Especies de levadura genéticamente modificadas, y procesos de fermentación que emplean levaduras genéticamente modificadas.

Una célula de levadura genéticamente modificada que tiene una deleción o alteración de un gen nativo queproduce una enzima que cataliza la conversión de xilosa a xilitol,

y una deleción o alteración de un gen de xilitoldeshidrogenasa nativo.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10183744.

Solicitante: CARGILL INCORPORATED.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 15407 MCGINTY ROAD WEST WAYZATA, MN 55391 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: ARISTIDOU, ARISTOS, RUOHONEN, LAURA, SUOMINEN, PIRKKO, RAJGARHIA,VINEET, OLSON,STACEY, ILMEN,MARJA, KOIVURANTA,KARI, MILLER,Chris, PENTILLÄ,MERJA.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07H21/04 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 21/00 Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos. › con desoxirribosilo como radical sacárido.
  • C12N1/21 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N15/81 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › para levaduras.
  • C12N9/12 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › transfieren grupos que contienen fósforo, p. ej. Quinasas (2.7).
  • C12N9/90 C12N 9/00 […] › Isomerasas (5.).
  • C12N9/92 C12N 9/00 […] › glucosa isomerasa.
  • C12P7/06 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 7/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen oxígeno. › Etanol como producto químico y no como bebida alcohólica.
  • C12P7/56 C12P 7/00 […] › Acido láctico.

PDF original: ES-2426966_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Especies de levadura genéticamente modificadas, y procesos de fermentación que emplean levaduras genéticamente modificadas Esta invención se realizó bajo en nº de contrato DE-FC07-021D14349 con el Departamento de Energía de EEUU. El gobierno de EEUU tiene ciertos derechos sobre esta invención.

Esta solicitud reinvindica el beneficio de la solicitud provisional de EEUU nº 60/467.727, presentada el 2 de mayo de 2003.

Esta invención se refiere a ciertas especies de levadura géneticamente modificadas.

Debido al agotamiento gradual de la materia prima del petróleo y del gas natural a nivel mundial, al deseo de parte de las naciones importadoras de petróleo de disminuir su dependencia de fuentes extranjeras de petróleo, y al deseo de establecer una base más sostenible para la economía, se están dedicando grandes esfuerzos a la producción de combustibles y de plásticos y productos químicos orgánicos procedentes de materias primas alternativas. Los procesos de fermentación ofrecen la posibilidad de producir una diversidad de combustibles y productos químicos a partir de fuentes de azúcares naturales. Por ejemplo, se produce etanol en cantidad significativa mediante la fermentación de la glucosa, de forma más tipica de la glucosa obtenida hidrolizando el almidón de maíz. Una especie de levadura, Saccharomyces cerevisiae, es un biocatalizador habitual para fermentar la glucosa en etanol.

Estos azúcares representan una fuente de carbono relativamente cara. La biomasa, es decir, el hidrolizado de materia vegetal, ofrece la posibilidad de ser una fuente de carbono particularmente barata. La biomasa consiste principalmente en celulosa y hemicelulosa. La celulosa puede degradarse en azúcares de hexosa, generalmente glucosa. La mayoría de las levaduras, incluyendo S. cerevisiae, metabolizan los azúcares de hexosa con bastante eficacia. Por otra parte, la hemicelulosa es rica en azúcares de pentosa, tales como xilosa, de forma que una utilización eficaz del carbono requiere que estos azúcares de pentosa se metabolicen bien. Muy pocas levaduras metabolizan de forma eficaz la xilosa en etanol u otros productos de la fermentación deseables. Así, para aprovechar el potencial económico completo que ofrece la utilización de fuentes de carbono de biomasa es necesario proporcionar un biocatalizador que pueda convertir de modo eficaz la xilosa en productos de la fermentación deseables.

Diversas bacterias son capaces de metabolizar la xilosa en productos de la fermentación, pero en general producen una mezcla de productos en lugar de un único producto predominante, tal como se desea habitualmente. Los subproductos habituales a veces son tóxicos para las bacterias. Aunque ciertas bacterias se han modificado metabólicamente para que realicen fermentaciones homoetanólicas, las bacterias tienden a tener una mala actuación en el duro entorno de los hidrolizados lignocelulósicos, que son una fuente habitual de sustratos ricos en xilosa.

