EXPLORACION DE ALTO RENDIMIENTO DE POBLACIONES MUTAGENIZADAS.

Método para la detección de una mutación en una secuencia diana en un miembro de una población mutagenizada,

que comprende las etapas de:

(a) aislar ADN genómico de cada miembro de la población mutagenizada para proporcionar muestras de ADN de cada miembro de la población;

(b) reunir el ADN obtenido en la etapa (a);

(c) amplificar la secuencia diana con un par de cebadores (opcionalmente marcados) a partir de los conjuntos de ADN;

(d) reunir los productos de amplificación de la etapa (c) para crear una biblioteca de productos de amplificación;

(e) opcionalmente, fragmentar los productos de amplificación de la biblioteca;

(f) determinar la secuencia de nucleótidos de los fragmentos o productos amplificados usando secuenciación de alto rendimiento;

(g) identificar mutaciones agrupando/alineando las secuencias de los fragmentos;

(h) explorar las mutaciones identificadas para detectar una función modificada de la secuencia diana;

(i) diseñar un cebador dirigido a hibridarse con la mutación identificada;

(j) amplificar la biblioteca de la etapa (d) con el cebador de la etapa (i) y uno de los cebadores de la etapa (c);

(k) identificar el/los miembro(s) de la población que porta(n) la mutación;

(l) opcionalmente, confirmar la mutación amplificando la secuencia diana del/de los miembro(s) de la etapa (k) usando los cebadores de la etapa (c) y determinar la secuencia del producto amplificado

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/NL2006/000467.

Solicitante: KEYGENE N.V..

Nacionalidad solicitante: Países Bajos.

Dirección: AGRO BUSINESS PARK 90,6708 PW WAGENINGEN.

Inventor/es: VAN EIJK,MICHAEL,JOSEPHUS,THERESIA, VAN TUNEN,ADRIANUS JOHANNES.

Fecha de Publicación: .

Fecha Concesión Europea: 30 de Diciembre de 2009.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12Q1/68D2G
  • C12Q1/68E

Clasificación PCT:

  • C12Q1/68 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.

Fragmento de la descripción:

Exploración de alto rendimiento de poblaciones mutagenizadas.

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención, en los campos de la biología molecular y la genética, se refiere a estrategias mejoradas para identificar mutaciones en poblaciones, basándose en el uso de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento. La invención proporciona además kits que pueden aplicarse en los métodos.

Descripción de la técnica anterior

Las poblaciones que portan mutaciones, o bien inducidas o bien que se producen de manera natural, se usan en la investigación genómica moderna para identificar genes que afectan a rasgos de importancia mediante enfoques de genética inversa. Esto es aplicable en particular a plantas y cultivos de importancia agronómica, aunque tales poblaciones también son útiles para otros organismos tales como levaduras, bacterias, etc. También pueden usarse otros organismos, tales como animales, aves, mamíferos, etc., aunque estas poblaciones son normalmente más engorrosas de obtener o controlar. No obstante, se observa que la invención descrita en el presente documento es de una naturaleza muy general, y puede aplicarse también a tales organismos. Altschuler et al. (Nature 2000, 407, 513-516) dan a conocer un método para analizar SNP en el que se mezclan y analizan diferentes muestras.

Las poblaciones mutagenizadas representan herramientas complementarias para el descubrimiento de genes, puesto que tales mutaciones se usan comúnmente para explorar genes conocidos para detectar mutaciones de pérdida de función o evaluar cambios en el fenotipo en organismos con el gen mutado. La etapa limitativa de la velocidad es el trabajo de exploración asociado con la identificación de, respectivamente, organismos que portan una mutación en el gen de interés. Más adelante, se describen en más detalle los principios de tales poblaciones y los métodos de exploración y se presentan métodos de exploración más eficaces que aumentan el valor de estas herramientas para el descubrimiento de genes.

