Expresión de proteínas en células de roedor.

Célula CHO, caracterizada porque dicha célula CHO:

a) expresa el antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr

(EBNA-1), en el que el gen estructural codificante de la proteína EBNA1 se encuentra operablemente ligada a un promotor fuerte y se integra en el ADN cromosómico y la célula no contiene una copia funcional de la secuencia oriP del VEB integrada en el ADN cromosómico;

b) contiene un episoma, en el que dicho episoma comprende:

(i) un origen de replicación procariótico,

(ii) un marcador de selección,

(iii) un origen de replicación (oriP) del virus de Epstein-Barr (VEB) como elemento único derivado del VEB y no contiene una copia funcional del gen estructural de EBNA-1,

(iv) un casete de expresión adecuado para la expresión de un polipéptido heterólogo en dicha célula CHO, en el que dicho casete de expresión comprende una secuencia de promotor, una región 5' no traducida, una secuencia de ácidos nucleicos codificante de dicho polipéptido heterólogo y una región 3' no traducida que comprende una señal de poliadenilación,

c) no contiene el antígeno T grande del virus del polioma

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2006/010308.

Solicitante: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG.

Nacionalidad solicitante: Suiza.

Dirección: GRENZACHERSTRASSE 124 4070 BASEL SUIZA.

Inventor/es: KOPETZKI, ERHARD, GOEPFERT,ULRICH.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/869 (Vectores herpesvirales)

PDF original: ES-2461591_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Expresión de proteínas en células de roedor

La presente invención se refiere a la expresión de proteínas heterólogas en células de roedor. El ácido nucleico codificante de proteína se proporciona en un episoma bajo el control y mantenimiento del sistema oriP/EBNA-1 del virus de Epstein-Barr, en el que tanto oriP como el gen estructural de EBNA-1 se encuentran situados en diferentes elementos en el interior de la célula.

Antecedentes tecnológicos El papel e impacto de los procedimientos de producción biotecnológica ha ganado en importancia en los últimos años. Simultáneamente a la creciente importancia de los procedimientos biotecnológicos se ha incrementado de manera constante la complejidad de los productos fabricados.

Son posibles células huésped para la expresión de proteínas heterólogas, HEK (renales embrionarias humanas) , HeLa (Henrietta Lacks) , COS (células renales de mono verde africano transformadas por SV40) y células CHO (de ovario de hámster chino) , debido a que las proteínas heterólogas expresadas en estos huéspedes pueden plegarse, procesarse, ser maduradas por proteasas, glucosilarse y sulfatarse según el patrón de las células humanas (ver, por ejemplo, Watson E. et al., Glycobiol. 4:227-37, 1994) .

El virus de Epstein-Barr (VEB) es un patógeno de los linfocitos B humanos. Pertenece a la clase de los virus herpes humanos (Herpesviridae) . Los linfocitos B transformados por VEB pueden propagarse de manera desregulada (Miller G., Virology, editado por Fields B., Raven Press, N.Y., 1985, páginas 563 a 590) . Un elemento característico de las células transformadas por VEB es la expresión de las denominadas proteínas antígenos nucleares del virus de Epstein Barr (EBNA) . Se han identificado seis variantes diferentes de estas proteínas hasta el momento.

La proteína EBNA-1 desempeña un papel importante en el ciclo de replicación del ácido nucleico del VEB en las células transformadas. En combinación con un segundo elemento del VEB, el origen de replicación (oriP) , que actúa en cis, se activa la replicación y mantenimiento de los episomas dentro de la célula (Lupton S. y Levine A.J., Mol. Cell Biol. 5:2533-2542, 1985; Yates J.L. et al., Nature (London) 313:812-815, 1985) .

El segmento de oriP está constituido de dos regiones: el elemento bivalente simétrico y la familia de repeticiones. El primero es un segmento de secuencia de 65 pb. Se encuentra separado en el ácido nucleico del virus por aproximadamente 1.000 pb de la familia de repeticiones. Este segundo elemento está compuesto de una secuencia de 30 pb que se encuentra repetida 20 veces (Hudson G.S. et al., Virology 147:81-98, 1985; Reisman D. et al., Mol. Cell. Biol. 5:1822-1832, 1985) .