Se sabe que algunas especies de levadura, tales como S. cerevisiae, fermentan los azúcares de hexosa predominantemente en etanol en lugar de producir las mezclas de productos que generalmente producen las bacterias. Algunas levaduras tienen otras características que hacen que sean buenas candidatas para diversos tipos de procesos de fermentación, tales como resistencia a entornos de pH bajo, resistencia a ciertos coproductos de la fermentación, tales como ácido acético y furfural, y resistencia al propio etanol.

La mayoría de las especies de levadura metabolizan la xilosa (si es que pueden metabolizarla) a través de una vía compleja, en la que la xilosa en primer lugar se reduce a xilitol a través de una enzima xilosa reductasa (XR) . El xilitol entonces se oxida a xilulosa a través de una enzima xilitol deshidrogenasa (XDH) . La xilulosa entonces se fosforila a través de una enzima XK. Esta vía funciona de manera ineficaz en especies de levadura porque introduce un desequilibrio redox en la célula. La etapa de xilosa a xilitol emplea NADH como cofactor, mientras que la etapa de xilitol a xilulosa emplea NADPH como cofactor. Deben producirse otros procesos para restablecer el desequilibrio redox dentro de la célula. Esto a menudo significa que el organismo no puede crecer de modo anaerobio sobre la xilosa ni sobre otro azúcar de pentosa.

No obstante, se ha intentado introducir genes de XR y XDH exógenos en especies de levadura, tales como S. cerevisiae, para lograr la conversión de la xilosa en etanol. Véase, por ejemplo, la patente de EEUU nº 5.866.382, y los documentos WO 95/13362 y WO 97/42307. La levadura modificada no produce etanol de manera eficaz.

Otros organismos pueden isomerizar la xilosa en xilulosa y después fosforilar la xilulosa en xilulosa 5-fosfato, que entonces se metaboliza aún más a través de la vía del carbono central de la célula. La isomerización es estimulada por una enzima catalítica, la xilosa isomerasa (XI) , y la fosforilación es catalizada por una enzima xiluloquinasa (XK) . Esta vía es habitual en bacterias pero relativamente rara en especies eucariotas, tales como levaduras. No crea el desequilibrio redox de la vía de xilosa a xilitol a xilulosa, y por tanto en principio es un mecanismo anaerobio más eficaz. Se sabe que un hongo anaerobio, Piromyces sp. E2 (ATCC 76762) , posee un gen que expresa una enzima XI activa.

Sin embargo, ninguna especie de levadura de tipo salvaje o recombinante tiene la capacidad de producir de modo eficaz productos de la fermentación deseables a partir de la xilosa u otras materias primas de azúcares de pentosa. Un intento de introducir el gen XI de Piromyces sp. E2 en S. cerevisiae produjo un crecimiento muy lento sobre xilosa y no dio como resultado la producción de etanol divulgada. Véase Kuyper et al., “High-Level Functional Expression of a Fungal Xylose Isomerase: The Key to Efficient Ethanolic Fermentation of Xylose by Saccharomyces Cerevisiae?”, FEMS Yeast Research, 1574 (2003) , 1-10, y el documento WO 03/062430A1.

Por tanto, resulta muy deseable una especie de levadura que puede fermentar de modo eficaz la xilosa y otros

azúcares de pentosa en un producto de la fermentación deseado. En un aspecto, esta invención es una célula de levadura genéticamente modificada que tiene una deleción o alteración de un gen nativo que produce una enzima que cataliza la conversión de xilosa a xilitol, y una deleción o alteración de un gen de xilitol deshidrogenasa nativo.

En un segundo aspecto, esta invención es un proceso de fermentación en el que una célula, tal como se definió anteriormente, se cultiva bajo condiciones de fermentación en un caldo de fermentación que incluye un azúcar de pentosa, y en el que se produce etanol como principal producto de la fermentación.

