Sistemas de ensayo universales y procedimientos de uso de los mismos para identificar múltiples familias de microorganismos.

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN SISTEMA DE ANALISIS UNIVERSAL Y SUS PROCEDIMIENTOS DE USO PARA LA IDENTIFICACION DE UN MICROORGANISMO ENTRE

, POR LO MENOS, DOS GRUPOS DE MICROORGANISMOS MUY DISTINTOS. EL SISTEMA DE ANALISIS UNIVERSAL COMPRENDE UNA COMBINACION PREDETERMINADA DE ANALISIS BIOQUIMICOS NO REDUNDANTES QUE ENCIERRAN UN SUBSTRATO PARA, AL MENOS, UNA ENZIMA, CUYO SUBSTRATO PROVOCA LA FORMACION DE UN PRODUCTO DETECTABLE SI SE SOMETE A LA ACCION DE UNA ENZIMA. SE UTILIZAN LUEGO ESTOS PRODUCTOS DETECTABLES A PARTIR DE LA COMBINACION DE ANALISIS BIOQUIMICOS PARA IDENTIFICAR EL MICROORGANISMO.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US1998/005097.

Solicitante: SIEMENS HEALTHCARE DIAGNOSTICS INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 511 BENEDICT AVENUE TARRYTOWN, NY 10591 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: GODSEY, JAMES, H., NOTHAFT, DANIEL, M.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > C12Q1/00 (Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones)

PDF original: ES-2200321_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Sistemas de ensayo universales y procedimientos de uso de los mismos para identificar varias familias de microorganismos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a sistemas de ensayo universales y a los procedimientos de uso de los mismos para determinar la identidad de un microorganismo que puede pertenecer a uno cualquiera de los múltiples grupos de microorganismos divergentes, por ejemplo, anaerobios, levaduras, patógenos, entéricos, estafilococos, estreptococos, y enterococos, entre los microorganismos de diversos grupos o familias. Los sistemas de ensayo de la presente invención comprenden una sola batería de ensayos predeterminados para detectar la presencia de enzimas únicas para una familia o grupos de microorganismos, género y/o especies.

Antecedentes de la invención

El desarrollo de métodos para clasificar o identificar bacterias ha sido una meta constante de la comunidad dedicada al estudio microbiológico desde el mismo comienzo de la disciplina de la microbiología. Los primeros métodos de clasificación se basaron en el examen microscópico de los microorganismos y la descripción subsiguiente de su morfología celular, es decir, células con forma de cocos, células con forma cilíndrica (bacilos) , células con forma de cocobacilo, levaduras en germinación, y espiroquetas. Los microbiólogos describieron también sus observaciones microscópicas de agrupaciones celulares de microorganismos como un medio adicional de categorizar microorganismos, por ejemplo, estreptococos refiriéndose a una cadena de células con forma de coco que parecen una hilera de perlas, estafilococos refiriéndose a una agrupación de células con forma de coco que recuerdan un racimo de uvas, etc. Más tarde se desarrollaron tinciones para aumentar las capacidades de diferenciación del microscopio. La más importante de éstas fue la tinción de Gram, que dividió los microorganismos en dos grupos: microorganismos gram negativos que se tiñen de rosa a rojo, y microorganismos gram positivos que se tiñen de azul claro a azul. Subsiguientemente se observó que entre los microorganismos que causan enfermedades humanas, la mayoría de los microorganismos gram negativos tenían forma cilíndrica, y la mayoría de los microorganismos gram positivos tenían forma de coco. Otro de los primeros medios para diferenciar microorganismos fue determinar la capacidad del microorganismo para crecer en presencia o ausencia de oxígeno. Los microorganismos que crecen en presencia de oxígeno se llaman aerobios, y aquellos que crecen en ausencia de oxígeno se llaman anaerobios.

Uno de los primeros descubrimientos más importantes en microbiología de diagnóstico fue la capacidad para crecer bacterias en tubos de ensayo o en placas petri usando diferentes tipos de medios de crecimiento bacteriológico líquidos o sólidos. Posteriormente los microbiólogos empezaron a añadir diversos productos químicos a los medios de crecimiento para desarrollar medios adicionales de diferenciación entre los microorganismos tales como los ensayos de crecimiento o de inhibición del crecimiento, por ejemplo, NaCl al 6, 5% inhibe el crecimiento de los estreptococos pero no de los enterococos, o ensayos bioquímicos, por ejemplo, las bacterias entéricas fermentan la glucosa para dar lugar a productos finales ácidos, mientras que las bacterias no fermentativas no lo hacen.

