Ensayo bactericida del suero para antisueros específicos de N. meningitidis.

Un ensayo de Actividad Bactericida del Suero (ABS) del serogrupo W de N.

meningitidis que comprende la etapa de determinar el título de ABS de una muestra de suero frente a una cepa de referencia de serogrupo W de N. meningitidis, en el que la cepa de referencia de serogrupo W de N. meningitidis no es sensible a la eliminación dependiente de complemento en ausencia de suero y en el que la cepa de referencia de serogrupo W de N. meningitidis es un aislado 3193 de N. meningitidis.

Ensayo bactericida del suero para antisueros específicos de N. meníngitidis Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de las composiciones de vacuna de neiseria y a procedimientos para evaluar la calidad de la respuesta inmune provocada después de su administración, por ejemplo equivalentes de protección de laboratorio y en particular actividad bactericida del suero (ABS).

Antecedentes de la invención

Neisseria meníngitidis (meningococo) es una bacteria Gram negativa aislada frecuentemente del tracto respiratorio superior humano. Es una causa de enfermedades bacterianas invasivas graves (a una escala endémica y epidémica), tales como bacteremia y meningitis. La incidencia de enfermedad meningocócica muestra diferencias geográficas, estacionales y anuales (Schwartz, B., Moore, P.S., Broome, C. V.; Clin. Microbiol. Rev. 2 (Suplemento), S18-S24, 1989). La bacteria afecta principalmente a niños de 6 meses a 2 años, pero también afecta a adolescentes. La bacteria se clasifica comúnmente de acuerdo con el serogrupo de su polisacárido capsular.

La mayor parte de la enfermedad en países templados se debe a cepas del serogrupo B y su incidencia varía de 1- 10/100.000/año de la población total - alcanzando algunas veces valores más elevados (Kaczmarski, E. B. (1997), Commun. Dis. Rep. Rev. 7: R55-9, 1995; Scholten, R.J.P.M., Bijlmer, H.A., Poolman, J. T. y col. Clin. Infect. Dis. 16: 237-246, 1993; Cruz, C., Pavez, G., Aguilar, E. y col. Epidemol. Infecí. 105: 119-126, 1990).

Las epidemias dominadas por meningococos del serogrupo A, la mayoría en África Central, algunas veces alcanzan niveles de incidencia de hasta 1000/100.000/año (Schwartz, B., Moore, P. S., Broome, C. V. Clin. Microbiol. Rev. 2 (Suplemento), S18-524, 1989). Casi todos los casos de enfermedad meningocócica, como un todo, son causados por meningococos de serogrupo A, B, C, W-135 e Y y está disponible una vacuna de polisacárido capsular tetravalente A, C, W-135, Y (Armand, J., Arminjon, F., Mynard, M. C., Lafaix, C., J. Biol. Stand. 10: 335-339, 1982). Las vacunas de polisacárido disponibles se están mejorando actualmente por medio de la conjugación química de las mismas a proteínas vehículo (Lieberman, J. M., Chiu, S. S., Wong, V. K. y col. JAMA 275: 1499-1503, 1996). Se ha observado que el polisacárido capsular de serogrupo B es no inmunogénico - más probablemente debido a que comparte similitud estructural con componentes del huésped (Wyle, F. A., Artenstein, M. S., Brandt, M. L y col. J. Infecí. Dis. 126: 514-522, 1972; Finne, J. M., Leinonen, M., Mákelá, P. M. Lancetii.: 355-357, 1983).

La frecuencia de infecciones por Neisseria meníngitidis ha aumentado en las últimas décadas en muchos países europeos. Esto se ha atribuido a la transmisión aumentada debido a un aumento en las actividades sociales en condiciones de hacinamiento (por ejemplo, discotecas, piscinas, teatros, etc.). Ya no es poco común aislar cepas de Neisseria meníngitidis que son menos sensibles, o resistentes, a algunos de los antibióticos convencionales. Este fenómeno ha creado una necesidad médica no satisfecha y exige nuevos agentes antimicrobianos, vacunas, procedimientos de selección de fármacos y ensayos de diagnóstico para este organismo.