En otro aspecto, esta invención es un proceso de fermentación en el que una célula, tal como se definió anteriormente, se cultiva bajo condiciones de fermentación en un caldo de fermentación que incluye un azúcar de pentosa, en el que el azúcar de pentosa incluye xilosa.

En otro aspecto, esta invención es un proceso de fermentación en el que una célula de levadura genéticamente modificada, que tiene un genoma y un gen de xilosa isomerasa exógeno funcional unido operativamente a secuencias promotoras y terminadoras que son funcionales en la célula de levadura, que además contiene un gen de xiluloquinasa exógeno funcional unido operativamente a secuencias promotoras y terminadoras que son funcionales en la célula de levadura, y que además tiene una deleción o alteración de un gen de piruvato descarboxilasa nativo, se cultiva bajo condiciones de fermentación en un caldo de fermentación que incluye un azúcar de pentosa, en el que el azúcar de pentosa incluye xilosa.

La figura 1 es un diagrama que muestra el plásmido pNC2.

La figura 2 es un diagrama que muestra el plásmido pNC4.

La figura 3 es un diagrama que muestra el plásmido pVR22.

La figura 4 es un diagrama que muestra el plásmido pVR29. Las figuras 5a y 5b son diagramas que muestran los plásmidos pBH5a y pBH5b. Las figuras 6a, 6b y 6c son diagramas que muestran el ensamblaje del plásmido pVR78 a partir de los plásmidos

pVR73 y pVR77.

La figura 7 es un diagrama que muestra el plásmido pCM3.

La figura 8 es un diagrama que muestra el plásmido pPS1.

La figura 9 es un diagrama que muestra el plásmido pCM9.

La figura 10 es un diagrama que muestra el plásmido pCM17.

La figura 11 es un diagrama que muestra el plásmido pCM14.

La figura 12 es un diagrama que muestra el plásmido pCM28.

La figura 13 es un diagrama que muestra el plásmido pVR95. La figuras 14a y 14b son diagramas que muestran los plásmidos... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una célula de levadura genéticamente modificada que tiene una deleción o alteración de un gen nativo que produce una enzima que cataliza la conversión de xilosa a xilitol, y una deleción o alteración de un gen de xilitol deshidrogenasa nativo.

2. La célula de levadura genéticamente modificada de la reivindicación 1, en la que el gen nativo que produce una enzima que cataliza la conversión de xilosa a xilitol es un gen de xilosa reductasa funcional.

3. La célula de levadura genéticamente modificada de la reivindicación 1 o 2, que tiene también un gen de xilosa isomerasa exógeno funcional, en la que el gen de xilosa isomerasa exógeno está unido operablemente a secuencias promotoras y terminadoras que son funcionales en la célula de levadura.

4. La célula de levadura genéticamente modificada de la reivindicación 3, en la que el gen de xilosa isomerasa exógeno funcional está integrado en el genoma de la célula de levadura.

5. La célula de levadura genéticamente modificada de la reivindicación 3 o 4, en la que el gen de xilosa isomerasa exógeno es al menos 60% homólogo con SEQ ID NO:151, o codifica una enzima que es al menos 60% homóloga con SEQ ID NO:152.

6. La célula de levadura genéticamente modificada de la reivindicación 3 o 4, en la que el gen de xilosa isomerasa exógeno es al menos 60% homólogo con SEQ ID NO:162, o codifica una enzima xilosa isomerasa que es al menos 60% homóloga con SEQ ID NO:163.

7. La célula de levadura genéticamente modificada de la reivindicación 3 o 4, en la que el gen de xilosa isomerasa es al menos 60% homólogo con SEQ ID NO:58, o codifica una enzima xilosa isomerasa que es al menos 60% homóloga con SEQ ID NO:59.

8. La célula de levadura genéticamente modificada de la reivindicación 3 o 4, en la que la célula de levadura tiene una vía natural activa desde el xilulosa-5-fosfato al gliceraldehído-3-fosfato, en la que la célula de levadura tiene una deleción o alteración de un gen de xilosa reductasa nativo, y el gen de xilosa isomerasa es al menos 95% homólogo con SEQ ID NO:58.

