica como adecuada para la entrega de los mismos.

En una realización, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden estar en la forma de un liposoma, en el que el agente se combina, además de con otros portadores farmacéuticamente aceptables, con agentes anfipáticos tales como lípidos, que existen en formas agregadas como micelas, monocapas insolubles y cristales líquidos. Lípidos adecuados para la formulación liposómica incluyen, sin limitación, monoglicéridos, diglicéridos, sulfátidos, lisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos biliares, y similares. Lípidos adecuados incluyen también los lípidos anteriores modificados por poli(etilenglicol) en el grupo de cabeza polar para prolongar el tiempo de circulación en el torrente sanguíneo. La preparación de tales formulaciones liposomales se puede encontrar en, por ejemplo, la US 4,235,871.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden estar en forma de microesferas biodegradables. Poliésteres alifáticos, tales como poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA), copolímeros de PLA y PGA (PLGA) o poli(carprolactona) (PCL), y polianhídridos han sido ampliamente utilizados como polímeros biodegradables en la producción de microesferas. Preparaciones de tales microesferas se pueden encontrar en la US 5,851,451 y en la EP 0 213 303.

En una realización adicional, las composiciones farmacéuticas de la invención se proporcionan en forma de geles de polímero, en donde los polímeros tales como almidón, éteres de celulosa, celulosa carboximetilcelulosa, hidroxipropilmetil celulosa, hidroxietil celulosa, etilhidroxietilcelulosa, alginatos, carrageninas, ácido hialurónico y sus derivados, ácido poliacrílico, polivinil imidazol, polisulfonato, polietilenglicol/óxido de polietileno, copolímeros de óxido de polietileno/óxido de polipropileno, alcohol polivinílico/acetato de polivinilo de diferentes grados de hidrólisis, y polivinilpirrolidona se utilizan para el espesamiento de la solución que contiene el agente. Los polímeros también pueden comprender gelatina o colágeno. Alternativamente, los agentes simplemente se pueden disolver en solución salina, agua, polietilenglicol, propilenglicol, etanol o aceites (por ejemplo, aceite de cártamo, aceite de maíz, aceite de cacahuate, aceite de semilla de algodón o aceite de ajonjolí), goma de tragacanto, y/o diversos amortiguadores. Se apreciará que las composiciones farmacéuticas pueden incluir iones y un pH definido para la potenciación de la acción del agente activo. Adicionalmente, las composiciones pueden ser sometidas a operaciones farmacéuticas convencionales tales como esterilización y/o pueden contener adyuvantes convencionales tales como conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, amortiguadores, cargas, etc. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar por cualquier vía adecuada conocida por los expertos en la técnica. Así, las posibles vías de administración incluyen parenteral (intravenosa, subcutánea, e intramuscular), tópica, ocular, nasal, pulmonar, bucal, oral parenteral, vaginal y rectal. También es posible la administración desde implantes. En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas se administran por vía parenteral, por ejemplo, por vía intravenosa, intracerebroventricular, intraarticular, intra-arterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intraesternal, intracranealmente, intramuscular o subcutánea, o pueden ser administradas por técnicas de infusión. Convenientemente son utilizadas en la forma de una solución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo, sales o glucosa suficientes para hacer la solución isotónica con la sangre. Las soluciones acuosas deben ser adecuadamente amortiguadas (preferiblemente a un pH de desde 3 a 9), si es necesario. La preparación de formulaciones parenterales adecuadas bajo condiciones estériles se realiza fácilmente por técnicas farmacéuticas estándar bien conocidas por los expertos en la técnica. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones estériles acuosas y no acuosas inyectables que pueden contener anti-oxidantes, amortiguadores, bacteriostáticos y solutos que hacen la formulación isotónica con la sangre del receptor previsto y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en dosis unitarias o recipientes de dosis múltiples, por ejemplo ampolletas selladas y frascos, y pueden ser almacenados en una condición secada por congelación (liofilizada) requiriendo solamente la adición del portador líquido estéril, por ejemplo agua para inyecciones, inmediatamente antes de usar. Las soluciones y suspensiones para inyección extemporánea se pueden preparar a partir de polvos estériles, gránulos y tabletas del tipo descrito previamente.

Así, las composiciones farmacéuticas son particularmente adecuadas para aplicación parenteral, por ejemplo, administración intravenosa. Alternativamente, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar por vía intranasal o por inhalación (por ejemplo, en la forma de una presentación de pulverización de aerosol desde un recipiente presurizado, bomba, aerosol o nebulizador con el uso de un propelente adecuado, tal como diclorodifluorometano, triclorofluoro-metano, diclorotetrafluoro-etano, un hidrofluoroalcano tal como 1,1,1,2-tetrafluoroetano (HFA 134A3 o 1,1,1,2,3,3,3 - heptafluoropropano (HFA 227EA3), dióxido de carbono u otro gas adecuado). En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. El recipiente a presión, la bomba, aerosol o nebulizador puede contener una solución o suspensión del polipéptido activo, por ejemplo, utilizando una mezcla de etanol y el propelente como el disolvente, que puede contener adicionalmente un lubricante, por ejemplo trioleato de sorbitán. Las cápsulas y cartuchos (formadas, por ejemplo, de gelatina) para su uso en un inhalador o insuflador pueden formularse para contener una mezcla de polvo de un compuesto de la invención y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

Las composiciones farmacéuticas se administrarán a un paciente en una dosis farmacéuticamente efectiva. Una "cantidad terapéuticamente efectiva", o "cantidad efectiva", o "terapéuticamente efectiva", tal como se utiliza aquí, se refiere a aquella cantidad que proporciona un efecto terapéutico para una condición dada y el régimen de administración. Esta es una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir un efecto terapéutico deseado en asociación con el aditivo requerido y diluyente, es decir, un portador o vehículo de administración. Además, se pretende significar una cantidad suficiente para reducir y lo más preferiblemente prevenir, un déficit clínicamente significativo en la actividad, la función y la respuesta del huésped. Alternativamente, una cantidad terapéuticamente efectiva es suficiente para causar una mejora en una condición clínicamente significativa en un huésped. Como se apreciará por los expertos en la técnica, la cantidad de un compuesto puede variar en función de su actividad específica. Las cantidades adecuadas de dosificación pueden contener una cantidad predeterminada de composición activa calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el diluyente requerido. En los métodos y el uso para la fabricación de composiciones de la invención, se proporciona una cantidad terapéuticamente efectiva del componente activo. Una cantidad terapéuticamente efectiva puede ser determinada por el trabajador experto ordinario médico o veterinario basado en las características del paciente, tales como la edad, peso, sexo, condición, complicaciones, otras enfermedades, etc., como es bien conocido en la técnica. La administración de la dosis farmacéuticamente efectiva puede llevarse a cabo tanto por administración única en la forma de una unidad de dosis individual o bien varias unidades de dosis más pequeñas y también por múltiples administraciones de dosis subdivididas a intervalos específicos Alternativamente, la dosis puede proporcionarse como una infusión continua durante un período prolongado.

Los polipéptidos se pueden formular en diversas concentraciones, dependiendo de la eficacia/toxicidad del compuesto utilizado. Preferiblemente, la formulación comprende el agente activo a una concentración de entre 0,1 µM y 1 mM, más preferiblemente entre 1 µM y 500 µM, entre 500 µM y 1 mM, entre 300 µM y 700 µM, entre 1 µM y 100 µM, entre 100 µM y 200 µM, entre 200 µM y 300 µM, entre 300 µM y 400 µM, entre 400 µM y 500 µM y más preferiblemente de aproximadamente 500 µM.