Una tecnología que usa poblaciones mutagenizadas conocida como TILLING (detección de lesiones locales inducidas en genomas) ("Targeted Induced Local Lesions in Genomes") (McCallum et al., Nat. Biotechnol 2000, 18, 455-457, McCallum et al., Plant Physiology, 2000,123, 439-442: Till et al. Genome Research 2003, 13, 524-530 Wienholds et al, Methods in Cell Biology 2004, 70, 69-90) se basa en la introducción al azar de grandes números de mutaciones (la mayoría de las veces sustituciones de nucleótidos) en el genoma mediante tratamiento con metanosulfonato de etilo (EMS) o mediante radiación ionizante (bombardeo con neutrones rápidos) (Li et al. The Plant Journal, 2001, 27, 235-42). Cada planta de la población porta varios cientos (o miles) de mutaciones, algunas de las cuales afectan al desarrollo normal, a la morfología o confieren de otro modo un fenotipo debido a pérdida de función (desactivación, reducción) de uno o múltiples genes o sus secuencias reguladoras. Una población TILLING contiene generalmente un número suficiente de plantas para cubrir todos los genes con múltiples mutaciones independientes (5-20 por gen). Una población de plantas mutagenizada usada en TILLING consiste por tanto habitualmente en 3000-10.000 plantas y puede usarse de dos modos:

Genética inversa

La "genética inversa" es el modo más común de usar poblaciones TILLING. Se identifica un gen de interés, por ejemplo, obteniendo el perfil de transcritos o mediante un enfoque de gen candidato, y la pregunta que ha de responderse es si este gen afecta a un rasgo fenotípico particular de interés. Por tanto, el desafío es identificar una (o varias) plantas con mutaciones de pérdida de función en este gen. Esto se realiza comúnmente en un proceso de exploración de múltiples etapas, que comprende normalmente las siguientes etapas:

1. Se aísla ADN genómico de un gran número de plantas M2 (reunidas) (por ejemplo, 3072) de la población TILLING.
2. Se ensamblan conjuntos de cantidades iguales de ADN de desde 8 hasta 32 plantas por conjunto, dependiendo el nivel de reunión de la sensibilidad del sistema de exploración con CEL I (véase más adelante). Esto da como resultado un total de 96 a 384 muestras de ADN reunidas en el caso de 3072 plantas.
3. Se usan cebadores de PCR marcados para amplificar partes del gen de todos los ADN reunidos. Se usan fragmentos de PCR solapantes para cubrir todo el gen (por ejemplo, se amplifican fragmentos de PCR de 3 * 600 pb a partir de un gen de 1500 pb).
4. Se preparan heterodúplex de los productos de PCR obtenidos a partir de las muestras de ADN reunidas y se incuban con CEL I u otra enzima que reconoce y corta apareamientos erróneos de secuencia de un único nucleótido (por ejemplo, nucleasa Mung Bean, nucleasa S1, Surveyor etc.) y las muestras tratadas se resuelven en un gel desnaturalizante (secuenciación) o mediante electroforesis capilar.
5. Se identifican conjuntos que contienen una planta que porta una mutación en el gen observando las bandas de productos de digestión que resultan del tratamiento con CEL I.

Para identificar la planta que porta la mutación, se repiten las PCR en ADN individuales de las plantas en los conjuntos positivos, seguido por secuenciación de Sanger bidireccional.

Las plantas que albergan una mutación se hacen crecer y se cruzan de manera lejana con el tipo natural para establecer una relación causal entre la mutación y el cambio observado en el fenotipo.

La ventaja de la exploración con CEL I (etapas 3-5 anteriores) es que la preexploración de las muestras reunidas ahorra costes con respecto a la secuenciación de todas las plantas individualmente mediante secuenciación de Sanger.

Sin embargo, una limitación de la exploración con CEL I es que no todas las mutaciones identificadas afectan a la función del gen (por ejemplo, sustituciones silenciosas) y esto no se sabe hasta que se secuencian los productos de PCR de plantas individuales en un conjunto positivo. No obstante, el método de exploración mediada por CEL I ahorra costes en comparación con la secuenciación de productos de PCR de todas las plantas por separado.

Otra limitación es que la exploración con CEL I implica la ejecución de geles y puntuación, un proceso relativamente engorroso que requiere la confirmación de mutaciones de la segunda hebra puesto que los patrones de gel no siempre están bien definidos.

