Ensayos de ganancia y pérdida genómica multiplexados.

Un procedimiento de preparación de un conjunto de partículas codificadas para ensayar ADN

, que comprende:

a) realizar una primera reacción de amplificación usando un molde de ADN y cebadores de oligonucleótidos de la primera reacción, comprendiendo cada uno de la pluralidad de los cebadores de la primera reacción una secuencia de ADN degenerada no específica variable y una secuencia de ADN constante contigua, para dar un primer producto de reacción que comprende primeros amplicones, en el que cada primer amplicón individual comprende una secuencia de ADN idéntica a una porción aleatoria del molde de ADN y una secuencia de ADN idéntica a la secuencia de ADN constante de los cebadores de la primera reacción;

b) realizar una segunda reacción de amplificación usando al menos una porción de los primeros amplicones como molde de ADN y cebadores de oligonucleótidos de la segunda reacción, comprendiendo los cebadores de oligonucleótidos de la segunda reacción la secuencia de ADN constante de los cebadores de la primera reacción, para dar un segundo producto de reacción que comprende segundos amplicones, en el que cada segundo amplicón individual comprende una secuencia de ADN idéntica a una porción aleatoria del molde de ADN y una secuencia de ADN idéntica a la secuencia de ADN constante de los cebadores de la primera reacción;

c) unir los segundos amplicones a una primera pluralidad de partículas codificadas, dando un conjunto de partículas codificadas para ensayar ADN.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2008/084540.

Solicitante: PERKINELMER LAS, INC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 940 Winter Street Waltham, MA 02451 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: ADLER, KARL, EDWIN, SCHERMER,MACK J.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)

PDF original: ES-2511029_T3.pdf

 

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Ensayos de ganancia y pérdida genómica multiplexados.

Fragmento de la descripción:

Ensayos de ganancia y pérdida genómica multiplexados Referencia a solicitud relacionada

La presente solicitud reivindica prioridad a la solicitud de patente de EE. UU. n.° de serie 12/55.919, presentada el 26 de marzo de 28, que reivindica prioridad a la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° de serie 6/992.489, presentada el 5 de diciembre de 27.

Campo de la invención

La tecnología descrita en el presente documento se refiere generalmente a procedimientos y composiciones para la detección de ácidos nucleicos. Más específicamente, se describen procedimientos y composiciones para ensayos de múltiplex de ADN genómico.

Antecedentes de la invención

Los ensayos para la detección de ganancia y pérdida genómica permiten la detección y diagnóstico de anomalías genéticas que pueden subyacer a enfermedad, afecciones conductuales y cognitivas, y otras patologías basadas en la genética. El documento W27/75894 A2 (Perkinelmer LAS, Inc.) 5/7/27 desvela hibridación genómica comparativa usando partículas codificadas que contienen ADN de BAC sonicado como sonda de hibridación. Se requiere un ensayo de múltiplex de perlas codificadas para ganancias y pérdidas cromosómicas que proporcione los beneficios del ADN de BAC como material de sonda sin interconexión de perlas u otros problemas de rendimiento del ensayo.

Resumen de la invención

Un procedimiento de ensayo de una muestra de ADN que incluye proporcionar un primer conjunto de partículas codificadas que en sí mismo incluye partículas codificadas que tienen amplicones unidos. Los amplicones comprenden cada uno un segmento de ADN derivado de cebador y contienen secuencias de ácidos nucleicos aleatorias que juntos representan sustancialmente una primera secuencia de ADN de molde entero. Los amplicones del primer conjunto de partículas codificadas se hibridan con ADN de muestra detectablemente marcado y con ADN de referencia detectablemente marcado. Se detecta una primera señal que es indicativa de la hibridación específica de los amplicones del primer conjunto de partículas codificadas con ADN de muestra detectablemente marcado. Se detecta una segunda señal que es indicativa de la hibridación específica de los amplicones del primer conjunto de partículas codificadas con ADN de referencia detectablemente marcado. La primera y segunda señales se comparan para detectar diferencias entre la primera y segunda señales y diferencias entre la primera y segunda señales son indicativas de diferencias entre el ADN de muestra y el ADN de referencia.