Se apreciará por las personas expertas en la técnica que las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas solas o en combinación con otros agentes terapéuticos utilizados en el tratamiento de un trastorno neoplásico hematológico, tales como inhibidores de tirosina cinasa (por ejemplo, imatinib mesilato [Glivec®], dasatinib, nilotinib), omacetaxina, antimetabolitos (por ejemplo, citarabina, hidroxiurea), agentes alquilantes, interferón alfa-2b y/o esteroides. También se describe en el presente documento un kit que comprende un agente tal como se define en relación con el primer aspecto de la invención o una composición farmacéutica del mismo.

Un aspecto adicional de la invención proporciona el uso de un agente tal como se define en relación con el primer aspecto de la invención en la preparación de un medicamento para tratar el trastorno hematológico neoplásico, la leucemia. En una realización, el trastorno hematológico neoplásico puede estar asociado a las células que comprenden un cromosoma Ph. Por ejemplo, los hemocitoblastos patológicos y/o células progenitoras comprenden un cromosoma Ph. Por "cromosoma Ph" en este contexto nos referimos a una anormalidad cromosómica específica que resulta de una translocación recíproca entre los cromosomas 9 y 22, t específicamente designada t(9,22)(q34;q11). Un ejemplo de un trastorno hematológico neoplásico asociado a las células que contienen un cromosoma Ph es leucemia mieloide crónica (o mieloide) (CML).

Sin embargo, se apreciará por las personas expertas en la técnica que los agentes de la invención también pueden ser utilizados en el tratamiento y/o el diagnóstico de trastornos hematológicos neoplásicos que no están asociados a las células que comprenden un cromosoma Filadelfia (Ph) (pero sin embargo muestran sobre-regulación de IL1 RAP). Tales trastornos neoplásicos hematológicos que se asocian con las células que no contienen un cromosoma Ph incluyen los síndromes mielodisplásicos (MDS) y los trastornos mieloproliferativos (MPD) como la policitemia vera (PV), trombocitosis esencial (ET) y la mielofibrosis (MF). Más específicamente, el trastorno hematológico neoplásico puede ser seleccionado del grupo que consiste en la leucemia mieloide crónica (CML), trastornos mieloproliferativos (MPD), síndrome mielodisplásico (MDS), leucemia linfoblástica aguda (ALL) y leucemia mieloide aguda (AML).

En una realización particularmente preferida, el trastorno hematológico neoplásico es la leucemia mieloide crónica (CML). Un aspecto aún adicional de la invención proporciona un método in vitro para diagnosticar o pronosticar el trastorno hematológico neoplásico, la leucemia, comprendiendo el método: (a) proporcionar una muestra de médula ósea o sangre periférica de células hematopoyéticas de un individuo que va a someterse a ensayo; (b) aislar una subpoblación de células CD34+, CD38- de las células hematopoyéticas, y (c) determinar si los hemocitoblastos, contenidos dentro de las células CD34+, CD38-, expresan los marcadores de la superficie celular de IL1RAP.

en donde los hemocitoblastos que presentan el perfil del marcador de la superficie celular CD34+, CD38- y IL1RAP+ son indicativos de que la persona tiene o desarrolla leucemia.

En una realización, el trastorno hematológico neoplásico puede estar asociado a las células que comprenden un cromosoma Ph. Por ejemplo, los hemocitoblastos patológicos comprenden un cromosoma Ph. Por "cromosoma Ph" en este contexto nos referimos a una anormalidad cromosómica específica que resulta de una translocación recíproca entre los cromosomas 9 y 22, específicamente designadas t(9,22) (q34;q11). Un ejemplo de un trastorno hematológico neoplásico asociado a las células que comprenden un cromosoma Ph es leucemia mieloide crónica (o mielógena) (CML). Sin embargo, se apreciará por las personas expertas en la técnica que los agentes de la invención también pueden ser utilizados en el tratamiento y/o el diagnóstico de trastornos hematológicos neoplásicos que no están asociados a las células que comprenden un cromosoma Filadelfia (Ph) (pero sin embargo muestran sobre-regulación de IL1RAP). Tales trastornos hematológicos neoplásicos que se asocian con las células que no contienen un cromosoma Ph incluyen los síndromes mielodisplásicos (MDS) y los trastornos mieloproliferativos (MPD) como la policitemia vera (PV), trombocitosis esencial (ET) y la mielofibrosis (MF).

Más específicamente, el trastorno hematológico neoplásico puede ser seleccionado del grupo que consiste en la leucemia mieloide crónica (CML), trastornos mieloproliferativos (MPD), el síndrome mielodisplásico (MDS), leucemia linfoblástica aguda (ALL) y leucemia mieloide aguda (AML). En una realización particularmente preferida, el trastorno hematológico neoplásico es la leucemia mieloide crónica (CML). Ejemplos preferidos, no limitativos, que incorporan ciertos aspectos de la invención se describirán ahora, con referencia a las figuras siguientes:

Figura 1. La expresión P210 BCR/ABL1 induce la expresión de IL1RAP en células CD34+ de sangre de cordón umbilical El análisis de citometría de flujo confirma que la expresión de IL1RAP se induce con la expresión retroviral P210 BCR/ABL1 de células CD34+ de sangre de cordón umbilical, tres días después de la transducción. Las células CD34+GFP+ fueron encerradas de acuerdo a los cuadros de los gráficos de puntos. El histograma muestra la expresión de IL1RAP para la tinción de control negativo (blanco), el control de MIG (gris claro) y MIG-P210 (gris oscuro). Los números en los gráficos de puntos muestran el porcentaje de células dentro de los cuadros individuales o cuadrantes. Se muestra un experimento representativo de tres. Figura 2. IL1RAP es sobre-regulado en células primitivas de CML. Los análisis FACS de células CD34+ de cinco pacientes con CML y de 2 muestras bm normales. El gráfico de puntos FACS que muestra los cuadros para las células CD34+CD38+ o CD34+CD38- en un paciente con CML representativo (figura 2A). Histograma que muestra la expresión de IL1RAP dentro de células CD34+CD38+ (figura 2B). Histograma que muestra la expresión de IL1RAP dentro de las células CD34+CD38- (figura 2C). Blanco representa las muestras de control teñidas y el gris representa las muestras teñidas de IL1RAP. Los cuadros de clasificación para las células CD34+CD38-IL1RAP- y CD34+CD38-IL1RAP+ células se describen en los histogramas. Los números en el gráfico de puntos y los histogramas muestran el porcentaje de células dentro de los cuadros/cuadrantes individuales. Figura 3. La expresión de IL1RAP distingue células Ph+ de Ph- CML dentro del compartimiento de células CD34+CD38-. Caída de Flujo-FISH en células de CML CD34+CD38-IL1RAP- y CD34+CD38-IL1RAP+ de muestras de 5 pacientes con CML reveló una separación casi total entre células BCR/ABL1- y BCR/ABL1+, respectivamente. Las barras negras representan células negativas BCR/ABL1 y las barras blancas representan células positivas BCR/ABL1. Se indica en la parte superior de cada barra el número de células Ph+ de los núcleos totales calificados. Figura 4. La expresión de IL1RAP distingue hemocitoblastos de Ph+ CML de HSC normales.

Número de LTC-CFC derivado de células CD34+ CD38-IL1RAP- y CD34+CD38-IL1RAP+ (A). Las barras negras representan las células IL1RAP y las barras blancas representan las células IL1RAP+. Interfaz FISH en LTC-CFC (B). Las barras negras representan células negativas BCR/ABL1 y las barras blancas representan células positivas BCR/ABL1. Se indica en la parte superior de cada barra el número de células Ph+ de los núcleos totales calificados. Figura 5. Eliminación de una línea celular de CML por el anticuerpo dirigido de IL1RAP.

