Métodos y composiciones para la escisión y recombinación dirigidas.

Un método para escindir cromatina celular en una región de interés, comprendiendo el método:

(a) seleccionar la región de interés;

(b) manipular un primer dominio de unión de dedos de cinc para unirse a una primera secuencia de nucleótidos en la región de interés;

(c) proporcionar un segundo dominio de unión de dedos de cinc que se une a una segunda secuencia de nucleótidos en la región de interés, en el que la segunda secuencia se localiza entre 2 y 50 nucleótidos de la primera secuencia;

(d) expresar una primera proteína de fusión en la célula, comprendiendo la primera proteína de fusión el primer dominio de unión de dedos de cinc y un primer medio dominio de escisión; y

(e) expresar una segunda proteína de fusión en la célula, comprendiendo la segunda proteína de fusión el segundo dominio de unión de dedos de cinc y un segundo medio dominio de escisión;

en el que

(i) la primera proteína de fusión se une a la primera secuencia de nucleótidos,

(ii) la segunda proteína de fusión se une a la segunda secuencia de nucleótidos,

(iii) dicha unión de la primera y segunda proteínas de fusión posiciona los medios dominios de escisión de forma que la cromatina celular se escinda en la región de interés, y

iv) en al menos una de la primera o segunda proteínas de fusión, el medio dominio de escisión está más próximo al extremo N y el dominio de unión de dedos de cinc está más próximo al extremo C.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2005/003245.

Solicitante: SANGAMO BIOSCIENCES, INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: POINT RICHMOND TECH CENTER, SUITE A100, 501 CANAL BOULEVARD RICHMOND, CA 94804 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: ZHANG,LEI, MILLER,JEFFREY C.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/62 (Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/85 (para células animales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/47 (de mamíferos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/715 (para citoquinas; para linfoquinas; para interferones)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/435 (de animales; de humanos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/14 (Hidrolasas (3.))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/22 (Ribonucleasas)

PDF original: ES-2543409_T3.pdf

 

google+ twitter facebook

Fragmento de la descripción:

Métodos y composiciones para la escisión y recombinación dirigidas Descripción

CAMPO TÉCNICO

La presente divulgación está en los campos de la ingeniería del genoma, mutagénesis y recombinación homóloga dirigidas.

ANTECEDENTES

Un área importante de interés en la biología del genoma, especialmente en vista de la determinación de las secuencias de nucleótidos completas de varios genomas, es la alteración dirigida de secuencias del genoma. Pero para proporcionar un ejemplo, la anemia drepanocítica se produce por mutación de un único par de nucleótidos en el gen humano -globina. Así, la capacidad para convertir la copia genómica endógena de este par de nucleótidos mutante en la secuencia no mutante en un forma estable y producir -globina normal proporcionaría una cura para la anemia drepanocítica.

Se han hecho intentos por alterar secuencias genómicas en células cultivadas aprovechando el fenómeno natural de la recombinación homóloga. Véanse, por ejemplo, Capecchi (1989) Science 244:1288-1292; patentes de EE.UU. nº

6.528.313 y 6.528.314. Si un polinucleótido tiene homología suficiente con la región genómica que contiene la secuencia que va a alterarse, es posible que parte o toda la secuencia del polinucleótido sustituya la secuencia genómica por recombinación homóloga. Sin embargo, la frecuencia de recombinación homóloga bajo estas circunstancias es extremadamente baja. Además, la frecuencia de inserción del polinucleótido exógeno en localizaciones genómicas que carecen de homología de secuencias supera la frecuencia de recombinación homóloga en varios órdenes de magnitud.

Se ha mostrado que la introducción de una rotura bicatenaria en ADN genómico, en la región del genoma que lleva homología con un polinucleótido exógeno, estimula la recombinación homóloga en este sitio por varios cientos de veces en células cultivadas. Rouet et al., (1994) Mol. Cell. Biol. 14:8096-8106; Choulika et al., (1995) Mol. Cell. Biol. 15:1968-1973; Donoho et at. (1998) Mol. Cell. Biol. 18:4070-4078. Véase también Johnson et al., (2001) Biochem. Soc. Trans. 29:196-201; y Yanez et al., (1998) Gene Therapy 5:149-159. En estos métodos, la escisión de ADN en la región genómica deseada se llevó a cabo insertando un sitio de reconocimiento para una meganucleasa (es decir, una endonucleasa cuya secuencia de reconocimiento es tan grande que no se produce, o se produce solo raramente, en el genoma de interés) en la región genómica deseada.