Opcionalmente, los amplicones unidos tienen una longitud en el intervalo de aproximadamente 5 - 12 nucleótidos, ambos incluidos.

El ADN de muestra detectablemente marcado puede ser ADN obtenido de un sujeto individual, tal como ADN genómico. El sujeto es un ser humano en realizaciones particulares de procedimientos descritos en el presente documento.

Realizaciones de procedimientos descritos en el presente documento incluyen adicionalmente proporcionar un segundo conjunto de partículas codificadas que incluye partículas codificadas que tienen amplicones unidos. Los amplicones del segundo conjunto de partículas codificadas comprenden cada uno un segmento de ADN derivado de cebador e incluyen secuencias de ADN que juntos representan sustancialmente una segunda secuencia de ADN de molde entero. Los amplicones del segundo conjunto de partículas codificadas se hibridan con ADN de muestra detectablemente marcado y con ADN de referencia detectablemente marcado. Se detecta una primera señal que es indicativa de la hibridación específica de los amplicones del segundo conjunto de partículas codificadas con ADN de muestra detectablemente marcado. Se detecta una segunda señal que es indicativa de la hibridación específica de los amplicones del segundo conjunto de partículas codificadas con ADN de referencia detectablemente marcado. La primera y segunda señales se comparan para detectar diferencias entre la primera y segunda señales y diferencias entre la primera y segunda señales son indicativas de diferencias entre el ADN de muestra y el ADN de referencia.

En realizaciones particulares, el primer y segundo conjuntos de partículas codificadas se proporcionan en una mezcla. Realizaciones de procedimientos de uso de una mezcla de conjuntos de partículas codificadas incluyen adicionalmente asociar la codificación de los conjuntos de partículas individuales con las señales detectadas de manera que se asocian las señales referentes al ADN de molde particular con diferencias entre el ADN de muestra y el ADN de referencia.

Los amplicones unidos a cada conjunto de partículas codificadas comprenden cada uno un segmento de ADN derivado de cebador e incluyen secuencias de ácidos nucleicos aleatorias que juntos representan sustancialmente una secuencia de ADN de molde entero. En realizaciones particulares, la secuencia de ADN de molde entero es mayor que cada

amplicón unido individual. En un ejemplo particular, la secuencia de ADN de molde entero tiene una longitud en el intervalo de aproximadamente 2 - 3 kilobases, ambos incluidos, y cada amplicón unido individual incluye una secuencia de ácidos nucleicos idéntica a una porción de la secuencia de ADN de molde que tiene una longitud en el intervalo de aproximadamente 5 - 12 nucleótidos, ambos incluidos.

Se describe un procedimiento de preparación de un conjunto de perlas codificadas para ensayar ADN que incluye a) realizar una primera reacción de amplificación usando un molde de ADN y cebadores de oligonucleótidos de la primera reacción. En esta reacción, cada uno de la pluralidad de los cebadores de la primera reacción incluye una secuencia de ADN degenerada no específica variable y una secuencia de ADN constante contigua. Un producto de reacción de esta primera reacción incluye primeros amplicones, en el que cada primer amplicón individual incluye una secuencia de ADN idéntica a una porción aleatoria del molde de ADN y una secuencia de ADN idéntica a la secuencia de ADN constante de los cebadores de la primera reacción. Adicionalmente se incluye en un procedimiento b) realizar una segunda reacción de amplificación usando al menos una porción de los primeros amplicones como molde de ADN y usar cebadores de oligonucleótidos de la segunda reacción. Los cebadores de oligonucleótidos de la segunda reacción incluyen la secuencia de ADN constante de los cebadores de la primera reacción y la segunda reacción de amplificación da un segundo producto de reacción que incluye segundos amplicones. Cada segundo amplicón individual incluye una secuencia de ADN idéntica a una porción aleatoria del molde de ADN y una secuencia de ADN idéntica a la secuencia de ADN constante de los cebadores de la primera reacción. Adicionalmente se incluye c) enlazar los segundos amplicones a una primera pluralidad de partículas codificadas produciendo así un conjunto de partículas codificadas para ensayar ADN.