Histograma que muestra la expresión de IL1RAP en células KU812 derivadas de un paciente con CML y que contienen un cromosoma Filadelfia, en comparación con la expresión en las células KG-1 que carecen de un cromosoma Filadelfia (A). Blanco muestra las muestras de control teñidas y gris muestra las muestras teñidas de KMT-1. La línea de células leucémicas KG-1 estaba desprovista de la expresión de IL1RAP, mientras que KU812 expresa IL1RAP (B). Como consecuencia, el bajo nivel de anticuerpos que indujo la muerte celular se observó en KG-1, mientras que un efecto de ADCC dependiente de la dosis se observó utilizando KMT-1 en células KU812 (B). Como control para los efectos inespecíficos de ADCC, un anticuerpo IgG de conejo se utilizó también en los experimentos. El gráfico muestra el promedio y desviación estándar de la muerte celular inducida por anticuerpos de tres experimentos independientes. Figura 6. Eliminación de hemocitoblastos de CML por el anticuerpo dirigido de IL1RAP.

Mediante el uso de KMT-1, células de médula ósea normal CD34+CD38- teñidas negativo para IL1RAP, mientras que células de CML CD34+CD38+ y CD34+CD38- expresaron IL1RAP. Histogramas de CML-1 se muestran a partir de un experimento representativo (A). Blanco muestra las muestras de control teñidas y gris muestra las muestras teñidas de KMT-1. De acuerdo con el nivel de expresión de IL1RAP, ningún efecto de ADCC obvio fue visto usando células de médula ósea normal CD34+CD38-, mientras que el KMT-1 indujo un fuerte efecto de ADCC dependiente de la dosis, tanto en las células CML CD34+ como CD34+CD38- (B). Como control para los efectos inespecíficos de ADCC, un anticuerpo IgG de conejo se utilizó también en los experimentos. El gráfico muestra el promedio y desviación estándar de la muerte celular inducida por anticuerpos de tres experimentos independientes con CML-1, CML-3, CML-4, y cuatro muestras de médula ósea normal. Figura 7. El IL1RAP se expresa también en hemocitoblastos de ALL y AML primario.

Células de leucemia mieloide aguda (AML) se recibieron de pacientes al momento del diagnóstico. Se presenta la expresión de IL1RAP en células CD34+CD38- y CD34+CD38+ de un paciente representativo de AML (A). La línea celular de AML MONO-MAC-6 y la línea celular REH de ALL expresa IL1RAP (B). Células de leucemia linfoide aguda (ALL) se recibieron de pacientes al momento del diagnóstico. Se presenta la expresión de IL1RAP en células CD34+CD38- y CD34+CD38+ de un paciente representativo de Ph+ ALL (C). Blanco muestra las muestras de control teñidas y gris muestra las muestras teñidas de IL1RAP. Figura 8. Eliminación de las líneas celulares de ML y ALL por un anticuerpo dirigido de IL1RAP. En el ensayo de ADCC, una muerte celular dependiente de la dosis de KMT-1 fue inducida, tanto en el MONO- MAC-6como en la línea celular REH, lo que sugiere que los anticuerpos direccionados de IL1RAP pueden tener una ventana terapéutica más amplia que sólo la CML. Como control para efectos inespecíficos ADCC, un anticuerpo IgG de conejo se utilizó también en los experimentos. El gráfico muestra el promedio y desviación estándar de la muerte celular inducida por anticuerpos de tres experimentos independientes. Figura 9. Eliminación de los hemocitoblastos de AML y ALL por la dirección de anticuerpos de IL1RAP. En el ensayo de ADCC, una muerte celular inducida por el KMT-1 se observó tanto en células primarias de AML CD34+CD38- (A) como de ALL CD34+CD38- (B), lo que confirma que los anticuerpos dirigidos de IL1RAP también tienen un efecto terapéutico en AML y ALL con sobre-regulación de IL1RAP en su superficie celular. Como control para efectos inespecíficos de ADCC, un anticuerpo IgG de conejo se utilizó también en los experimentos. El gráfico muestra la muerte celular inducida por anticuerpos específicos. Figura 10A-10B. La IL1RAP se expresa en los hemocitoblastos leucémicos de pacientes con MPD y MDS. Gráficos de contorno que muestran la expresión de IL1RAP en células CD34+CD38- de dos pacientes (MPD-1 y MPD-2), con y sin la mutación JAK2 (A). Histograma que muestra la expresión de IL1RAP en un paciente con MDS avanzó a AML (B). Blanco muestra las muestras de control teñidas y gris muestra una muestra teñida con anticuerpos anti-IL1 RAP.

EJEMPLO 1

IL1RAP es un biomarcador de superficie celular para hemocitoblastos de leucemia mieloide crónica Sumario Las estrategias terapéuticas para la leucemia mieloide crónica (CML) con el objetivo de lograr una cura permanente de la enfermedad, requerirán una completa erradicación de los hemocitoblastos de CML. Los hemocitoblastos de CML, que comparten la capacidad de auto-renovación en hemocitoblastos hematopoyéticos normales (HSC), representan una pequeña población de células leucémicas que hasta ahora han sido indistinguibles de lo normal (HSC), usando marcadores de superficie celular. Una estrategia para dirigir el hemocitoblasto de CML sería identificar un biomarcador de superficie celular para los hemocitoblastos de CML, a los que futuros anticuerpos terapéuticos podrían ser dirigidos. En este estudio, hemos identificado a IL1 RAP como comúnmente sobre-regulado tanto en células primitivas de CML CD34+ y, como consecuencia, de la expresión ectópica de P210 BCR/ABL1 utilizando análisis globales de expresión génica. Además, se muestra que la expresión de IL1RAP divide la rara población celular CD34+CD38-, albergando tanto la CML como las HSC normales, en dos fracciones: una de baja expresión/ausente, la otra que tiene mayor expresión de IL1RAP. Después de establecer un protocolo, lo que permite la detección de BCR/ABL1 por FISH en un pequeño número de células seleccionadas, se observó que dentro de las células de CML CD34+CD38-, las células IL1RAP+ fueron BCR/ABL1+, mientras que las células IL1RAP- fueron casi exclusivamente de BCR/ABL1-. Al seguir realizando ensayos de células iniciadoras en cultivos de largo plazo (LTC-IC) en las dos poblaciones de células, se encontró que los hemocitoblastos de CML candidatos y HSC normales podría ser prospectivamente separados. Este estudio identifica por lo tanto al IL1RAP como el primer biomarcador de la superficie celular para distinguir los hemocitoblastos de la CML de los HSC normales y abre nuevas vías para estrategias terapéuticas y de diagnóstico en la CML, así como en los trastornos relacionados, tales como la leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoblástica aguda (ALL), los trastornos mieloproliferativos (MPD) y el síndrome mielodisplásico (MDS).

Introducción Para identificar un biomarcador de superficie celular de los hemocitoblastos de CML, se realizó un análisis global de expresión génica y se identificó la proteína accesoria del receptor de interleucina 1 (IL1RAP) como el principal candidato, siendo sobre-regulado tanto en células primitivas de pacientes con CML y como consecuencia de la expresión ectópica de P210 BCR/ABL1. Con el desarrollo de un ensayo para la detección de BCR/ABL1 en bajos números de células clasificadas, se muestra que la expresión de IL1RAP permite la separación prospectiva de células primitivas de leucemia y células normales. A través de ensayos de célula iniciadora en cultivos de largo plazo, una vez más se demuestra que la IL1RAP es un biomarcador de la superficie celular de los hemocitoblastos de CML, por primera vez permite la separación prospectiva de los hemocitoblastos de CML de HSC normales.