Una tercera desventaja es que la exploración con CEL I es relativamente insensible a la detección de mutaciones en los extremos terminales del producto de PCR, lo que puede conducir a que algunas mutaciones no se detecten. Desventajas adicionales de CEL I son que se ha encontrado que la enzima es extremadamente sensible a las condiciones de reacción tales como las concentraciones de sal. Esto hace que la enzima pueda usarse sólo en un número limitado de tampones, dificultando de ese modo el uso amplio de CEL I. Otra desventaja práctica asociada con la aplicación de CEL I es que la enzima no es fiable en el corte de todos los heterodúplex con apareamientos erróneos.

Finalmente, la exploración con CEL I no puede distinguir mutaciones sustitutivas (que son las más prevalentes) de mutaciones no sustitutivas, provocando que se lleve a cabo una gran cantidad de trabajo de exploración en conjuntos positivos sin producir mutaciones interesantes.

Genética directa

Se hacen crecer plantas de la población mutagenizada y se fenotipan para determinar rasgos de interés. Entonces, las plantas con un fenotipo interesante se cruzan con una planta de tipo natural para cruzar de manera lejana mutaciones que no están ligadas al fenotipo de interés. Finalmente, el gen mutado responsable del fenotipo de interés se identifica mediante clonación posicional (usando marcadores genéticos), análoga al mapeo de QTL en poblaciones de mapeo genético convencionales (F2, RILO etc.). Aunque teóricamente es posible, las poblaciones mutagenizadas no se usan comúnmente de este modo.

La presente invención se realizó en parte para mejorar las estrategias existentes para la exploración de poblaciones mutagenizadas. Es un objeto de la invención proporcionar métodos eficaces para explorar grandes poblaciones para determinar la presencia de mutaciones y para mejorar la evaluación eficaz de las mutaciones...

 


Reivindicaciones:

1. Método para la detección de una mutación en una secuencia diana en un miembro de una población mutagenizada, que comprende las etapas de:

(a) aislar ADN genómico de cada miembro de la población mutagenizada para proporcionar muestras de ADN de cada miembro de la población;
(b) reunir el ADN obtenido en la etapa (a);
(c) amplificar la secuencia diana con un par de cebadores (opcionalmente marcados) a partir de los conjuntos de ADN;
(d) reunir los productos de amplificación de la etapa (c) para crear una biblioteca de productos de amplificación;
(e) opcionalmente, fragmentar los productos de amplificación de la biblioteca;
(f) determinar la secuencia de nucleótidos de los fragmentos o productos amplificados usando secuenciación de alto rendimiento;
(g) identificar mutaciones agrupando/alineando las secuencias de los fragmentos;
(h) explorar las mutaciones identificadas para detectar una función modificada de la secuencia diana;
(i) diseñar un cebador dirigido a hibridarse con la mutación identificada;
(j) amplificar la biblioteca de la etapa (d) con el cebador de la etapa (i) y uno de los cebadores de la etapa (c);
(k) identificar el/los miembro(s) de la población que porta(n) la mutación;
(l) opcionalmente, confirmar la mutación amplificando la secuencia diana del/de los miembro(s) de la etapa (k) usando los cebadores de la etapa (c) y determinar la secuencia del producto amplificado.

2. Método para la detección de una mutación en una secuencia diana en un miembro de una población mutagenizada, que comprende las etapas de:

(a) aislar ADN genómico de cada miembro de la población mutagenizada para proporcionar muestras de ADN de cada miembro de la población;
(b) reunir el ADN obtenido en la etapa (a);
(c) amplificar parte de la secuencia diana con un par de cebadores etiquetados (opcionalmente marcados) a partir de los conjuntos de ADN, en el que al menos uno de los cebadores comprende preferiblemente una sección específica de gen, una etiqueta y un sitio de unión a cebador de secuencia;
(d) reunir los productos de amplificación de la etapa (c) para crear una biblioteca de productos de amplificación;
(e) determinar la secuencia de nucleótidos de los productos de amplificación usando secuenciación de alto rendimiento;
(f) identificar mutaciones agrupando/alineando las secuencias de los fragmentos;
(g) identificar el/los miembro(s) que tiene(n) la mutación usando las etiquetas;
(h) opcionalmente, confirmar la mutación amplificando la secuencia diana del/de los miembro(s) de la etapa (g) usando los cebadores de la etapa (c) y determinar la secuencia del producto amplificado.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la población mutagenizada se obtiene tratando el genoma con uno o más seleccionados del grupo que consiste en productos químicos que inducen mutación, radiación ionizante, intercambio de nucleótidos dirigido o mutagénesis de región dirigida.