La combinación de todos los ensayos bioquímicos, de crecimiento/inhibición y morfológicos mencionados antes en una batería de ensayos disponible para los microbiólogos para clasificar bacterias condujo al desarrollo de medios de clasificación de las bacterias en las entidades taxonómicas tradicionales de familia, género, especie, utilizadas para clasificar todos los seres vivos. Históricamente, el enfoque de los microbiólogos ha sido desarrollar baterías de ensayos de clasificación que se aplican sólo a un grupo o familia de microorganismos, por ejemplo, el esquema de Facklam para identificar estreptococos viridans (Ref. 3) , el esquema de Kloos y Schleifer para identificar estafilococos coagulasa negativos (Ref. 2) , el esquema de Edwards y Ewing para identificar gérmenes entéricos gram negativos (Ref. 1) , etc. Cada uno de estos esquemas usa formulaciones de ensayo que se diseñaron especialmente para el metabolismo y características de crecimiento de la familia de microorganismos a las que se dirige el esquema. Así, un ensayo de fermentación de glucosa para estreptococos se formula de manera diferente que un ensayo de fermentación de glucosa para microorganismos entéricos. De hecho, los proveedores comerciales de medios bacteriológicos preparados proporcionan las formulaciones específicas de familia anteriores en una base comercial. El catálogo Remel (12076 Santa Fe Drive, Lenexa, Kansas 66215-3594) número 103 (Enero de 1994) , ofrece a los microbiólogos una amplia variedad de formulaciones bioquímicas en tubo convencionales con las que llevar a cabo los esquemas de identificación a los que se hace alusión antes. El catálogo Remel ofrece específicamente ocho (8) formulaciones de medios diferentes para detectar la fermentación de carbohidratos por siete (7) familias diferentes de microorganismos. Estos son, como sigue: el caldo púrpura se usa para analizar organismos entéricos (páginas 40-41) , el caldo de rojo fenol se usa para analizar estreptococos (véanse las páginas 38-39) , el medio P.R.A.S. y el medio CHO se usan para analizar anaerobios (véanse las páginas 29-30, y 40) , el medio CTA y el caldo de infusión de corazón se usan para analizar microorganismos patógenos (véanse las páginas 30-31, y 33) , el medio OF se usa para analizar bacilos Gram negativos y gérmenes entéricos no fermentativos (véanse las páginas 37-38) , y el caldo de fermentación de levaduras se usa para analizar levaduras (véanse las páginas 47-48) .

Referencias

1. Ewing, W.H., 1986, Edwards and Ewing's Identification of Enterobacteriaceae, 4ª ed., Elsevier Science Publishing Co., New York.

2. Kloose, W.E., y K.H. Schleifer, 1975, Simplified scheme for routine identification of human Staphylococcus species, J. Clin. Microbiol., 1:82-88.

3. Facklan, R.R., y J.A. Washington II, 1991, Streptococcus and related catalase-negative gram-positive cocci, p. 238-257, Manual of Clinical Microbiology, A. Barlows, W.J. Hausler, Jr., K.L. Herrmann, H.D. Isenberg, y H.J. Shadome (ed.) , 5ª ed., American Society for Microbiology, Washington, DC.

Comenzando al final de los años 1960 con la introducción por Roche Diagnostic's (1447 York Court, Burlington, NC 27215) del sistema de identificación de enterotubo para bacterias entéricas, y seguido rápidamente por el lanzamiento del sistema de identificación entérico 20E de API (595 Anglum Drive, Hazelwood, MO 63042-2395) , las compañías de diagnóstico empezaron a adoptar este mismo fundamento para el desarrollo y fabricación de kits comerciales de identificación de bacterias. Vitek, MicroScan, IDS (Innovative Diagnostic Systems, 2797 Peterson Place, Norcross, GA 30071) , y API ofrecen cada uno un producto específico de familia para identificar cada familia o grupo de bacterias. (Véase la Tabla I a continuación) .