Materiales y Métodos Recolección de células de pacientes con CML

Aislamiento y transducción de células CD34+ de sangre de cordón umbilical La sangre y, en ocasiones muestras de médula ósea de pacientes con CML se obtuvieron al momento del diagnóstico antes del inicio del tratamiento después de consentimiento informado de acuerdo a un protocolo aprobado por el consejo ético locales. Las muestras fueron recibidas tanto del Departamento de Hematología en el Hospital Universitario de Lund, Suecia y de Rigshospitalet, en Copenhague, Dinamarca. Las células mononucleares (MNC) fueron separados utilizando Lymphoprep™ (Axis-Shield PoC AS, Oslo, Noruega), de acuerdo a las instrucciones del fabricante y las células CD34+ fueron enriquecidas con el kit de aislamiento de células CD34+ (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania) como se describió previamente22, sobre una base regular, esto produjo una pureza de células CD34+ por encima de 95 %. Una subfracción de células mononucleares se almacenó de forma viable en nitrógeno líquido antes del inicio de la tinción de anticuerpos. Las células CD34+ células se dividieron en dos fracciones, una fracción se lavó en PBS y se resuspendió en Trizol y se congeló a -80 C, mientras que la otra fracción se congeló en nitrógeno líquido. Como muestras de referencia, las muestras de médula ósea de voluntarios sanos se obtuvieron después de consentimiento informado en el Hospital Universitario de Lund, seguido por el aislamiento de células CD34- como se describió anteriormente.

Análisis de micromatrices El análisis de micromatrices fue realizado mediante portaobjetos de oligonucleótidos de la Swegene DNA Microarray Resource Center de la Universidad de Lund, Suecia. Las Hibridaciones se llevaron a cabo utilizando el kit Pronto Universal Hybridization (Corning Inc, Corning, NY). El aislamiento del ARN y el análisis de micromatrices se realizaron esencialmente como se describió anteriormente23. La visualización de datos se realizó utilizando el software Qlucore Omics Explorer 2.0 (Qlucore, Lund, Suecia). Análisis de citometría de flujo

Los análisis de citometría de flujo se realizaron en un FACS Canto y la clasificación de células de citometría de flujo se hizo en un FACS Aria (ambos de BD). Antes de la tinción de células, las células CD34+ se descongelaron de acuerdo con procedimientos estándar y se lavaron una vez en PBS que contenía 2 % de FCS (medio de lavado). Se usó anticuerpo policlonal de IL1 RAP de cabra anti-humano marcado con biotina (lote 667, R&D Systems, Abingdon, Reino Unido) a una dilución de 1:100 para la tinción de las células durante 30 mm en hielo. Posteriormente, las células se lavaron y se usó estreptavidina conjugada con PE a una dilución de 1:200 por 30 min. Se usaron los anticuerpos monoclonales APC-conjugado anti-CD34 y FITC-conjugado anti-CD38 para la co-tinción (excepto IL1RAP todos los anticuerpos utilizados fueron adquiridos de Beckton-Dickinson lmmunocytometry Systems, Mountain View, CA). Antes de la clasificación de las células, las células fueron lavadas dos veces para evitar la unión inespecífica de la estreptavidina conjugada con PE. Se usaron anticuerpos de control de coincidencia con isotipos como controles negativos. Clasificación de células y FISH de interfaz

Portaobjetos de vidrio fueron tratados con poli L-lisina al 0,01 % (Sigma-Aldrich, Estocolmo, Suecia) durante dos horas mientras se mantenían en una cámara húmeda, se lavaron una vez en agua, y se secaron sobre una placa caliente a 37°C hasta el secado. Posteriormente, una pluma hidrófoba (Daido Sangyo Co., Ltd. Tokio, Japón) se utilizó para dibujar círculos con una placa de cultivo de tejido de 96 pocillos como plantilla. Antes de la clasificación de células, pero después de por lo menos dos horas de secado a temperatura ambiente, 25 µl de PBS se aplicó a los anillos para formar gotas. Durante la clasificación de células, de 30 a 3000 células fueron clasificadas simultáneamente y directamente en dos gotas. Para permitir la fijación de las células a la superficie y para evitar el secado de las gotas, los portaobjetos se mantuvieron en una cámara húmeda en hielo durante 30 min antes de que las células fueron fijadas en metanol:ácido acético (3:1) por 10 min. Posteriormente, los portaobjetos se incubaron a 70 °C en un horno durante la noche, seguido por FISH. Se usaron sondas de doble color para el BCR/ABL1 (Abbot, Wiesbaden, Alemania).

Células iniciadoras de cultivo a largo plazo (LTC-IC) Células del estroma M210B4 se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con FCS al 10 % como se describió previamente24,25. Dos días antes de la clasificación de células, las células del estroma fueron sembradas en pocillos de una placa de 96 pocillos a una densidad de 50,000 células por ml en 200 µl de medio Myelocult (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canadá), que contenían hidrocortisona 10-6 M (Sigma-Aldrich, Estocolmo, Suecia). Veinticuatro horas antes de la clasificación de células, las células del estroma se irradiaron con 1000 rad. Durante la clasificación de células, 100-500 células fueron clasificadas directamente en los pocillos previamente revestidos de estroma en duplicados y 100 µl de medio se intercambió 3 horas más tarde. Una vez a la semana, el intercambio de 100 µl de medio de cultivo se repitió. Después de 5-6 semanas de cultivo, las células se lavaron y se colocaron en un medio de metilcelulosa (MethoCult H44435, Stem Cell Technologies) en una placa de 24 pocillos. Dos semanas más tarde, el número de colonias se calificó. Las colonias de pocillos individuales se combinaron, se lavaron, se aplicaron a gotas de PBS en portaobjetos, y seguido por análisis FISH como se describió anteriormente.

Expresión de P210 BCR/ABL1 en células CD34+ de sangre de cordón umbilical Muestras de sangre de cordón umbilical fueron recolectadas en partos normales después de obtener el consentimiento informado de acuerdo a un protocolo aprobado por la junta ética local. Las células CD34+ fueron enriquecidas como se describió anteriormente22, dando una pureza de células CD34+ superior al 95 %. Los vectores virales RD114 pseudotipificado MSCV-IRES-GFP (MIG) y MIG-P210 vectores virales se utilizaron en este estudio23. Las células CD34+ fueron cultivadas y transducidas en un medio SFMM (Stem Cell Technology, Vancouver, Canadá), suplementado con trombopoyetina (TPO, 50 ng/ml), factor de hemocitoblastos (SCF, 100 ng/ml), y Flt-3- Ligando (FL, 100 ng/ml) como se describió anteriormente23.

Resultados y Discusión El análisis global de expresión génica identifica al IL1RAP como sobre-regulado en células CD34+ de CML Mucho esfuerzo se ha puesto en las investigaciones encaminadas a identificar un biomarcador de la superficie celular para los hemocitoblastos Ph+ de CML (revisado C Eaves14). Las células leucémicas y las normales y pueden mejor ser fácilmente identificadas retrospectivamente en la CML después de la detección del gen de fusión BCR/ABL1 específico de la leucemia mediante FISH, por lo que es un trastorno ideal para evaluar los intentos de separar de forma prospectiva las células leucémicas y normales. Sin embargo, hasta ahora, ningún marcador de superficie celular se ha identificado que permita la separación prospectiva de los hemocitoblastos de la CML de HSC normales. Los análisis globales de expresión génica han demostrado ser una estrategia poderosa en la búsqueda de nuevos marcadores de HSC, tales como los receptores de SLAM que distinguen hemocitoblastos hematopoyéticos y células progenitoras15. Para buscar los genes sobre-regulados que codifican biomarcadores de la superficie celular candidatos de los hemocitoblastos de CML, se compararon los perfiles de transcripción de las células CD34+ a partir de 11 muestras de pacientes con CML y 5 muestras de médula ósea normal (bm). Los genes sobre-regulados identificados en la CML se igualaron a la categoría de Ontología de Genes (GO) "integral a la membrana plasmática", que había sido curada de forma manual para incluir todas las moléculas CD conocidas (ver Material y Métodos para más detalles). En total, 13 genes sobre-regulados en células CD34+ de CML coincidieron con la categoría de gen integral a la membrana plasmática (datos no mostrados). Para establecer un vínculo adicional de los genes sobre-regulados más directamente a la expresión P210 BCR/ABL1, en paralelo se generó una lista de genes sobre-regulados como consecuencia de la expresión P210 BCR/ABL1 en las células de la sangre de cordón umbilical CD34+. Este análisis dio como resultado 23 genes sobre-regulados que igualaron la misma lista de genes de categoría GO (datos no mostrados). Curiosamente, sólo un gen, la proteína accesoria del receptor de interleucina 1 (IL1RAP), mostró una fuerte sobre-regulación tanto en células CD34+ de CML como en las células de la sangre de cordón umbilical CD34+ como consecuencia de la expresión de P210 BCR/ABL1: Los hallazgos de que IL1RAP estaba presente en ambas listas de genes sugiere que su sobre-regulación en las células primitivas de CML está estrechamente unida a la expresión de P210 BCR/ABL1 e indica que la IL1RAP es un antígeno asociado a la leucemia novedoso en las células primitivas de CML. El IL1RAP es sobre-regulado en células CD34+CD38- de pacientes con CML y se induce como consecuencia de la

