Enriquecimiento de una secuencia diana.

Un método para enriquecer una secuencia diana en una mezcla de reacción, comprendiendo dicho método:

a. someter una mezcla de reacción sospechosa de tener un dúplex de secuencia diana y un dúplex de secuencia de referencia a una primera temperatura de desnaturalización que está por encima de la temperatura de fusión

(Tm) del dúplex de la secuencia de referencia y del dúplex de la secuencia diana, para permitir la desnaturalización de dicho dúplex de secuencia diana y de dicho dúplex de secuencia de referencia, en el que dicho dúplex de secuencia diana comprende una o más inserciones, supresiones o alteraciones y difiere en al menos un nucleótido de dicho dúplex de secuencia de referencia, y en el que dicha secuencia diana es al menos 50% homóloga a dicho dúplex de secuencia de referencia y es amplificable por el mismo par de cebadores que dicho dúplex de secuencia de referencia, y en el que la secuencia diana es menos predominante en la mezcla de reacción que la secuencia de referencia;

b. reducir la temperatura de la mezcla de reacción hasta una temperatura de hibridación para permitir la formación de dúplex de hebra diana/hebra de referencia y evitar la unión de dicho par de cebadores a las hebras diana y de referencia desnaturalizadas en la mezcla de reacción, en el que la temperatura de hibridación está por debajo de la temperatura crítica (Tc) y por encima de la temperatura de hibridación del cebador;

c. incrementar dicha mezcla de reacción de amplificación hasta una temperatura crítica (Tc) que está por debajo de la Tm de dicho dúplex de secuencia de referencia, para permitir la desnaturalización preferente de dichos dúplex de la etapa (b) para formar hebras diana y de referencia desnaturalizadas;

d. reducir la temperatura de la mezcla de reacción hasta una temperatura de hibridación del cebador para permitir que dicho par de cebadores se hibride a dichas hebras diana y de referencia; y

e. alargar dicho par de cebadores para enriquecer dicha secuencia diana con respecto a dicha secuencia de referencia;

en el que el método se repite durante dos o más ciclos.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2008/009248.

Solicitante: DANA-FARBER CANCER INSTITUTE.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 44 BINNEY STREET BOSTON, MA 02155 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: MAKRIGIORGOS,GERASSIMOS.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)

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Fragmento de la descripción:

Enriquecimiento de una secuencia diana ANTECEDENTES

Una situación habitualmente encontrada en análisis genético implica la necesidad de identificar un porcentaje bajo de secuencias de ADN variantes ("secuencias diana") en presencia de un gran exceso de secuencias no variantes ("secuencias de referencia"). Los ejemplos de tales situaciones incluyen: (a) la identificación y secuenciación de unos pocos alelos mutados en presencia de un gran exceso de alelos normales; (b) la identificación de unos pocos alelos metilados en presencia de un gran exceso de alelos no metilados (o viceversa) en análisis epigenético; (c) la identificación y genotipado de unas pocas secuencias de ADN fetales que circulan en la sangre de la madre, en la que también está presente un gran exceso de secuencias de ADN de la madre; y (d) la identificación de ADN circulante de tumores en sangre de pacientes con cáncer (o personas que se sospecha que tienen cáncer) en presencia de un gran exceso de alelos de tipo salvaje.

Aunque se han descrito recientemente métodos de identificación de alto rendimiento para mutaciones de línea germinal o somáticas de alto predominio (Thomas, R.K., et al. (2007) Nat Genet, 39, 347-351; Chou, L.S., et al. (2005) Am J Clin Pathol, 124; 330-338; Thomas, R.K., et al. (2006) Nat Med, 12; 852-855), todavía sigue siendo problemática la detección de mutaciones somáticas de bajo predominio en tumores con heterogeneidad, contaminación estrómica o en fluidos corporales. Y además, la significancia clínica de la identificación de estas mutaciones es importante en varias situaciones. Por ejemplo: (a) en adenocarcinoma pulmonar, las mutaciones de EGFR de bajo nivel que no se pueden identificar mediante secuenciación normal pueden conferir respuesta positiva a inhibidores de tirosina cinasas (Paez, J.G.,. et al. (2004) Science, 304; 1497-1500.) o resistencia a fármacos (Janne, P.A., et al. (2006) Clin Cáncer Res, 12; 751-758), (b) las mutaciones en plasma útiles como blomarcadores para la detección temprana (Diehl, F., et al. (2005) Proc Nati Acad Sci USA, 102; 16368-16373) o respuesta tumoral al tratamiento (Kimura, T., et al. (2004) Ann N Y Acad Sci, 1022; 55-60) no se pueden secuenclar usando métodos convencionales; y (c) las mutaciones en tumores con contaminación estrómica frecuente, tales como pancreáticos o de próstata, se pueden "enmascarar" por la presencia de alelos de tipo salvaje, requiriendo así microsección laboriosa o perdiendo mutaciones en general.