Opcionalmente, los cebadores de oligonucleótidos de la segunda reacción incluyen adicionalmente un grupo funcional para la reacción con una partícula codificada. Por ejemplo, puede incluirse una amina del extremo 5'.

En otras realizaciones, a) - c) se repiten usando un segundo molde de ADN y enlazando segundos amplicones obtenidos así a una segunda pluralidad de partículas codificadas que son detectablemente diferentes de la primera pluralidad de partículas codificadas. Se genera un segundo conjunto de partículas codificadas para ensayar ADN por este procedimiento. En todavía otras realizaciones, a) - c) se repiten usando un tercer, cuarto, quinto o posterior molde de ADN genómico y enlazando el tercer, cuarto, quinto o posteriores amplicones así producidos a un tercera, cuarta, quinta o posterior pluralidad de partículas... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento de preparación de un conjunto de partículas codificadas para ensayar ADN, que comprende:

a) realizar una primera reacción de amplificación usando un molde de ADN y cebadores de oligonucleótidos de la primera reacción, comprendiendo cada uno de la pluralidad de los cebadores de la primera reacción una secuencia de ADN degenerada no específica variable y una secuencia de ADN constante contigua, para dar un primer producto de reacción que comprende primeros amplicones, en el que cada primer amplicón individual comprende una secuencia de ADN idéntica a una porción aleatoria del molde de ADN y una secuencia de ADN idéntica a la secuencia de ADN constante de los cebadores de la primera reacción;

b) realizar una segunda reacción de amplificación usando al menos una porción de los primeros amplicones como molde de ADN y cebadores de oligonucleótidos de la segunda reacción, comprendiendo los cebadores de oligonucleótidos de la segunda reacción la secuencia de ADN constante de los cebadores de la primera reacción, para dar un segundo producto de reacción que comprende segundos amplicones, en el que cada segundo amplicón individual comprende una secuencia de ADN idéntica a una porción aleatoria del molde de ADN y una secuencia de ADN idéntica a la secuencia de ADN constante de los cebadores de la primera reacción;

c) unir los segundos amplicones a una primera pluralidad de partículas codificadas, dando un conjunto de partículas codificadas para ensayar ADN.

2. El procedimiento de preparación de un reactivo para ensayar ADN de la reivindicación 1, en el que los cebadores de oligonucleótidos de la segunda reacción comprenden además un grupo funcional para la reacción con una partícula codificada.

3. El procedimiento de preparación de un reactivo para ensayar ADN de la reivindicación 1, que comprende además repetir a) - c) usando un segundo molde de ADN y unir los segundos amplicones así obtenidos a una segunda pluralidad de partículas codificadas detectablemente diferentes de la primera pluralidad de partículas codificadas, dando un segundo conjunto de partículas codificadas para ensayar ADN.

4. El procedimiento de preparación de un reactivo para ensayar ADN de la reivindicación 3, que comprende además mezclar el primer conjunto de partículas codificadas y el segundo conjunto de partículas codificadas.

5. El procedimiento de preparación de un reactivo para ensayar ADN de la reivindicación 3, que comprende además repetir a) - c) usando un tercer o posterior molde de ADN y unir los terceros o posteriores amplicones así producidos a una tercera o posterior pluralidad de partículas codificadas, cada una de la tercera o posterior pluralidad de partículas codificadas detectablemente diferente de cada otra pluralidad de partículas codificadas, dando un tercer o posterior conjunto de partículas codificadas para ensayar ADN.