expresión ectópica de P210 BCR/ABL1

El IL1RAP es un miembro de la superfamilia de receptores similares a Toll y es un co-receptor bien conocido del receptor tipo 1 de interleucina 1 (IL-1R1)16. Por lo tanto, el IL1RAP es crucial en la mediación del efecto de las citocinas IL-1 pro-inflamatorias, pero también está involucrado en la mediación de la señal de la IL-33, una citocina que activa las células T y los hemocitoblastos a través de la unión a su receptor ST2, que posteriormente se dimeriza con IL1RAP17. La activación de IL-1R1 ha sido demostrada previamente para estimular el crecimiento de colonias de células de CML sensibles al interferón18, sin embargo, el IL1RAP, a nuestro conocimiento, no ha sido previamente relacionado directamente con la CML. Ya que el P210 BCR/ABL1 está presente en las células de la CML como un sello distintivo de la enfermedad, idealmente, un biomarcador de la superficie celular confiable en la CML, debe estar directamente unido a la presencia y la expresión de P210 BCR/ABL1. De acuerdo con los datos de micromatrices, la expresión de IL1RAP fue de hecho sobre-regulada en la superficie celular de las células CB CD34+ tras la expresión retroviral de P210 BCR/ABL1 (Fig. 1). Esto sugiere que P210 BCR/ABL1 regula la expresión de IL1RAP, ya sea directamente o a través de un efecto indirecto, fortaleciendo de su candidatura como un biomarcador de la CML.

A continuación investigamos la expresión de IL1RAP en la superficie celular de las células de CML CD34+CD38+, que representan a la mayoría de las células y más maduras CD34+. En esta población de células, una sobre- regulación de IL1RAP se observó en comparación con la expresión en células bm normales correspondientes (Fig. 2). Las células normales CD34+CD38+ desplegaron una menor expresión de IL1RAP que se superpuso parcialmente con la expresión en las células de CML. Cuando se volvió hacia el compartimiento de las células CD34+CD38- de las células normales, contenían las HSC. De acuerdo con un estudio anterior, esta población mostró una expresión de IL1RAP baja/ausente (Figura 2C)19. Sorprendentemente, las células CD34+CD38- procedentes de pacientes con CML, que albergan tanto los hemocitoblastos Ph* CML y HSC normales se dividieron en dos poblaciones, una que tenía expresión baja/ausente de IL1RAP, la otra que tenía una mayor expresión de expresión de IL1RAP (Fig. 2C).

En la sangre periférica (PB) de cinco pacientes con CML, la fracción de células positivas a IL1RAP constituyó entre el 75 % y 95 % de las células CD34+CD38- (n = 5). Con base en estos resultados, se especula que la expresión de IL1RAP puede distinguir las células normales y leucémicas en el compartimiento de células CD34+CD38- en la CML. Ya que todos los hemocitoblastos de CML y HSC normales se encuentran exclusivamente dentro de las células CD34+CD38-, esa separación entre las células normales y leucémicas, permitiría una separación prospectiva de los hemocitoblastos de la CML de las HSC normales. El Flujo-gota-FISH muestra que la expresión de IL1RAP separa las células normales y leucémicas en las células de CML CD34+CD38-

Para examinar si la expresión de IL1RAP distingue células normales (Ph-) y leucemias (Ph+) dentro del compartimento celular de CML CD34+CD38-, hemos establecido un nuevo protocolo para hacer hibridación in situ fluorescente (FISH) en un pequeño número de células seleccionadas (ver Material y Métodos). Los primeros pasos en este protocolo se basan en parte en un método para clasificar las células en gotas en los portaobjetos, seguido de una sola inmuno-tinción de células20. Mediante la aplicación de este nuevo protocolo que implica la clasificación de células directamente en gotas en los portaobjetos seguido por FISH, en lo sucesivo llamado flujo-gota-FISH, se clasificaron tan sólo 30 células en una gota, de las cuales 15 núcleos fueron calificados con éxito por FISH (CML-5, Figura 3). Curiosamente, hemos observado por flujo-gota-FISH que las células CML CD34+CD38-IL1RAP + fueron BCR/ABL1+, mientras que las células CML CD34+CD38-IL1RAP- fueron casi exclusivamente Ph- (n = 5, Fig. 3). Estos datos muestran que la expresión de IL1RAP separa las células leucémicas y normales dentro del compartimiento de células CML CD34+CD38-, lo que indica que los hemocitoblastos de CML y HSC normales pueden ser separadas de forma prospectiva. Los hemocitoblastos de CML son CD34+CD38-IL1RAP+, mientras que las HSC normales son CD34+CD38-IL1RAP- /baja

Los estudios sobre los hemocitoblastos en la CML de fase crónica hasta el momento se basaron en el acceso a los escasos pacientes con CML en los que el compartimiento de los hemocitoblastos ha sido dominado por las células leucémicas después de los ensayos a largo plazo14. Ya que los hemocitoblastos de CML en general, muestran injertos deficientes en los ratones inmunodeficientes, el ensayo de células iniciadoras de cultivo a largo plazo (LTC- IC) se utiliza ampliamente como un ensayo sustituto para la detección de los hemocitoblastos de CML candidatos. Para probar si la CML CD34+CD38-ILIRAP+ y CD34+CD38-IL1RAP-/baja únicamente contienen hemocitoblastos de CML candidatos y HSC normales, respectivamente, hemos probado las dos poblaciones de células en el ensayo de LTC-IC. Para células de médula ósea CD34+ de los controles normales, las células formadoras de colonia en cultivos de largo plazo (LTC-CFC) se encontraron en una frecuencia de >100 veces más alta entre las células CD34+CD38-IL1RAP- en comparación con las células CD34+CD38-IL1RAP+ (Fig. 4A, n = 2), lo que indica que las células normales CD34+CD38-IL1RAP- son jerárquicamente superiores que las CD34+CD38-ILIRAP+. En la CML, se observó en promedio de 3 a 6 veces de mayor frecuencia de LTC-CFC dentro de las células CD34+CD38-IL1RAP- en comparación con las células CD34+CD38-IL1RAP+ (n = 5, Fig. 4A), lo que sugiere que las células CD34+CD38- IL1RAP- de CML están más enriquecidas de células primitivas. Es importante destacar que, a pesar de que un mayor número de LTC-IC se encuentra entre las células CD34+CD38-IL1RAP- que entre las células CD34+CD38- IL1RAP+ tanto de las muestras de pacientes con CML y de los controles normales, el FISH en las colonias LTC de CML reveló una discriminación casi completa entre las células Ph- y Ph+ en los dos grupos (Fig. 4B). Las colonias LTC de CML derivadas de las células CD34+CD38-IL1RAP- fueron casi exclusivamente Ph-, mientras que las células CD34+CD38-IL1RAP+ fueron casi exclusivamente Ph+. Estos datos sugieren que la IL1RAP es un biomarcador de la superficie celular novedoso que se puede utilizar para separar los hemocitoblastos de la CML de HSC normales.