4. Método para la detección de una mutación en una secuencia diana en un miembro de una población que comprende subpoblaciones que contienen mutaciones que se producen de manera natural, que comprende las etapas de:

(a) aislar ADN genómico de cada miembro de la población para proporcionar muestras de ADN de cada miembro de la población;
(b) reunir el ADN obtenido en la etapa (a);
(c) amplificar la secuencia diana con un par de cebadores (opcionalmente marcados) a partir de los conjuntos de ADN;
(d) reunir los productos de amplificación de la etapa (c) para crear una biblioteca de productos de amplificación;
(e) opcionalmente, fragmentar los productos de amplificación de la biblioteca;
(f) determinar la secuencia de nucleótidos de los fragmentos o productos amplificados usando secuenciación de alto rendimiento;
(g) identificar mutaciones agrupando/alineando las secuencias de los fragmentos;
(h) explorar las mutaciones identificadas para detectar una función modificada de la secuencia diana;
(i) diseñar un cebador dirigido a hibridarse con la mutación identificada;
(j) amplificar la biblioteca de la etapa (d) con el cebador de la etapa (i) y uno de los cebadores de la etapa (c);
(k) identificar el/los miembro(s) de la población que porta(n) la mutación;
(l) opcionalmente, confirmar la mutación amplificando la secuencia diana del/de los miembro(s) de la etapa (k) usando los cebadores de la etapa (c) y determinar la secuencia del producto amplificado.

5. Método para la detección de una mutación en una secuencia diana en un miembro de una población que comprende subpoblaciones que contienen mutaciones que se producen de manera natural, que comprende las etapas de:

(a) aislar ADN genómico de cada miembro de la población mutagenizada para proporcionar muestras de ADN de cada miembro de la población;
(b) reunir el ADN obtenido en la etapa (a);
(c) amplificar parte de la secuencia diana con un par de cebadores etiquetados (opcionalmente marcados) a partir de los conjuntos de ADN, en el que al menos uno de los cebadores comprende preferiblemente una sección específica de gen, una etiqueta y un sitio de unión a cebador de secuencia;
(d) reunir los productos de amplificación de la etapa (c) para crear una biblioteca de productos de amplificación;
(e) determinar la secuencia de nucleótidos de los productos de amplificación usando secuenciación de alto rendimiento;
(f) identificar mutaciones agrupando/alineando las secuencias de los fragmentos;
(g) identificar el/los miembro(s) que tiene(n) la mutación usando las etiquetas;
(h) opcionalmente, confirmar la mutación amplificando la secuencia diana del/de los miembro(s) de la etapa (g) usando los cebadores de la etapa (c) y determinar la secuencia del producto amplificado.

6. Método según las reivindicaciones 1-5, en el que la reunión es una estrategia de reunión 3D.

7. Método según las reivindicaciones 1-6, en el que la secuenciación de alto rendimiento se realiza mediante síntesis, preferiblemente pirosecuenciación.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la secuenciación se realiza sobre un soporte sólido tal como una perla.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la secuenciación se basa en secuenciación de alto rendimiento, preferiblemente secuenciación mediante síntesis.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que la secuenciación se realiza mediante síntesis, preferiblemente pirosecuenciación.

11. Método según la reivindicación 7, en el que la secuenciación comprende las etapas de: (i) ligar adaptadores de secuenciación a los fragmentos; (ii) hibridar dichos fragmentos ligados a adaptadores con perlas, hibridando cada perla con un único fragmento; (iii) emulsionar las perlas en microrreactores de agua en aceite de manera que cada microrreactor contenga una única perla; (iv) realizar PCR en emulsión para amplificar fragmentos ligados a adaptadores en la superficie de las perlas (v) seleccionar/enriquecer perlas a las que están unidos dichos fragmentos ligados a adaptadores amplificados (vi) colocar las perlas en pocillos de manera que cada pocillo comprenda una única perla; y (vii) generar una señal de pirofosfato.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que los cebadores en las etapas (c) y/o la etapa (i) contienen nucleótidos con afinidad de unión mejorada.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2-12, en el que la parte de la secuencia diana que se amplifica en la etapa (c) es de desde aproximadamente 80 hasta aproximadamente 400 pb.

