Un método para la expresión heteróloga de una proteína inmunogénica que comprende a) al menos 90 aminoácidos consecutivos de la secuencia

b) una secuencia de longitud completa con al menos un 70% de identidad con la secuencia y en donde el péptido líder de la proteína está eliminado

Expresión heteróloga de proteínas de Neisseria.

5 CAMPO TECNICO

Esta invención corresponde al campo de la expresión de proteínas. En particular se refiere a la expresión heteróloga de proteínas de Neisseria (por ejemplo N.gonorrhoeae o, preferiblemente, N. meningitidis) .

TECNICA ANTERIOR

Las solicitudes de patente internacional WO 99/24578, WO 99/36544, WO 99/57280 y WO 00/22430 describen proteínas de Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae. Típicamente estas proteínas se describen

como expresadas en E. coli (esto es, expresión heteróloga) como fusiones GST N-terminales o fusiones His-tag Cterminales, aunque también se describen otros sistemas de expresión, incluida la expresión en Neisseria nativa. El documento FRA- 2720408 describe la producción heteróloga de una proteína de N. meningitidis en la que se ha suprimido al menos un dominio.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar enfoques alternativos y mejorados para la expresión heteróloga de estas proteínas. Estos enfoques afectarán típicamente al nivel de expresión, la facilidad de purificación, la localización celular de expresión y/o las propiedades inmunológicas de la proteína expresada.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

Nomenclatura en la presente

[04] Las secuencias de las proteínas 2166 divulgadas en la WO99/24578, WO99/36544 y la WO99/57280 están referidas en la presente por los siguientes números de SEQ#:

Solicitud Secuencias de proteína SEQ# en la presente WO99/24578 Even SEQ IDs 2-892 SEQ#s 1-446 WO99/36544 Even SEQ IDs 2-90 SEQ#s 447-491 WO99/57280 Even SEQ IDs 2-3020 Even SEQ IDs 3040-3114 SEQ IDs 3115-3241 SEQ#s 492-2001 SEQ#s 2002-2039 SEQ#s 2040-2166

Además de esta numeración de SEQ#, también se usan las convenciones de denominación usadas en la WO99/24578, la WO99/36544 y la WO99/57280 (por ejemplo, "ORFs4", "ORF40", "ORF40-1", etc. como se usan en la WO99/24578 y la WO99/36544: "m919", "g919" y "a919" etc. como se usan en la WO99/57280) .

Las proteínas 2160 NMB0001 a NMB2160 de Tettelin y otros [Science (2000) 287:1809-1815] son referidas en la presente como SEQ#s 2167-4326 [ver también la WO00/66791].

El término "proteína de la invención" como se usa en la presente se refiere a una proteína inmunogénica que comprende: 40 a) al menos 90 aminoácidos consecutivos de la secuencia

b) una secuencia de longitud completa con al menos un 70% de identidad con la secuencia

y en donde el péptido líder de la proteína se borra

El grado de "identidad de secuencia" al que se hace referencia en (b) es preferiblemente mayor del 50% (por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) . Esto incluye mutantes y variantes alélicas [ver por ejemplo la WO0/66741]. La identidad es preferiblemente determinada por el algoritmo de búsqueda de homología Smith-Waterman como se implementa en el programa MPSRCH (Oxford Molecular) , usando una búsqueda de huecos por afinidad con parámetros gap open penalty=12 y Gap extension penalty=1. Típicamente, un 50% de identidad o más entre dos proteínas se considera que es una indicación de equivalencia funcional.

El "fragmento" referido en (a) debería comprender la menos n aminoácidos consecutivos de una de las SEQ#s 1-4326 y, dependiendo de la secuencia particular, n es 90 o más (por ejemplo 90, 100 o más) . Preferiblemente el fragmento comprende un epítopo de una de las SEQ#s 1-4326. Los fragmentos preferidos don aquellos divulgados en la WO00/71574 y l aWO01/04316.

Las proteínas preferidas de la invención se encuentran en el serogrupo B de la N. meningitidis.

Las proteínas preferidas para el uso de acuerdo a la invención son aquellas de la cepa 2996 o la cepa 394/98 (Una cepa de Nueva Zelanda) de la N. meningitidis del serogrupo B. A menos que se indique lo contrario, las proteínas mencionadas en la presente son de la cepa 2996 de la N. meningitidis. Se apreciará, sin embargo, que la invención no está limitada en general por la cepa. Las referencias a una proteína particular (por ejemplo "287, "919") pueden ser tomadas para incluir esa proteína desde cualquier cepa.

Deleción del péptido líder

En un enfoque a la expresión heteróloga, se elimina el péptido líder nativo de una proteína de la invención. Además, se prefiere que no se use ninguna pareja de fusión.