La familia de 30 pb de repeticiones presenta la capacidad de incrementar la transcripción, mientras que el elemento bivalente simétrico desempeña un papel en la replicación. El segmento oriP completo ayuda a mantener el plásmido fuera del cromosoma.

La combinación de la proteína EBNA-1, es decir, una proteína iniciadora de acción en trans, y oriP, permite la construcción de plásmidos, los cuales, tras introducirse en una célula, se mantienen establemente en forma de episomas y se replican establemente durante la proliferación celular (ver, por ejemplo, Yates J.L. et al., Nature (London) 313:812-815, 1985; Reisman D. et al., Mol. Cell. Biol. 5:1822-1832, 1985) . Estos dos elementos aprovechan el mecanismo de replicación de la célula huésped para la replicación del episoma (Bode J. eta l., Gene Ther. Mol. Biol. 6:33-46, 2001) .

Kr y san P.J., et al. (Mol. Cell. Biol. 9:1026-1033, 1989) han demostrado que los plásmidos que comprenden la familia de repetición del origen de replicación del VEB pueden retenerse permanentemente en el núcleo celular de las células humanas. Por lo tanto, la presencia de la proteína EBNA-1 resulta suficiente; no se requiere ningún otro elemento del VEB (ver también Aiyar A. et al., EMBO J. 17:6394-6403, 1998; Hung S.C. et al., PNAS 98:1865-1870, 2001; Yates J.L., DNA Replication in Eukar y otic Cells, editado por DePhamphilis M.L., Cold Spring Harbor Laborator y , N.Y., 1996, páginas 751 a 774; Yates J.L. et al., J. Vir. 74:4512-4522, 2000) .

La proteína EBNA-1 une el episoma al cromosoma de la célula huésped durante la replicación del episoma y de esta manera garantiza la propagación del mismo durante la división celular.

Dicha relación mutua también es conocida para otros virus, por ejemplo el antígeno T grande del virus 40 del simio (SV40) y las proteínas E1/E2 del virus del papiloma bovino (VPB) (ver, por ejemplo, Gilbert D.M. et al., Cell 50:59-68, 1987; DuBridge R.B. et al., Mutagen 3:1-9, 1988; Lebkowski J.S. et al., Mol. Cell. Biol. 4:1951-1960, 1984) .

La combinación de los elementos EBNA-1 y oriP del VEB se ha utilizado para la preparación de episomas de replicación autónoma extracromosómicos que no se integran. Horlick et al., por ejemplo, han utilizado células HEK (renales embrionarias humanas) que expresan establemente la proteína EBNA-1 para la expresión del CRHR (receptor de hormona liberadora de corticotrofina) a partir de un plásmido que contiene oriP de VEB (Horlick R.A. et al., Prot. Exp. Purif. 9:301-308, 1997) .

En la patente US nº 4.686.186 se ha informado de un vector recombinante y un huésped eucariótico transformado con el mismo. Los elementos del VEB oriP y EBNA-1 se agruparon en el vector recombinante.

En el documento nº WO 2002/090533 se informa de un procedimiento para la producción de proteínas recombinantes mediante transfección transitoria de células renales embrionarias humanas cultivadas en suspensión (línea celular 293 y sus variantes genéticas) . Los plásmidos que proporcionan el origen de replicación del VEB se mantienen extracromosómicamente.

En el documento nº WO 2004/053137 se informa de un método para la producción de polipéptidos recombinantes y/o moléculas de ARN no traducido en células huésped. El documento nº WO 2004/018506 informa de composiciones y métodos aplicables en un sistema de expresión regulable que se transfecta transitoriamente en células huésped de mamífero.

La solicitud de patente US nº 2002/0086419 informa de un vector recombinante para la persistencia estable del ADN exógeno en las células huésped eucarióticas y a los usos del vector recombinante para la producción estable a largo plazo de un producto génico en la célula huésped.

Un vector de expresión útil para la transfección de una célula huésped de mamífero seleccionada se informa en la patente US nº 5.707.830. El vector de expresión contiene una familia de repeticiones del virus de Epstein-Barr, una copia del gen EBNA-1 que puede expresarse funcionalmente en la célula huésped, un fragmento de ADN eucariótico, que proporciona la capacidad del vector de replicarse en la célula huésped, y un casete de expresión.