14. Método según la reivindicación 13, en el que la parte de la secuencia diana que se amplifica en la etapa (c) es de desde aproximadamente 90 hasta aproximadamente 300 pb.

15. Método según la reivindicación 13, en el que la parte de la secuencia diana que se amplifica en la etapa (c) es de desde 100 hasta aproximadamente 200 pb.


 

Patentes similares o relacionadas:

DETERMINACIÓN DEL GRADO DE METILACIÓN DE ADN, del 23 de Noviembre de 2011, de HEINRICH-HEINE-UNIVERSITÄT DÜSSELDORF: Procedimiento para determinar el grado de metilación de ADN normalizado que comprende las etapas: a) determinación cuantitativa de la presencia de un transposón […]

PROCEDIMIENTO DE OBTENCION DE UN DISPOSITIVO PARA DIAGNOSTICO DE MUTACIONES FRECUENTES DE LA PROTEINA LRRK2 BASADO EN PCR EN TIEMPO REAL, del 1 de Julio de 2011, de UNIVERSIDAD DE EXTREMADURA FUNDESALUD: La presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de un dispositivo para diagnóstico de mutaciones frecuentes de la proteína Irrk2 […]

CONJUNTO DE CEBADORES, SONDAS, PROCEDIMIENTO Y KIT PARA EL GENOTIPADODEL POLIMORFISMO GENETICO -250G/A DEL GEN LIPC, del 24 de Junio de 2011, de UNIVERSIDAD DE MALAGA: Conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y kit para el genotipado del polimorfismo genético -250G/A del gen LIPC.La presente invención se refiere a un conjunto de cebadores, […]

Imagen de 'AMPLIFICACIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN'AMPLIFICACIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN, del 29 de Abril de 2011, de COMMONWEALTH SCIENTIFIC AND INDUSTRIAL RESEARCH ORGANISATION: Un procedimiento para la amplificación selectiva de una muestra de una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia diana adyacente […]

Imagen de 'MÉTODOS PARA EL RÁPIDO ANÁLISIS FORENSE DE ADN MITOCONDRIAL Y…'MÉTODOS PARA EL RÁPIDO ANÁLISIS FORENSE DE ADN MITOCONDRIAL Y CARATERIZACIÓN HETEROPLASMIA DE ADN MITOCONDRIAL, del 16 de Febrero de 2011, de IBIS BIOSCIENCES, INC: Un método forense que comprende los pasos de: (i) determinar una primera masa molecular de un primer producto de amplificación de un Cebador amplicón identificador […]

CONJUNTO DE CEBADORES, SONDAS, PROCEDIMIENTO Y KIT PARA EL GENOTIPADODEL POLIMORFISMO GENETICO S447X DEL GEN LPL, del 27 de Enero de 2011, de UNIVERSIDAD DE MALAGA: Conjunto de cebadores, sondas, procedimiento y kit para el genotipado del polimorfismo genético S447X del gen LPL.La presente invención se refiere a un conjunto de […]

GENERACION DE MUESTRAS PARA GENOTIPAR MEDIANTE ESPECTROMETRIA DE MASAS, del 29 de Octubre de 2010, de CENTRE NATIONAL DE GENOTYPE: Método para el genotipado de polimorfismos de un nucleótido único (SNP) mediante espectrometría de masas, que comprende las etapas siguientes: a. […]

Imagen de 'DETECCION DE LA UNION DE RECOMBINACION DE ADN'DETECCION DE LA UNION DE RECOMBINACION DE ADN, del 6 de Octubre de 2010, de CEPHEID: Un método para determinar la presencia o ausencia de un polinucleótido de inserción integrado en un sitio de unión en una secuencia polinucleotídica […]

Utilizamos cookies para mejorar nuestros servicios y mostrarle publicidad relevante. Si continua navegando, consideramos que acepta su uso. Puede obtener más información aquí. .