Sin embargo, la recombinación homóloga estimulada por la escisión de meganucleasas se basa en tanto la presencia fortuita de, como la inserción dirigida de, un sitio de reconocimiento de meganucleasa adecuado en la proximidad de la región genómica que va a alterarse. Como los sitios de reconocimiento de meganucleasa son raros (o inexistentes) en un genoma de mamífero típico, y la inserción de un sitio de reconocimiento de meganucleasa adecuado está plagado de las mismas dificultades que se han asociado a otras alteraciones genómicas, estos métodos no son ampliamente aplicables.

Bibikova et al., (Genetics 2002, 161:1169-1175) desvelan la escisión cromosómica dirigida y mutagénesis en Drosophila usando nucleasas de dedos de cinc, en el que un dominio de escisión está localizado en el extremo C con respecto a un dominio de dedos de cinc.

Así, sigue existiendo la necesidad de composiciones y métodos para la alteración dirigida de secuencias en cualquier genoma.

RESUMEN

La presente invención se define por las reivindicaciones.

La presente divulgación proporciona composiciones y métodos para la escisión dirigida de cromatina celular en una región de interés y/o recombinación homóloga en una región predeterminada de interés en células. Las células incluyen células cultivadas, células en un organismo y células que se han eliminado de un organismo para el tratamiento en casos en los que las células y/o sus descendientes se devolverán al organismo después del tratamiento. Una región de interés en cromatina celular puede ser, por ejemplo, una secuencia genómica o porción de la misma. Las composiciones incluyen polipéptidos de fusión que comprenden un dominio de unión de dedos de cinc manipulado (por ejemplo, un dominio de unión de dedos de cinc que tiene una especificidad novedosa) y un dominio de escisión, y polipéptidos de fusión que comprenden un dominio de unión de dedos de cinc manipulado y un medio dominio de escisión. Los dominios de escisión y medios dominios de escisión pueden obtenerse, por ejemplo, de diversas endonucleasas de restricción y/o endonucleasas de asentamiento.

La cromatina celular puede estar presente en cualquier tipo de célula que incluye, pero no se limita a, células

procariotas y eucariotas, células fúngicas, células vegetales, células de animales, células de mamífero, células de primate y células humanas. La cromatina celular puede estar presente, por ejemplo, en cromosomas o en genomas intracelulares de bacterias o virus infectantes.

En un aspecto, se proporciona un método para la escisión de cromatina celular en una región de interés (por ejemplo, un método para la escisión dirigida de secuencias genómicas) , comprendiendo el método (a) seleccionar la región de interés; (b) manipular un primer dominio de unión de dedos de cinc para unirse a una primera secuencia de nucleótidos en la región de interés; (c) proporcionar un segundo dominio de unión de dedos de cinc que se une a una segunda secuencia de nucleótidos en la región de interés, en el que la segunda secuencia se localiza entre 2 y 50 nucleótidos de la primera secuencia; (d) expresar una primera proteína de fusión en la célula, comprendiendo la primera proteína de fusión el primer dominio de unión de dedos de cinc y un primer medio dominio de escisión; y (e) expresar una segunda proteína de fusión en la célula, comprendiendo la segunda proteína de fusión el segundo dominio de unión de dedos de cinc y un segundo medio dominio de escisión; en el que la primera proteína de fusión se une a la primera secuencia de nucleótidos y la segunda proteína de fusión se une a la segunda secuencia de nucleótidos, y adicionalmente en el que dicha unión posiciona los medios dominios de escisión de forma que la cromatina celular se escinda en la región de interés. La escisión puede producirse entre la primera y segunda secuencias de nucleótidos y, en ciertas realizaciones, el segundo dominio de unión de dedos de cinc se manipula para unirse a la segunda secuencia de nucleótidos.

Los medios dominios de escisión en la primera y segunda proteínas de fusión pueden ser de la misma endonucleasa o de endonucleasas diferentes. En ciertas realizaciones, la endonucleasa es una endonucleasa de restricción de tipo IIS. En realizaciones adicionales, la endonucleasa de restricción de tipo IIS es Fok I.