6. El procedimiento de preparación de un reactivo para ensayar ADN de la reivindicación 5, que comprende además mezclar el primer conjunto de partículas codificadas, el segundo conjunto de partículas codificadas, el tercer conjunto de partículas codificadas y/o posterior conjunto de partículas codificadas.

7. Un procedimiento de ensayo de una muestra de ADN, que comprende:

proporcionar un primer conjunto de partículas codificadas preparado según el procedimiento de la reivindicación 1 que comprende partículas codificadas que tienen amplicones unidos, comprendido cada amplicón un segmento de ADN derivado de cebador y secuencias de ácidos nucleicos aleatorias representando juntas sustancialmente una primera secuencia de ADN de molde entero;

hibridar los amplicones del primer conjunto de partículas codificadas con ADN de muestra detectablemente marcado;

hibridar los amplicones del primer conjunto de partículas codificadas con ADN de referencia detectablemente marcado;

detectar una primera señal que indica hibridación específica de los amplicones del primer conjunto de partículas codificadas con ADN de muestra detectablemente marcado y una segunda señal que indica hibridación específica de los amplicones del primer conjunto de partículas codificadas con ADN de referencia detectablemente marcado; y

comparar la primera señal y la segunda señal para detectar diferencias entre la primera y segunda señales, las diferencias de la primera y segunda señales indicativas de diferencias entre el ADN de muestra y el ADN de referencia, ensayando así la muestra de ADN.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, que comprende además:

proporcionar un segundo conjunto de partículas codificadas preparadas según el procedimiento de la reivindicación 1 que comprende partículas codificadas que tienen amplicones unidos, comprendido cada amplicón un segmento de ADN

derivado de cebador y secuencias de ácidos nucleicos aleatorias representando juntas sustancialmente una segunda secuencia de ADN de molde entero;

hibridar los amplicones del segundo conjunto de partículas codificadas con ADN de muestra detectablemente marcado;

hibridar los amplicones del segundo conjunto de partículas codificadas con ADN de referencia detectablemente marcado;

detectar una primera señal que indica hibridación específica de los amplicones del segundo conjunto de partículas codificadas con ADN de muestra detectablemente marcado y una segunda señal que indica hibridación específica de los amplicones del segundo conjunto de partículas codificadas con ADN de referencia detectablemente marcado; y

comparar la primera señal que indica hibridación específica de los amplicones del segundo conjunto de partículas codificadas y la segunda señal que indica hibridación específica de los amplicones del segundo conjunto de partículas codificadas para detectar diferencias entre la primera y segunda señales, las diferencias de la primera y segunda señales indicativas de diferencias entre el ADN de muestra y el ADN de referencia.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el primer y segundo conjuntos de partículas codificadas se proporcionan en una mezcla y que comprende además:

asociar la codificación del primer conjunto de partículas codificadas con la primera señal que indica hibridación específica de los amplicones del primer conjunto de partículas codificadas con ADN de muestra detectablemente marcado y una segunda señal que indica hibridación específica de los amplicones del primer conjunto de partículas codificadas; y

asociar la codificación del segundo conjunto de partículas codificadas con la primera señal que indica hibridación específica de los amplicones del segundo conjunto de partículas codificadas con ADN de muestra detectablemente marcado y la segunda señal que indica hibridación específica de los amplicones del segundo conjunto de partículas codificadas.