El desarrollo de vacunas eficaces requiere ensayos fiables para establecer si se ha provocado una respuesta inmune eficaz en individuos vacunados. Para las vacunas de serogrupo A, B y C de N. meníngitidis los ensayos de Actividad Bactericida del Suero (ABS) se han considerado el patrón oro en el campo (aceptándose un aumento de cuatro veces en ABS como sustitutos para la protección de estos serogrupos) [Borrow y col., 2001, Infect Immun 69: 1568-1573; Vermont y col., 2002, FEMS Immum and Med Microbiol 34: 89-96]. El ensayo puede proporcionar información acerca de: a) si cualquier muestra de suero particular tiene un nivel (título) de anticuerpos bactericidas suficiente para alcanzar un umbral protector, b) un % de seropositividad (%SP) de sujetos que sobrepasan este nivel, c) un % de seroconversión (%SC) de sujetos i) con una proporción de títulos de ABS (títulos séricos de post- a pre-inmunización) que aumenta más allá de un múltiplo particular (4 veces) o ii) con relación al % de SP si el nivel de títulos de ABS antes de la inmunización en los sujetos (es decir, los muy jóvenes) está por debajo del umbral de ABS protector. Por lo tanto, este ensayo se usa como una primera lectura (de protección y eficacia de la vacuna). Además de los ensayos de ABS con frecuencia se usan ensayos de ELISA de IgG como una lectura secundaria. Estos ensayos de ELISA miden la concentración (en pg/ml) de anticuerpos de IgG en una muestra de suero que se unen a un polisacárido capsular meningocócico (A, C, W-135 o Y).

En ensayos de ABS de A, C, W-135 (o W) e Y el efecto de anticuerpos anti-A/e/ssena meníngitidis de serogrupo A, C, W e Y específicos respectivamente se evalúa en la presencia de complemento (típicamente a partir de gazapo [un ensayo de ABSc] o como alternativa a partir de suero humano [un ensayo de ABSh]). Se añade una mezcla de bacterias y complemento a los sueros. Los anticuerpos específicos meningocócicos se unen a la superficie de la célula diana a través de una proteína específica meningocócica o restos de carbohidrato. La subunidad C1q de C1

se une a la porción Fe de la Ig unida a superficie. La unión de C1q a Ig activa la ruta clásica del complemento que en última instancia da como resultado la eliminación de la célula diana. El título bactericida para cada suero se expresa como la dilución sérica recíproca correspondiente a la eliminación del 50%.

En la técnica se conocen bien los procedimientos de ensayo de ABS. En 1976 el Comité de Expertos de la OMS en Patrones Biológicos recomendó que se usara un ensayo de ABS para satisfacer los requerimientos de producción y liberación de vacunas de polisacárido meningocócicas (WHO Tech. Rep. Ser. 1976, 594: 72-73). Desde esta época los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC), Atlanta, Georgia, EE.UU. han investigado las diversas variables en un ensayo de ABS (N.° de UFC por pocilio, tampón de ensayo, crecimiento de la cepa diana, tiempo de incubación del ensayo, fuente de complemento, concentración de complemento y dilución de partida del suero) y han recomendado y usado en el campo protocolos de ensayo de ABS convencionales bien conocidos (Maslanka y col. Clin. Diag. Laboratory Immun. 1997, 4: 156-167). Típicamente, los CDC también recomiendan y proporcionan cepas meningocócicas para uso en ensayos de ABS en el campo de vacunas meningocócicas. Por ejemplo se ha llegado a un consenso (directrices de OMS) para un ensayo de ABS de serogrupo C (MenC) de N. meningitidis con respecto a la cepa de ensayo recomendada para el uso.

Sumario de la invención

Como se ha indicado anteriormente el ensayo de ABS es el procedimiento más importante para medir la actividad funcional de anticuerpos séricos frente a meningococo. Para determinar si un sujeto o una población es seropositiva frente a meningococo invasivo (o se ha seroconvertido después de la vacunación) el ensayo de ABS debe de forma ideal ser a la vez sensible y específico. Debe ser sensible a anticuerpos protectores inducidos después de la inmunización con vacunas eficaces (tales como vacunas de conjugado de sacárido capsular MenA/W/C/Y) pero no solamente a complemento que no esté en presencia de anticuerpos. También debe ser específico para que registre la presencia de anticuerpos funcionales frente a cepas invasivas, pero minimice el efecto de la presencia de cualquier anticuerpo de avidez baja que pueda ser eficaz frente a cepas portadoras pero no frente a cepas invasivas.