9. La célula de levadura genéticamente modificada de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que sobreexpresa una xiluloquinasa funcional.

10. Un proceso de fermentación, en el que una célula de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 se cultiva bajo condiciones de fermentación en un caldo de fermentación que incluye un azúcar de pentosa, y en el que se produce etanol como productor principal de la fermentación.

11. Un proceso de fermentación, en el que una célula de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 se cultiva bajo condiciones de fermentación en un caldo de fermentación que incluye un azúcar de pentosa, en el que el azúcar de pentosa incluye xilosa.

12. Un proceso de fermentación, en el que una célula de levadura genéticamente modificada, que tiene un genoma y un gen de xilosa isomerasa exógeno funcional unido operativamente a secuencias promotoras y terminadoras que son funcionales en la célula de levadura, que además contiene un gen de xiluloquinasa exógeno funcional unido operativamente a secuencias promotoras y terminadoras que son funcionales en la célula de levadura, y que además tiene una deleción o alteración de un gen de piruvato descarboxilasa nativo, se cultiva bajo condiciones de fermentación en un caldo de fermentación que incluye un azúcar de pentosa, en el que el azúcar de pentosa incluye xilosa.


 

Patentes similares o relacionadas:

Composiciones y métodos para modular la expresión del receptor de la hormona del crecimiento, del 15 de Julio de 2020, de Ionis Pharmaceuticals, Inc: Un compuesto que tiene la siguiente estructura química: **(Ver fórmula)**

Biosondas y métodos de uso de las mismas, del 15 de Julio de 2020, de THE GOVERNING COUNCIL OF THE UNIVERSITY OF TORONTO: Una primera biosonda inmovilizada sobre una superficie, comprendiendo la primera biosonda: una secuencia de ANP capaz de hibridarse con un nucleótido […]

Composiciones para modular la expresión de SOD-1, del 24 de Junio de 2020, de Biogen MA Inc: Un compuesto antisentido según la siguiente fórmula: mCes Aeo Ges Geo Aes Tds Ads mCds Ads Tds Tds Tds mCds Tds Ads mCeo Aes Geo mCes Te (secuencia […]

Ácido nucleico antisentido, del 24 de Junio de 2020, de NIPPON SHINYAKU CO., LTD.: Un oligómero antisentido de 14 a 32 bases de longitud, que comprende dos unidades de oligómeros conectadas seleccionadas del grupo que consiste […]

Análogos de nucleótidos, del 27 de Mayo de 2020, de Abbott Molecular Inc: Una mezcla de reacción que comprende una mezcla de dNTP y uno o más análogos de nucleótidos de 3'-Opropargilo que tienen una estructura de acuerdo con: **(Ver […]

Interferencia por ARN para el tratamiento de trastornos de ganancia de función, del 29 de Abril de 2020, de UNIVERSITY OF MASSACHUSETTS: Un agente de iARN para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene o está en riesgo de tener una enfermedad caracterizada o provocada […]

Sistema de suministro in vivo optimizado con agentes endosomolíticos para conjugados de ácidos nucleicos, del 11 de Marzo de 2020, de ONXEO: Una molécula de ácido nucleico conjugada que tiene la siguiente fórmula: **(Ver fórmula)** en donde N es un desoxinucleótido, n es un número entero de 21 a […]

Compuestos y métodos para la síntesis de 5-(triptaminocarboxiamida n-protegida)-2''-desoxiuridina fosforamidita para su incorporación a una secuencia de ácido nucleico, del 11 de Marzo de 2020, de Somalogic, Inc: Un compuesto de fórmula A o fórmula B: **(Ver fórmula)** o una de sus sales; en el que, R1 se selecciona entre terc-butilo, 1,1-dimetil-10 propilo, […]

Utilizamos cookies para mejorar nuestros servicios y mostrarle publicidad relevante. Si continua navegando, consideramos que acepta su uso. Puede obtener más información aquí. .