La polaridad de las proteínas de fusión puede ser de forma que el dominio de unión de dedos de cinc esté en el extremo N con respecto al medio dominio de escisión; alternativamente, el medio dominio de escisión puede estar en el extremo N con respecto al dominio de unión de dedos de cinc. Cuando se usan dos proteínas de fusión de la misma polaridad, sus sitios de unión están en hebras opuestas del ADN en la región de interés.

En realizaciones adicionales, se usan dos proteínas de fusión de polaridad opuesta. En este caso, los sitios de unión para las dos proteínas están sobre la misma hebra de ADN.

El sitio de escisión está generalmente localizado entre los sitios de unión de las dos proteínas de fusión. Puede estar separado del borde próximo del uno o el otro de los sitios de unión por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para escindir cromatina celular en una región de interés, comprendiendo el método:

(a) seleccionar la región de interés;

(b) manipular un primer dominio de unión de dedos de cinc para unirse a una primera secuencia de nucleótidos en la región de interés;

(c) proporcionar un segundo dominio de unión de dedos de cinc que se une a una segunda secuencia de nucleótidos en la región de interés, en el que la segunda secuencia se localiza entre 2 y 50 nucleótidos de la primera secuencia;

(d) expresar una primera proteína de fusión en la célula, comprendiendo la primera proteína de fusión el primer dominio de unión de dedos de cinc y un primer medio dominio de escisión; y

(e) expresar una segunda proteína de fusión en la célula, comprendiendo la segunda proteína de fusión el segundo dominio de unión de dedos de cinc y un segundo medio dominio de escisión; en el que

(i) la primera proteína de fusión se une a la primera secuencia de nucleótidos,

(ii) la segunda proteína de fusión se une a la segunda secuencia de nucleótidos,

(iii) dicha unión de la primera y segunda proteínas de fusión posiciona los medios dominios de escisión de forma que la cromatina celular se escinda en la región de interés, y iv) en al menos una de la primera o segunda proteínas de fusión, el medio dominio de escisión está más próximo al extremo N y el dominio de unión de dedos de cinc está más próximo al extremo C.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la escisión se produce entre la primera y segunda secuencias de nucleótidos.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el segundo dominio de unión de dedos de cinc se manipula para unirse a la segunda secuencia de nucleótidos.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el primer y segundo medios dominios de escisión son de la misma endonucleasa.

5. El método de la reivindicación 4, en el que la endonucleasa es una endonucleasa de restricción de tipo IIS.

6. El método de la reivindicación 5, en el que la endonucleasa de restricción de tipo IIS es Fok I.

7. El método de la reivindicación 1, en el que la cromatina celular está en un cromosoma.

8. El método de la reivindicación 1, en el que el primer medio dominio de escisión es de una endonucleasa de restricción de tipo IIS.

9. El método de la reivindicación 1, en el que el segundo medio dominio de escisión es de una endonucleasa de restricción de tipo IIS.

10. El método de la reivindicación 1, en el que la primera y segunda secuencias de nucleótidos están sobre hebras opuestas de ADN.

11. El método de la reivindicación 10, en el que, en la primera y segunda proteínas de fusión, los medios dominios de escisión están más próximos a los extremos N y los dominios de unión de dedos de cinc están más próximos a los extremos C.

12. El método de la reivindicación 1, en el que la primera y segunda secuencias de nucleótidos están sobre la misma hebra de ADN.

13. El método de la reivindicación 12, en el que, en la primera proteína de fusión, el medio dominio de escisión está más próximo al extremo N y el dominio de unión de dedos de cinc está más próximo al extremo C y, en la segunda proteína de fusión, el dominio de unión de dedos de cinc está más próximo al extremo N y el medio dominio de escisión está más próximo al extremo C.

14. El método de la reivindicación 12, en el que, en la primera proteína de fusión, el dominio de unión de dedos de cinc está más próximo al extremo N y el medio dominio de escisión está más próximo al extremo C y, en la segunda proteína de fusión, el medio dominio de escisión está más próximo al extremo N y el dominio de unión de dedos de cinc está más próximo al extremo C.