1. Un procedimiento de ensayo de ADN de muestra, que comprende:

proporcionar un reactivo de múltiplex que comprende una mezcla de dos o más conjuntos de partículas codificadas preparados según el procedimiento de la reivindicación 1 codificados de forma que cada partícula de cada conjunto de partículas codificadas sea detectablemente distinguible de cada partícula de cada otro conjunto de partículas codificadas, teniendo las partículas codificadas amplicones unidos amplificados de una secuencia de ADN de molde, comprendiendo cada amplicón una secuencia de ADN derivada de cebador y una secuencia de ácidos nucleicos aleatoria que es idéntica a un segmento de la secuencia de ADN de molde, teniendo cada conjunto de partículas codificadas amplicones unidos amplificados de una secuencia de ADN de molde diferente en comparación con cada otro conjunto de partículas codificadas,

hibridar los amplicones unidos con ADN detectablemente marcado;

hibridar los amplicones unidos con ADN de referencia detectablemente marcado;

detectar una primera señal que indica hibridación específica de los amplicones con ADN detectablemente marcado;

detectar una segunda señal que indica hibridación específica de los amplicones con ADN de referencia detectablemente marcado;

identificar las partículas codificadas de manera que se asocie la codificación de partículas con la primera señal;

identificar las partículas codificadas de manera que se asocie la codificación de partículas con la segunda señal; y

comparar la primera señal y la segunda señal para cada conjunto de partículas codificadas, en el que diferencias en la primera y segunda señales son indicativas de diferencias entre el ADN de muestra y de referencia, ensayando así el ADN.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que los amplicones unidos a cada conjunto de partículas codificadas comprenden cada uno un segmento de ADN derivado de cebador y secuencias de ácidos nucleicos aleatorias que juntos representan sustancialmente una secuencia de ADN de molde entero, en el que la secuencia de ADN de molde entero es mayor que cada amplicón unido individual.

12. El procedimiento de la reivindicación 7 o 1, en el que el ADN de muestra detectablemente marcado es ADN detectablemente marcado obtenido de un sujeto individual.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el ADN de muestra detectablemente marcado es ADN genómico detectablemente marcado obtenido de un sujeto individual.

14. El procedimiento de la reivindicación 7 o 1, en el que el ADN de muestra detectablemente marcado es ADN humano.

15. Un reactivo para ensayar ADN, que comprende:

una pluralidad de partículas codificadas preparadas según el procedimiento de la reivindicación 1 que tienen amplicones unidos amplificados de una secuencia de ADN de molde, cada amplicón unido individual comprende un segmento de ADN derivado de cebador y una secuencia de ADN idéntica a una porción aleatoria de la secuencia de ADN de molde, en el que los amplicones juntos representan sustancialmente el molde de ADN entero y en el que la secuencia de ácidos nucleicos idéntica a una porción aleatoria de la secuencia de ADN de molde de cada amplicón individual es más corta que el molde de ADN entero.

16. Un reactivo de múltiplex para ensayar ADN, que comprende:

una mezcla de dos o más pluralidades de partículas preparadas según el procedimiento de la reivindicación 1, las partículas codificadas de forma que partículas de cada pluralidad de partículas sean detectablemente distinguibles de partículas de cada otra pluralidad de partículas, teniendo las partículas codificadas amplicones unidos amplificados de una secuencia de ADN de molde, teniendo cada pluralidad de partículas codificadas amplicones unidos amplificados de una secuencia de ADN de molde diferente en comparación con cada otra pluralidad de partículas codificadas, comprendiendo cada amplicón unido individual un segmento de ADN derivado de cebador y una secuencia de ADN idéntica a una porción aleatoria de la secuencia de ADN de molde.

17. Un kit para ensayar ADN, que comprende:

una mezcla de dos o más pluralidades de partículas preparadas según el procedimiento de la reivindicación 1, las partículas codificadas de forma que partículas de cada pluralidad de partículas sean detectablemente distinguibles de partículas de cada otra pluralidad de partículas, teniendo las partículas codificadas amplicones unidos amplificados de una secuencia de ADN de molde, teniendo cada pluralidad de partículas codificadas amplicones unidos amplificados de una secuencia de ADN de molde diferente en comparación con cada otra pluralidad de partículas codificadas, comprendiendo cada amplicón unido individual un segmento de ADN derivado de cebador y una secuencia de ADN idéntica a una porción aleatoria de la secuencia de ADN de molde.