Los autores de la presente invención han descubierto que los procedimientos de ABS empleados actualmente para evaluar los anticuerpos protectores frente a serogrupos A y W135 meningocócicos se pueden mejorar significativamente en uno o más de los aspectos anteriores.

Adicionalmente los autores de la invención han descubierto de forma sorprendente, que la cepa proporcionada/sugerida por los CDC para ensayos de ABS de serogrupo W-135 (MenW) de N. meningitidis (cepa S4383) no es óptima para este fin en el sentido de que es demasiado sensible a ser destruida por la propia fuente de complemento sin que haya suero presente. Esto plantea problemas significativos en el uso de esta cepa para los ensayos de ABS. De nuevo se han desarrollado estrategias de ABS ventajosas usando las cepas de referencia de MenW novedosas.

De acuerdo con ello se proporciona en una realización un ensayo (por ejemplo ABSh o ABSr) de Actividad Bactericida del Suero (ABS) del serogrupo W de N. meningitidis que comprende la etapa de determinar... [Seguir leyendo]

1. Un ensayo de Actividad Bactericida del Suero (ABS) del serogrupo W de N. meningitidis que comprende la etapa de determinar el título de ABS de una muestra de suero frente a una cepa de referencia de serogrupo W de N. meningitidis, en el que la cepa de referencia de serogrupo W de N. meningitidis no es sensible a la eliminación dependiente de complemento en ausencia de suero y en el que la cepa de referencia de serogrupo W de N. meningitidis es un aislado 3193 de N. meningitidis.

2. Un ensayo de Actividad Bactericida del Suero (ABS) del serogrupo W de N. meningitidis de la reivindicación 1, en el que la muestra de suero se ha tomado de un huésped inmunizado con una composición de vacuna que comprende un antígeno de sacárido capsular (preferentemente conjugado a una proteína vehículo) a partir del serogrupo A y/o W de N. meningitidis.

3. Un ensayo de Actividad Bactericida del Suero (ABS) del serogrupo W de N. meningitidis de las reivindicaciones 1-2, en el que la muestra de suero se ha tomado de un ser humano de 0-55 años de edad, 1 mes - 20 años, 2 meses - 16 años, 6 meses - 10 años, 8 meses - 7 años, 10 meses - 4 años, 0-2 años, 6 meses - 2 años o 1-2 años.

4. El ensayo de ABS de las reivindicaciones 1 o 3, en el que la sensibilidad de la cepa de referencia de serogrupo W de N. meningitidis a la eliminación dependiente de complemento se puede determinar por medida del % de la toxicidad del complemento mediante el procedimiento del Ejemplo 2b, en el que el procedimiento de ABS se lleva a cabo diluyendo muestras de suero con un diluyente de ensayo con PBS conteniendo glucosa al 0,1%, MgCh 0,5 mM y CaCI2 0,9 mM a pH 7,4, añadiendo una dilución 1:180000 en el diluyente de ensayo de la cepa de referencia diluida a partir de una D.O. de 0,400-0,500 a 600 nm, añadiendo complemento de gazapo para producir una mezcla que corresponde al 60% de complemento y al 40% de suspensión bacteriana 1:180000 e incubando durante 1 hora a 37°C.

5. El ensayo de ABS de las reivindicaciones 1-4, en el que la muestra de suero se ha tomado a partir de un huésped inmunizado con una composición de vacuna que comprende antígeno de sacárido capsular (preferentemente conjugado a una proteína vehículo) a partir del serogrupo W de N. meningitidis.

6. El uso de aislado 3193 de N. meningitidis en un ensayo de SBA.

7. El ensayo de SBA de las reivindicaciones 1-5 que es un ensayo de ABSh.

8. El ensayo de SBA de las reivindicaciones 1-5 que es un ensayo de ABSr.