Aquí, se identificó a través del análisis global de la expresión génica un antígeno de superficie celular novedoso, IL1RAP, que después de un reto en múltiples ensayos cumplió con los criterios para ser un biomarcador de la superficie celular novedoso para hemocitoblastos de CML de Ph+. Basándose en este descubrimiento, las futuras terapias dirigidas en la CML pueden ser diseñadas para dirigirse a los hemocitoblastos de CML, preservando las HSC normales utilizando un anticuerpo terapéutico dirigido a IL1RAP. Además, un cóctel de anticuerpos que contiene anticuerpos anti-CD34, anti-CD38 y anti-IL1RAP puede ser utilizado para fines de diagnóstico y para estudios de seguimiento de pacientes con CML bajo diferentes tratamientos. Es importante destacar que una separación prospectiva de hemocitoblastos de CML y células normales permitirá futuros estudios sobre el mecanismo de estas dos poblaciones de células. Además, aquí también se muestra que el flujo-gota-FISH podría servir como un método útil en la caracterización de las aberraciones genéticas en un pequeño número de células clasificadas, tales como los hemocitoblastos leucémicos, un tipo de célula que ha sido purificado de las poblaciones de células cada vez más pequeñas y más puras21. Para futuros estudios, este método sería, por ejemplo, permitir la detección de aberraciones genéticas en varias poblaciones pequeñas de células progenitoras y leucémicas, hallazgos que puedan proporcionar nuevos conocimientos sobre que ordenes las diversas aberraciones han sido adquiridas, los conocimientos clave para entender la leucemogénesis. Además, el flujo-gota-FISH podría ser utilizado para vigilar los efectos terapéuticos sobre los hemocitoblastos leucémicos durante el tratamiento. Es importante destacar que aquí se identifican mediante el uso de flujo-gota-FISH que al IL1RAP es el primer biomarcador de la superficie celular que distingue a los hemocitoblastos de CML de las células HSC normales, un hallazgo que abre nuevas oportunidades terapéuticas para la CML y otros trastornos hematológicos neoplásicos asociadas a la sobre-regulación de IL1RAP sobre los hemocitoblastos y/o células progenitoras. Referencias 1. Deininger MW, Goldman JM, Melo JV. The molecular biology of chronic myeloid leukemia. Blood. 2000, 96:3343- 3356. 2. Fialkow PJ, Denman AM, Jacobson RJ, Lowenthal MN. Chronic myelocytic leukemia. Origin of some lymphocytes from leukemic stem cells. J Clin Invest. 1978;62:815-823. 3. Kavalerchik E, Goff D, Jamieson CH. Chronic myeloid leukemia stem cells. J Clin Oncol. 2008; 26:2911-2915. 4. Jiang X, Zhao Y, Smith C, et al. Chronic myeloid leukemia stem cells possess multiple unique features of resistance to BCR-ABL targeted therapies. Leukemia. 2007; 21:926-935. 5. Copland M, Hamilton A, Elrick LJ, et al. Dasatinib (BMS-354825) targets an earlier progenitor population than imatinib in primary CML but does not eliminate the quiescent fraction. Blood. 2006;107:4532-4539. 6. Jin L, Hope KJ, Zhai Q, Smadja-Joffe F, Dick JE. Targeting of CD44 eradicates human acute myeloid leukemic stem cells. Nat Med. 2006;12:1167-1174.

7. Tavor S, Petit I, Porozov S, et al. CXCR4 regulates migration and development of human acute myelogenous leukemia stem cells in transplanted NOD/SCID mice. Cancer Res. 2004; 64: 2817-2824. 8. Jin L, Lee EM, Ramshaw HS, et al. Monoclonal antibody-mediated targeting of CD123, IL-3 receptor alpha chain, eliminates human acute myeloid leukemic stem cells. Cell Stem Cell. 2009;5:31-42. 9. Majeti R, Chao MP, Alizadeh AA, et al. CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic anti-body target on human acute myeloid leukemia stem cells. Cell. 2009;138:286-299. 10. Hosen N, Park CY, Tatsumi N, et al. CD96 is a leukemic stem cell-specific marker in human acute myeloid leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104:11008-11013. 11. van Rhenen A, van Dongen GA, Kelder A, et al. The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells. Blood. 2007;110:2659-2666.

12. Eisterer W, Jiang X, Christ O, et al. Different subsets of primary chronic myeloid leukemia stem cells engraft immunodeficient mice and produce a model of the human disease. Leukemia. 2005;19:435-441. 13. Bhatia M, Wang JC, Kapp U, Bonnet D, Dick JE. Purification of primitive human hematopoietic cells capable of repopulating immune-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997; 94:5320-5325. 14. Jiang X, Zhao Y, Forrest D, Smith C, Eaves A, Eaves C. Stem cell biomarkers in chronic myeloid leukemia. Dis Markers. 2008;24:201-216. 15. Kiel MJ, Yilmaz OH, Iwashita T, Terhorst C, Morrison SJ. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endotelial niches for stem cells. Cell. 2005;121:1109-1121. 16. Subramaniam S, Stansberg C, Cunningham C. The interleukin 1 receptor family. Dev Comp Immunol. 2004;28:415-428.

17. Ali S, Huber M, Kollewe C, Bischoff SC, Falk W, Martin MU. IL-1 receptor accessory protein is essential for IL-33- induced activation of T lymphocytes and mast cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104:18660-18665. 18. Estrov Z, Kurzrock R, Wetzler M, et al. Suppression of chronic myelogenous leukemia colony growth by interleukin-1 (IL-1) receptor antagonist and soluble IL-1 receptors: a novel application for inhibitors of IL-1 activity. Blood. 1991;78:1476-1484.

19. Hystad ME, Myklebust JH, Bo TH, et al. Characterization of early stages of human B cell development by gene expression profiling. J Immunol. 2007;179:3662-3671.

20. Ema H, Morita Y, Yamazaki S, et al. Adult mouse hematopoietic stem cells: purification and single-cell assays. Nat Protoc. 2006;1:2979-2987. 21. Dick JE. Stem cell concepts renew cancer research. Blood. 2008;112:4793-4807. 22. Nilsson M, Karlsson S, Fan X. Functionally distinct subpopulations of cord blood CD34+ cells are transduced by adenoviral vectors with serotype 5 or 35 tropism. Mol Ther. 2004;9:377-388. 23. Jaras M, Johnels P, Agerstam H, et al. Expression of P190 and P210 BCR1ABL1 in normal human CD34(+) cells induces similar gene expression profiles and results in a STAT5-dependent expansión of the erythroid lineage. Exp Hematol. 2009;37:367-375. 24. Hogge DE, Lansdorp PM, Reid D, Gerhard B, Eaves CJ. Enhanced detection, maintenance, and differentiation of primitive human hematopoietic cells in cultures containing murine fibroblasts engineered to produce human steel factor, interleukin-3, and granulocyte colony-stimulating factor. Blood. 1996;88:3765-3773. 25. Castor A, Nilsson L, Astrand-Grundstrom I, et al. Distinct patterns of hematopoietic stem cell involvement in acute lymphoblastic leukemia. Nat. Med. 2005;11:630-637.