El documento nº WO 2002/027005 informa de un sistema de transfección mejorado que comprende un sistema de mantenimiento episómico, un promotor/intensificador fuerte, un sistema de transactivación de proteínas y un ADN codificante de una proteína heteróloga. Las líneas celulares preferentes no deben ser de roedor debido a que un plásmido que contiene oriP no se replica eficientemente y las células CHO, por ejemplo, no presentan factores celulares para el sistema de transactivación.

Wysokenski D.A. y Yates J.L., (J. Vir. 63:2657-2666, 1989) mencionan que la replicación del plásmido de VEB no cruza líneas específicas de células de primate con células de roedor. Ello se basa en la falta de una interacción con una proteína huésped que participa en la replicación del ADN, que falta en roedores.

Tomiyasu K-i., et... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Célula CHO, caracterizada porque dicha célula CHO:

a) expresa el antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr (EBNA-1) , en el que el gen estructural codificante de la proteína EBNA1 se encuentra operablemente ligada a un promotor fuerte y se integra en el ADN cromosómico y la célula no contiene una copia funcional de la secuencia oriP del VEB integrada en el ADN cromosómico; b) contiene un episoma, en el que dicho episoma comprende:

(i) un origen de replicación procariótico,

(ii) un marcador de selección,

(iii) un origen de replicación (oriP) del virus de Epstein-Barr (VEB) como elemento único derivado del VEB y no contiene una copia funcional del gen estructural de EBNA-1,

(iv) un casete de expresión adecuado para la expresión de un polipéptido heterólogo en dicha célula CHO, en el que dicho casete de expresión comprende una secuencia de promotor, una región 5' no traducida, una secuencia de ácidos nucleicos codificante de dicho polipéptido heterólogo y una región 3' no traducida que comprende una señal de poliadenilación,

c) no contiene el antígeno T grande del virus del polioma.

2. Célula CHO según la reivindicación 1, caracterizada porque el gen estructural codificante de la proteína EBNA-1 se encuentra operablemente ligado a un promotor heterólogo.

3. Método para obtener una célula CHO, caracterizado porque dicho método comprende las etapas de: a) proporcionar una célula CHO que no contiene el antígeno T grande del virus del polioma; b) proporcionar un plásmido que comprende:

(i) un origen de replicación procariótico;

(ii) un marcador de selección;

(iii) un casete de expresión funcional para el antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr (EBNA-1) , en el que dicho casete de expresión comprende una secuencia de promotor, una región 5' no traducida, una secuencia de ácidos nucleicos codificante de EBNA-1 y una región 3' no traducida que comprende una señal de poliadenilación, en el que el plásmido no contiene una copia funcional de la secuencia oriP del VEB,

c) introducir dicho plásmido b) en la célula CHO a) y seleccionar una célula CHO establemente transformada, d) proporcionar entre uno y cuatro plásmidos adicionales, que comprenden:

(i) un origen de replicación procariótico;

(ii) un marcador de selección;

(iii) un origen de replicación (oriP) del virus de Epstein-Barr (VEB) como único elemento derivado del VEB,

(iv) un casete de expresión adecuado para la expresión de un polipéptido heterólogo en dicha célula CHO transformada, en el que dicho casete de expresión comprende una secuencia de promotor, una región 5' no traducida, una secuencia de ácidos nucleicos codificante de un polipéptido heterólogo y una región 3' no traducida con una señal de poliadenilación,

(v) ningún gen estructural codificante de la proteína EBNA-1, e) introducir dichos plásmidos adicionales d) en dicha célula CHO establemente transformada.

4. Método para la producción de un polipéptido heterólogo, caracterizado porque dicho método comprende: a) proporcionar una célula CHO según la reivindicación 1; b) cultivar dicha célula CHO bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido heterólogo;c) recuperar dicho polipéptido a partir del cultivo.

5. Kit para la producción de una célula CHO según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho kit comprende:

a) una célula CHO que no contiene el antígeno T grande del virus del polioma; b) un primer plásmido que comprende:

(i) un origen de replicación procariótico;

(ii) un marcador de selección;

(iii) un casete de expresión funcional para el antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr (EBNA-1) , en el que dicho casete de expresión comprende una secuencia de promotor, una región 5' no traducida, una secuencia de ácidos nucleicos codificante de EBNA-1 y una región 3' no traducida que comprende una señal de poliadenilación;

en el que el plásmido no contiene una copia funcional de la secuencia oriP del VEB, c) un segundo plásmido que comprende:

(i) un origen de replicación procariótico;

(ii) un marcador de selección;

(iii) un origen de replicación (oriP) del virus de Epstein-Barr (VEB) como único elemento derivado del VEB,

(iv) un casete de expresión adecuado para la expresión de un polipéptido heterólogo en dicha célula de roedor, en el que dicho casete de expresión comprende una secuencia de promotor, una región 5' no traducida, un sitio de clonación para la introducción de una secuencia de ácidos nucleicos y una región 3' no traducida que comprende una señal de poliadenilación,

(v) ningún gen estructural codificante de la proteína EBNA-1.