TABLA I
MicroorganismoMicroScanIDSVitekAPI
MicroScan Dr y IDS RapID onEVitek GNI... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un sistema de ensayo para identificar un microorganismo en una muestra, siendo capaz el sistema de ensayo de identificar ese microorganismo entre grupos de microorganismos ampliamente divergentes que comprenden levaduras y al menos uno de:

i) bacterias anaerobias,

ii) bacterias entéricas,

iii) el grupo de bacterias gram positivas,

iv) neisseria y Haemophilus, o

v) bacterias patógenas,

que pueden estar presentes en dicha muestra; y comprendiendo el sistema de ensayo: una combinación predeterminada de ensayos bioquímicos no redundantes dispuestos en un número predeterminado de cámaras de reacción, comprendiendo cada ensayo bioquímico un sustrato para una enzima o grupo de enzimas, y además dando como resultado el sustrato, si actúa la enzima o grupo de enzimas, la formación de un producto detectable en la cámara de reacción; y en el que los productos detectables de la combinación de ensayos bioquímicos se usan para identificar el microorganismo en la muestra usando una matriz de probabilidad.

2. Un sistema de ensayo según la reivindicación 1, en el que identificar un microorganismo comprende clasificar el microorganismo en un género o una especie de microorganismo, o ambos.

3. Un sistema de ensayo según la reivindicación 1, en el que la combinación predeterminada de ensayos no redundantes comprende ensayos fluorescentes, ensayos colorimétricos, o una combinación de los mismos.

4. Un sistema de ensayo según la reivindicación 3, en el que los ensayos fluorescentes se llevan a cabo en un formato fluorogénico o fluorométrico.

5. Un sistema de ensayo según la reivindicación 3, en el que la combinación predeterminada de ensayos no redundantes se lleva a cabo en aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 8 horas.

6. Un sistema de ensayo según la reivindicación 1, en el que la combinación predeterminada de ensayos no redundantes se lleva a cabo a una temperatura entre aproximadamente 25 y aproximadamente 37ºC.

7. Un sistema de ensayo según la reivindicación 6, en el que los ensayos colorimétricos se leen visualmente o mediante un colorímetro.

8. Un sistema de ensayo según la reivindicación 4, en el que los ensayos fluorescentes se leen usando un fluorímetro.

9. Un sistema de ensayo según la reivindicación 1, que comprende al menos un ensayo para detectar una peptidasa, glucosidasa, una enzima de fermentación de un azúcar, una ureasa, una descarboxilasa, una esterasa, una enzima de utilización de carbono, una fosfatasa, o una triptofanasa.

10. Un sistema de ensayo según la reivindicación 9, que comprende un ensayo para al menos una peptidasa y al menos una glucosidasa.

11. Un sistema de ensayo según la reivindicación 10, que comprende además un ensayo para al menos una enzima de fermentación de un azúcar.

12. Un sistema de ensayo según la reivindicación 11, que comprende además un ensayo para al menos una ureasa.

13. Un sistema de ensayo según la reivindicación 12, que comprende además un ensayo para al menos una descarboxilasa.

14. Un sistema de ensayo según la reivindicación 13, que comprende además un ensayo para al menos una esterasa.

15. Un sistema de ensayo según la reivindicación 14, que comprende además un ensayo para al menos una enzima de asimilación de carbono.

16. Un sistema de ensayo según la reivindicación 1, en el que la combinación predeterminada de ensayos bioquímicos no redundantes es capaz de identificar uns microorganismoentre al menos dos de los siguientes:

bacterias entéricas y no fermentativas;

bacterias anaerobias;

levaduras;

Staphylococcus sp., Streptococcus sp. y Enterococcus sp.; y

bacterias patógenas.

17. Un sistema de ensayo según la reivindicación 1, en el que la combinación predeterminada de ensayos bioquímicos no redundantes es capaz de identificar un microorganismo entre al menos uno de los siguientes:

Staphylococcus sp., Streptococcus sp. y Enterococcus sp.;

Cor y nebacteria sp.;

Lactobacillus sp.

Pediococcus sp.

Leuconostococcus sp.