EJEMPLO 2 Direccionamiento de anticuerpos de IL1RAP en hemocitoblastos de leucemia y células progenitoras provoca citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC)

Sumario Las estrategias terapéuticas para las leucemias encaminadas a lograr una cura permanente requerirá una completa erradicación de los hemocitoblastos de la leucemia. Los hemocitoblastos leucémicos, representan una pequeña población de células leucémicas, hasta el momento han sido indistinguibles de los hemocitoblastos hematopoyéticos normales (HSC), usando marcadores de superficie celular. Un nuevo concepto para dirigirse a los hemocitoblastos de la leucemia sería identificar un biomarcador de la superficie celular para los hemocitoblastos de la leucemia, a los que anticuerpos terapéuticos futuros podrían ser dirigidos (ver Ejemplo 1). En este estudio, se genera una anticuerpos anti-IL1RAP y proporciona una prueba del concepto de que los anticuerpos anti-IL1RAP dirigidos a los hemocitoblastos de la leucemia mieloide crónica (CML), los hemocitoblastos de la leucemia mieloide aguda (AML), los hemocitoblastos de la leucemia linfoblástica aguda (ALL), pueden ser utilizados para inducir citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC), mientras que ningún efecto citotóxico se observó en HSC normales. Además, se demostró una ADCC dirigida a IL1RAP dependiente de la dosis en las líneas celulares positivas a IL1RAP KU812 (CML), MONO-MAC-6 (leucemia mieloide aguda, AML) y REH (línea celular aguda linfoblástica, ALL). También se demostró que los hemocitoblastos de MDS y MPD tienen una mayor expresión de IL1RAP, indicativo de los futuros anticuerpos terapéuticos dirigidos anti IL1RAP serán efectivos también en estos trastornos. Este estudio abre así una nueva oportunidad terapéutica en la CML, AML, ALL, MDS, y el MPD por direccionamiento de anticuerpos de IL1 RAP sobre los hemocitoblastos leucémicos. Materiales y Métodos Generación de KMT-1; un anticuerpo IL1RAP policlonal de conejo anti-humano

Se inmunizaron conejos con el dominio extracelular de IL1RAP. Suero de conejos fue purificado de acuerdo con procedimientos estándar, excepto que un paso adicional se añadió, en el que los anticuerpos de unión al dominio de inmunoglobulina, presentes en la proteína inmunizante para aumentar la vida media, se descartó a través de la unión a columnas cargadas con inmunoglobulina. Anticuerpos purificados fueron confirmados en ELISA para enlazar el dominio extracelular de IL1RAP y estar desprovistos de anticuerpos que se unen el dominio de inmunoglobulina humana. Cuando se utiliza en la citometría de flujo, un anticuerpo IgG PE-conjugado de cabra anti-conejo se utilizó como reactivo secundario. Ensayo de ADCC

El ensayo de ADCC se basó en un protocolo previamente descrito1. En resumen, las células diana fueron etiquetadas con PKH26 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y las células fueron ya sea puestas directamente en los pocillos de una placa de 96 pocillos, o sembradas en los pozos después de la clasificación de las células CD34+CD38-. Las líneas celulares KU812 y KG-1 y células primarias CD34+ fueron sembradas a 10,000 células por pocillo, en tanto que las células primarias CD34+CD38- fueron sembradas a 2,000 -3,000 células por pocillo. Posteriormente, los anticuerpos se añadieron a los pocillos en diferentes concentraciones y se incubaron durante 20 min antes de que células efectoras 100,000 NK fueran añadidas a cada pocillo. Las células NK se extrajeron de voluntarios sanos después de consentimiento informado mediante el uso de un kit de aislamiento de células negativa de células NK de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania). Anticuerpos IgG de conejo purificados a partir de un conejo no inmunizado se utilizaron como anticuerpos de control en los experimentos (R&D Systems Abingdon, Reino Unido). Células positivas 7-AAD para la detección de muerte celular fueron medidas con un citómetro de flujo FACS CANTO (BD). El promedio y desviación estándar de la muerte celular inducida por los anticuerpos se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación (Porcentaje 7-AAD + células en la concentración de anticuerpos definida - Porcentaje de 7-AAD + células sin anticuerpos)/(0,01 x Porcentaje 7-AAD-células sin anticuerpos) de por lo menos tres experimentos independientes (excepto la figura, 1 único experimento). Las muestras de once pacientes con AML y dos pacientes con Ph+ ALL fueron recibidas del Hospital Universitario de Lund y la expresión de IL1RAP se analizó en las poblaciones celulares de CD34+CD38+ y CD34+ CD38- utilizando la misma configuración que para el análisis de células de CML. La línea celular de AML MONO-MAC-6 y la línea celular REH también fueron probadas en los ensayos de ADCC utilizando la misma configuración que la de las líneas celulares KG-1 y KU812. Resultados

Direccionamiento de anticuerpos de IL1RAP en hemocitoblastos de CML y células progenitoras, y también en una línea celular de CML que dirige las células de NK a ADCC La citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) es un mecanismo conservado del sistema inmune innato, a través del cual varios anticuerpos terapéuticos, tales como rituximab dirigido contra CD20, se cree que por lo menos parcialmente, ejercen su efecto terapéutico2. Para probar si la ADCC se podría lograr usando IL1RAP como una diana, se generó un anticuerpo policlonal de conejo anti-humano de IL1RAP en lo sucesivo referido como KMT-1, como el dominio Fc de anticuerpos de conejo en contraste, los anticuerpos de cabra son reconocidos por las células del sistema inmune humano.

Como era de esperar, bajos niveles de ADCC se observaron en la línea celular KG-1 de leucemia negativa/baja de IL1RAPKG-1, incluso a altas concentraciones de KMT-1 (Fig. 5A, 5B). En contraste, en la línea celular de CML KU812 que expresa IL1RAP, se observó una ADCC mediada por células asesinas naturales (NK) en presencia de KMT-1 (Fig. 5A, 5B), demostrando que KMT-1 tiene el potencial para inducir ADCC mediante el reclutamiento de células inmunes citotóxicas a células diana IL1RAP+.

En las células primarias de pacientes con CML y de los controles normales, el KMT-1 mostró un patrón de tinción ligeramente más débil, pero similar al anticuerpo policlonal de cabra antihumano de IL1RAP (Ejemplo 1, fig. 6A). Células inmaduras de CML-1, CML-3 y CML-4 (no más células se mantuvieron de CML-2 y CML-5) se probaron en los ensayos de ADCC en paralelo a las células de las muestras de control sanas. En las células CML CD34+, la unión de KMT-1 resultó en la ADCC a niveles más altos que en células de control CD34+ normales, que correlacionan con el nivel de expresión de IL1RAP, en particular a concentraciones inferiores de anticuerpos (Fig. 6B). Más sorprendente aún, entre los hemocitoblastos enriquecido de las células CD34+CD38-, el KMT-1 no indujo ADCC de células CD34+ CD38- normales, mientras que una efecto claro de ADCC dependiente de la dosis fue observado en las células CML CD34+CD38- (Fig. 6B), mostrando de nuevo una fuerte correlación con el patrón de expresión de IL1 RAP en estos tipos de células. Anticuerpos que se dirigen a IL1RAP en células AML y células ALL dirigen las células NK a ADCC La expresión de IL1RAP se observó en células AML CD34+CD38- en 9 de 11 muestras analizadas (Fig. 7A). En la población celular de CD34+CD38+, un patrón de expresión similar de IL1RAP se observó (Fig. 7A). Además, la IL1RAP se expresó en la línea celular de AML MONO-MAC-6 y la línea celular de ALL REH (Fig. 7B). La expresión de IL1RAP también se observó en células Ph+ ALL CD34+CD38- en 2 de 2 muestras analizadas (Fig. 7C). Usando IL1RAP como diana, las líneas celulares MONOMAC-6 y REH también fueron probadas en los ensayos de ADCC. En ambas líneas celulares, un efecto de ADCC de direccionamiento de IL1RAP dependiente de la dosis fue observado (Fig. 8), lo que demuestra que laos anticuerpos de direccionamiento anti-IL1RAP terapéuticos tienen una aplicación más amplia que solo para la CML. También se realizaron experimentos en ADCC en células primarias de AML y ALL CD34+CD38- y se demostró la prueba de principio de que también en estos trastornos, una mayor muerte celular podría lograrse mediante KMT-1 (Figs. 9A-9B). Además, las células CD34+CD38- de un paciente de MDS en la progresión a AML y dos pacientes con MPD (uno de ellos Mutación+ JAK2) se tiñeron con un anticuerpos de direccionamiento a IL1RAP. Un aumento de la expresión de IL1RAP se observó en comparación con las células de médula ósea normales CD34+CD38- (Figs. 10A-10B, Fig.