Por lo tanto la invención proporciona un método para la expresión heteróloga de una proteína de la invención, en el que (a) el péptido líder de la proteína se borra y, opcionalmente, (b) no se usa pareja de fusión.

La invención proporciona un método para la expresión heteróloga de una proteína inmunogénica que comprende:

a) al menos 90 aminoácidos consecutivos de la secuencia

b) una secuencia de longitud completa con al menos un 70% de identidad con la secuencia

y en donde el péptido líder de la proteína se elimina.

El método implicará típicamente los pasos de: obtener ácido nucleíco que codifica una proteína de la invención; manipular el mencionado ácido nucleíco para retirar los nucleótidos que codifican el péptido líder de la proteína. EL ácido nucleíco resultante puede ser insertado en un vector de expresión, o puede ser ya parte de un vector de expresión. El primer aminoácido de la proteína expresada será el de la proteína nativa madura.

este método puede aumentar los niveles de expresión. Para la proteína 919, por ejemplo, los niveles de expresión en la E. coli son mucho más altos cuando el péptido líder se elimina. La expresión aumentada puede deberse a una localización alterada en ausencia del péptido líder.

El método se usa para la expresión de la 287.

Expresión basada en el dominio

En un cuarto enfoque de la expresión heteróloga, la proteína se expresa como dominios. Esto puede ser usado en asociación con sistemas de fusión (por ejemplo GST o fusiones His-tag) .

Por lo tanto la invención proporciona un método para la expresión heteróloga de una proteína de la invención, en el que (a) al menos un dominio en la proteína se borra y, opcionalmente (b) no se usa pareja de fusión.

El procedimiento típicamente implica las etapas de: obtener ácido nucleíco que codifica una proteína de la invención; manipular el mencionado ácido nucleíco para eliminar al menos un dominio del interior de la proteína. El ácido nucleíco resultante se puede insertar en un vector de expresión o puede ser ya parte de un vector de expresión. Cuando no se usan partícipes de fusión, el primer aminoácido de la proteína expresada será el de un dominio de la proteína.

Típicamente, una proteína se divide en dominio nocionales alineándola con secuencias conocidas de bases de datos y determinando luego regiones determinantes de la proteína que presentan diferentes configuraciones de alineamiento entre sí.

El método es preferiblemente usado para la expresión de la proteína 287. Esta proteína puede ser teóricamente dividida en tres dominios, referidos como A B y C (ver Figura 5) . EL dominio B se alinea fuertemente con las proteasas de la IgA, el dominio C se alinea fuertemente con las proteínas que enlazan la transferrina, y el dominio A no muestra alineamiento fuerte con las secuencias de la base de datos. Un alineamiento de formas polimórficas de la 287 se divulga en la WO00/66741.

Una vez que una proteína se ha dividido en dominios, éstos se pueden (a) expresar individualmente, (b) suprimir de la proteína, por ejemplo proteína ABCD - ABD, ACD, BCD, etc., o (c) reordenar por ejemplo, proteína ABC - ACB, CAB, etc. Estas tres estrategias se pueden combinar con parejas de fusión, si se desea.

LA ORF46 también ha sido teóricamente dividida en dos dominios - un primer dominio (aminoácidos 1-433) que está bien conservado entre las especies y los serogrupos, y un segundo dominio (aminoácidos 433-608) que no está bien conservado. El segundo dominio preferiblemente se elimina. Un alineamiento de formas polimórficas de la ORF46 se divulga en la WO00/66741.

La proteína 564 también ha sido dividida en dominios (Figura 8) , como la proteína 961 (Figura 12) y la proteína 502 (aminoácidos 28-167 de la proteína MC58)... [Seguir leyendo]

1. Un método para la expresión heteróloga de una proteína inmunogénica que comprende a) al menos 90 aminoácidos consecutivos de la secuencia

b) una secuencia de longitud completa con al menos un 70% de identidad con la secuencia

y en donde el péptido líder de la proteína está eliminado.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la proteína comprende una secuencia de longitud completa con al menos un 80% de identidad de secuencia con la secuencia enumerada en la reivindicación 1 a) .

3. El método de la reivindicación 1, en donde la proteína comprende una secuencia de longitud completa con al menos un 90% de identidad de secuencia con la secuencia enumerada en la reivindicación 1 a) .

4. El método de la reivindicación 1, en donde la proteína comprende una secuencia de longitud completa con al menos un 95% de identidad de secuencia con la secuencia enumerada en la reivindicación 1 a) .

5. El método de la reivindicación 1, en donde la proteína comprende una secuencia de longitud completa con al menos un 99% de identidad de secuencia con la secuencia enumerada en la reivindicación 1 a) .

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde no se usa pareja de fusión.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la mencionada proteína está expresada en la E. coli.

8. EL método de la reivindicación 1 en donde la proteína consiste de la secuencia

9. Una proteína inmunogénica que consiste de la secuencia