Alloicoccus sp.

Vagococcus sp.

Kluyvera sp.

Leminorella sp.

Haemophilus sp. y Neisseria sp.

Moraxella sp.

Salmonella sp.

Clostridia sp. y

Listeria sp..

18. Un sistema de ensayo según la reivindicación 1, en el que la combinación predeterminada de ensayos bioquímicos no redundantes es capaz de identificar microorganismos entre al menos uno de: microorganismos anaerobios, levaduras o bacterias patógenas.

19. Un sistema de ensayo según la reivindicación 18, en el que la combinación predeterminada de ensayos bioquímicos no redundantes es capaz de identificar microorganismos entre anaerobios y levaduras o bacterias patógenas.

20. Un sistema de ensayo según la reivindicación 19, en el que la combinación predeterminada de ensayos bioquímicos no redundantes es capaz de identificar un microorganismo entre levaduras y bacterias patógenas.

21. Un sistema de ensayo según la reivindicación 1, en el que la combinación predeterminada de ensayos bioquímicos no redundantes es capaz de identificar microorganismos entre al menos uno de los Staphylococcus, Streptococcus o Enterococcus y al menos uno entre anaerobios, levaduras, microorganismos entéricos y no fermentativos o bacterias patógenas, o combinaciones de los mismos.

22. Un sistema de ensayo según la reivindicación 1, en el que el sistema de ensayo es capaz de identificar entre levaduras, bacterias anaerobias y bacterias patógenas.

23. Un sistema de ensayo según la reivindicación 1, en el que el sistema de ensayo es capaz de identificar Enterococcus, Staphylococcus, o Streptococcus; anaerobios; levaduras; y bacterias patógenas.

24. Un sistema de ensayo según la reivindicación 1, en el que los sustratos comprenden lisina (AMC) , leucina (AMC) , metionina (AMC) , glicilprolina (AMC) , isoleucina (AMC) , trealosa, maltosa, L-triptófano (7-AMC) , 4-MeU-fosfato, \square- D-xilósido-4MeU, hidroxiprolina-AMC, β-D-glucurónido-4MeU, tirosina (AMC) , 4-MeU-β-D-galactósido, manosa, sacarosa, y prolina (AMC) .

25. Un sistema de ensayo según la reivindicación 24, en el que los sustratos además comprenden fructosa, glicerol, L-histidina 7-AMC, ácido piroglutámico (AMC) y 4-MeU-β-D-glucósido.

26. Un sistema de ensayo según la reivindicación 25, en el que los sustratos comprenden además L-serina 7-AMC, celobiosa, arginina (AMC) , y 4-MeU-N-acetil-β-D-galactosamidina.

27. Un procedimiento para identificar un microorganismo en una muestra de entre al menos dos grupos de microorganismos ampliamente divergentes que comprenden las levaduras y al menos uno de:

i) bacterias anaerobias,

ii) bacterias entéricas,

iii) el grupo de bacterias gram positivas,

iv) neisseria y Haemophilus, o

v) bacterias patógenas,

que pueden estar presentes en tal muestra mediante el uso de un sistema de ensayo según la reivindicación 1, comprendiendo el procedimiento:

a) añadir la muestra a cada cámara de reacción que comprende un sustrato;

b) permitir a la enzima, si está presente, reaccionar con el sustrato;

c) determinar la presencia de la enzima en la muestra detectando el producto detectable en un ensayo; y

d) comparar los resultados de la combinación de ensayos predeterminados con al menos un estándar predeterminado para identificar el microorganismo en la muestra.

28. Un ensayo según la reivindicación 1 para detectar la utilización de una fuente de carbono por un microorganismo, comprendiendo levaduras y al menos uno de:

i) bacterias anaerobias,

ii) bacterias entéricas,

iii) el grupo de bacterias gram positivas,

iv) neisseria y Haemophilus, o

v) bacterias patógenas,

comprendiendo el ensayo al menos una fuente de carbono y al menos un indicador fluorométrico, actuando el microorganismo sobre la fuente de carbono para producir un cambio en el pH que causa un cambio en la fluorescencia del indicador, siendo el cambio en la fluorescencia indicativo de una utilización de la fuente de carbono por el microorganismo.