6. Método según cualquiera de las reivindicacinoes 3 a 4, caracterizado porque dicho polipéptido heterólogo se selecciona de entre el grupo que comprende profármacos, enzimas, fragmentos de enzima, inhibidores enzimáticos, activadores enzimáticos, polipéptidos biológicamente activos, proteínas hedgehog, proteínas morfogenéticas óseas, factores de crecimiento, eritropoyetina, trombopoyetina, G-CSF, interleuquinas, interferones, inmunoglobulinas o fragmentos de inmunoglobulina.

7. Método según la reivindicación 6, caracterizado porque dicho polipéptido heterólogo es una inmunoglobulina o un fragmento de inmunoglobulina.

8. Método para la expresión de un polipéptido heterólogo en una célula CHO, caracterizado porque dicho método comprende:

a) proporcionar una célula CHO establemente transfectada con el gen estructural codificante de la proteína EBNA-1 y que no contiene el antígeno T grande del virus del polioma, en el que el gen estructural codificante de la proteína EBNA-1 se encuentra operablemente ligado a un promotor fuerte y la célula no contiene una copia funcional de la secuencia oriP del VEB, b) transfectar dicha célula CHO con un plásmido de expresión que comprende:

(i) un origen de replicación (oriP) del virus de Epstein-Barr (VEB) como único elemento derivado del VEB,

(ii) ningún gen estructural codificante de la proteína EBNA-1,

(iii) un origen de replicación procariótico,

(iv) un marcador de selección,

(v) un casete de expresión adecuado para la expresión de un polipéptido heterólogo en dicha célula CHO, en el que dicho casete de expresión comprende una secuencia de promotor, una región 5' no traducida, una secuencia de ácidos nucleicos codificante de dicha proteína heteróloga y una región 3' no traducida que comprende una señal de poliadenilación;

c) cultivar dicha célula transfectada bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido heterólogo, d) recuperar dicho polipéptido heterólogo a partir del cultivo.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4 y 6 a 8, caracterizado porque dicho polipéptido heterólogo es un polipéptido heterólogo secretado.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4 y 6 a 9, caracterizado porque dicho cultivo se lleva a cabo bajo transfección transitoria.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4 y 6 a 10, caracterizado porque dicha célula CHO se selecciona de entre el grupo que comprende células CHO-DBX11, células CHO-K1, células CHO-DG44 y células CHO que expresan EBNA-1.

12. Método para la producción de una inmunoglobulina heteróloga, caracterizado porque dicho método comprende las etapas siguientes:

a) proporcionar una célula CHO que:

(i) expresa el antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr (EBNA-1) ;

(ii) contiene un episoma, en el que dicho episoma comprende:

(i) un origen de replicación procariótico;

(ii) un marcador de selección;

(iii) un origen de replicación (oriP) del virus de Epstein-Barr (VEB) como único elemento derivado del VEB, (iv) un casete de expresión adecuado para la expresión de una inmunoglobulina heteróloga en dicha célula CHO, en el que dicho casete de expresión comprende una secuencia de promotor, una región 5' no traducida, una secuencia de ácidos nucleicos codificante de dicha inmunoglobulina heteróloga y una región 3' no traducida que comprende una señal de poliadenilación,

(iii) no contiene el antígeno T grande del virus del polioma,

(iv) en el que el gen estructural codificante de la proteína EBNA-1 se encuentra operablemente ligado a un promotor fuerte y se integra en el ADN cromosómico y la célula no contiene una copia funcional de la secuencia de oriP del VEB integrada en el ADN cromosómico;

b) cultivar dicha célula CHO bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicha inmunoglobulina heteróloga, c) recuperar dicho inmunoglobulina heteróloga a partir del cultivo.