2C). Discusión En el presente estudio, hemos identificado a IL1RAP como el primer biomarcador de la superficie celular que distingue a los hemocitoblastos de CML candidatos de las HSC normales y utiliza este conocimiento para inducir una muerte celular dependiente de anticuerpos de los hemocitoblastos de CML. Además, hemos identificado al IL1RAP como sobre-regulado en hemocitoblastos de AML, hemocitoblastos de ALL, hemocitoblastos de MPD y hemocitoblastos de MDS y se mostró que ambos de los hemocitoblastos de AML y los hemocitoblastos de ALL pueden ser eliminados usando un anticuerpo de direccionamiento a IL1RAP, mientras que los hemocitoblastos normales no fueron afectados. Sobre la base de la constatación de que los hemocitoblastos de CML, ALL y AML hemocitoblastos pueden ser eliminados por anticuerpos de direccionamiento de IL1RAP, se espera que también los hemocitoblastos de MPD y MDS serían eliminados en el ensayo de ADCC Estos resultados abren un nuevo concepto para el tratamiento de pacientes con leucemia por el direccionamiento directo de los hemocitoblastos de la leucemia, un concepto que es distinto de los inhibidores de la tirosina cinasa que actualmente se utiliza, el cual preferentemente se dirige a células en la dirección 3’ de los hemocitoblastos de CML3,4.

La razón por la cual los hemocitoblastos de CML son resistentes a los fármacos como Glivec es en parte poco clara, pero los factores que pueden contribuir son las características tales como la quietud y el nivel relativamente alto de la expresión de BCR/ABL1, y también la expresión combinatoria de las proteínas transportadoras específicas de la membrana de estas células3,5,6. Dadas estas características de los hemocitoblastos de CML, es altamente deseable encontrar nuevos enfoques de tratamiento para erradicar finalmente los hemocitoblastos de CML Una terapia basada en anticuerpos que se dirigen directamente a los hemocitoblastos de CML serviría en tal estrategia ya que el modo de acción de los anticuerpos es independiente de los mecanismos resistentes conocidos causantes de que los hemocitoblastos de CML no respondan a los tratamientos inhibidores de la cinasa. Las principales limitaciones de esta evolución han sido la falta completa de un receptor de superficie celular que distinga los hemocitoblastos Ph* de CML de los normales sanos (Ph-). Aquí se identificó al IL1RAP como tal diana de los análisis globales de expresión génica y de manera importante ligaron su expresión a la expresión de BCR/ABL1 (véase el Ejemplo 1 anterior). Es importante destacar que, por la generación de un anticuerpo dirigido a IL1RAP, aquí, por primera vez, se proporciona una prueba del concepto de que hemocitoblastos de CML candidatos pueden ser apuntados preservando al mismo tiempo las HSC normales. Es importante destacar que, ya que el modo de acción de los anticuerpos en la ADCC es dirigir las células inmunológicas para dirigir la muerte celular, el mecanismo terapéutico es independiente de los mecanismos conocidos que causan resistencia al inhibidor de cinasa en la CML utilizando tratamientos actuales. Entonces, el direccionamiento de anticuerpos de los hemocitoblastos de CML tiene la capacidad de erradicar los hemocitoblastos de CML, ya sea solo o en combinación con los regímenes actuales, en última instancia conduciendo a una cura permanente para pacientes con CML. Curiosamente, hemos observado también que los anticuerpos de direccionamiento a IL1RAP pueden causar ADCC de los hemocitoblastos de AML, el tipo más común de leucemia aguda en adultos que tienen un mal pronóstico, y también de los hemocitoblastos de ALL, el tipo más común de leucemia infantil. En conjunto, el hallazgo de la expresión de IL1RAP en hemocitoblastos leucémicos que tienen un inmuno-fenotipo de CD34+CD38- CML, AML, ALL, MDS, y MPD, y los experimentos de ADCC demostraron muerte celular de una manera dependiente de IL1RAP, indica que estos trastornos pueden ser tratados con anticuerpos terapéuticos anti-IL1RAP. En los experimentos de ADCC presentados en este documento, un anticuerpo policlonal anti-humano de IL1RAP fue utilizado (que es esencialmente una mezcla de varios anticuerpos monoclonales diferentes). Sin embargo, se apreciará por las personas expertas en la técnica que anticuerpos monoclonales individuales dirigidos a IL1RAP también pueden ser identificados como teniendo potencial de ADCC. Referencias

1. Wilkinson RW, Lee-MacAry AE, Davies D, Snary D, Ross EL. Antibodydependent cell-mediated cytotoxicity: a flow cytometry-based assay using fluorophores. J Immunol Methods. 2001;258:183-191. 2. Morris JC, Waldmann TA. Antibody-based therapy of leukaemia. Expert Rev Mol Med. 2009;11:e29. 3. Copland M, Hamilton A, Elrick LJ, et al. Dasatinib (BMS-354825) targets an earlier progenitor population than

imatinib in primary CML but does not eliminate the quiescent fraction. Blood. 2006;107:4532-4539. 4. Jorgensen HG, Allan EK, Jordanides NE, Mountford JC, Holyoake TL. Nilotinib exerts equipotent antiproliferative effects to imatinib and does not induce apoptosis in CD34+ CML cells. Blood. 2007;109:4016- 4019. 5. Graham SM, Jorgensen HG, Allan E, et al. Primitive, quiescent, Philadelphiapositive stem cells from patients

with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro. Blood. 2002;99:319-325. 6. Jiang X, Zhao Y, Smith C, et al. Chronic myeloid leukemia stem cells possess multiple unique features of resistance to BCR-ABL targeted therapies. Leukemia. 2007;21:926-935.

REIVINDICACIONES

1. Un agente que comprende o consiste en un anticuerpo con especificidad para la proteína accesoria del receptor de interleucina 1 (IL1RAP) para su uso en el tratamiento de una leucemia, siendo el agente capaz de inducir citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) de hemocitoblastos patológicos y/o células progenitoras asociadas a una leucemia, en donde las células expresan la IL1RAP. 2. Un agente para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los hemocitoblastos patológicos y/o las células progenitoras comprenden un gen de fusión BCR/ABL1.

3. Un agente para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la leucemia se selecciona del grupo que consiste en leucemia mieloide crónica (CML), trastornos mieloproliferativos (MPD), síndrome mielodisplásico (MDS), leucemia linfoblástica aguda (ALL) y leucemia mieloide aguda (AML).

4. Un agente para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo tiene especificidad para la IL1RAP humana. 5. Un agente para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una porción citotóxica.

6. Uso de un agente tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una leucemia. 7. Un método in vitro para el diagnóstico o el pronóstico de una leucemia, comprendiendo el método: (a) proporcionar una muestra de médula ósea o de sangre periférica de células hematopoyéticas de un individuo que va a someterse a ensayo (b) aislar una subpoblación de células CD34+, CD38- procedentes de las células hematopoyéticas; y (c) determinar si los hemocitoblastos, contenidos dentro de las células CD34+, CD38- expresan los marcadores de la superficie celular IL1 RAP; en donde los hemocitoblastos que muestran el perfil del marcador de la superficie celular de CD34+, CD38- y IL1RAP+ son indicativos de que el individuo tiene o desarrolla leucemia.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el trastorno hematológico neoplásico se selecciona del grupo que consiste en leucemia mieloide crónica (CML), trastornos mieloproliferativos (MPD), síndrome mielodisplásico (MDS), leucemia linfoblástica aguda (ALL) y leucemia mieloide aguda (AML).