El documento WO 03/072809 (véanse los ejemplos 1 y 2) describe protocolos de PCR que usan una temperatura de desnaturalización de 95°C que provocará la desnaturalización tanto de la secuencia diana como de la de referencia. Después, la temperatura se disminuye hasta primeramente 58°C, seguido de 72°C. Subsiguientemente, la temperatura se incrementa hasta una temperatura entre la Tm de la secuencia diana y de la secuencia de referencia. En las siguientes etapas, se deja que los cebadores se unan a la secuencia diana y se extiendan. Las secuencias metiladas de forma diferencial se pueden enriquecer durante la amplificación.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente Invención se refiere a métodos para enriquecer alelos poco abundantes procedentes de una muestra, como se define en las reivindicaciones.

El método se basa en parte en un protocolo de amplificación de ácidos nucleicos modificado que incluye incubar la mezcla de reacción a una temperatura de desnaturalización crítica o "Te". Empleando la presente invención, se mejora enormemente los límites de detección actuales de todas las tecnologías a base de PCR.

La "temperatura crítica" o "Te" se refiere a una temperatura por debajo de la temperatura de fusión "Tm" de la secuencia de referencia. En algunas realizaciones, la Te está por debajo de la Tm tanto de la secuencia de referencia como de la secuencia diana. La temperatura crítica aprovecha la menor Tm de la secuencia diana bicatenaria o del dúplex de ADN bicatenarlo hlbrldado de forma cruzada entre la diana y la referencia para desnaturalizar preferentemente estos dúplex con respecto a los homodúplex de referencla/referencia. Cuando la secuencia diana y la secuencia de referencia se hibridan de forma cruzada, las diferencias pequeñas de secuencia de uno o más mal apareamientos de un solo nucleótldo en cualquier parte a lo largo de una secuencia de ADN bicatenario corta (por ejemplo, <200 pb) generarán un cambio pequeño pero predecible en la temperatura de fusión (Tm) para esa secuencia (Lipsky, R.H., et al. (2001) Clin Chem, 47, 635-644; Llew, M., et al. (2004) Clin Chem, 50, 1156-1164). Se contemplan cambios de la temperatura de fusión de 0,1-20°C, dependiendo del contexto y posición exactos del mal apareamiento de la secuencia.

La temperatura de desnaturalización crítica (Te) es la temperatura por debajo de la cual la eficiencia de la PCR cae abruptamente para una secuencia de ácidos nucleicos de referencia. Por ejemplo, una secuencia de p53 de 167 pb se amplifica bien si la temperatura de desnaturalización de la PCR se fija a 87°C, se amplifica de forma modesta a 86,5°C, y no produce producto detectable si la desnaturalización de la PCR se fija a 86°C o menos. Por lo tanto, en este ejemplo, Tc~ 86,5°C.

En un primer aspecto, la invención se refiere a un método para enriquecer una secuencia diana en una muestra de ácido nucleico que se sospecha que tiene secuencias diana y de referencia. El método incluye someter la mezcla de reacción de amplificación a una primera temperatura de desnaturalización que está por encima de la temperatura de

fusión "Tm" de una secuencia de referencia. A continuación, la temperatura de la mezcla de reacción de amplificación se disminuye, permitiendo que las secuencias diana y secuencias de referencia monocatenarias se hibriden para formar moléculas bicatenarias. De este modo, la reacción incluye homodúplex de hibridación de diana-diana, referencia-referencia, y heterodúplex de hebras de diana-referencia. Por definición, un heterodúplex es un dúplex emparejado de forma imperfecta que no obstante contiene suficiente homología entre las hebras para mantener una forma de dúplex en la mezcla de reacción. Por definición, un homodúplex es un dúplex perfectamente apareado. La temperatura de la mezcla de reacción se incrementa entonces hasta la Te, dando como resultado la desnaturalización preferente de los dúplex de hibridación de secuencias diana-referencia. La Te o temperatura crítica está por debajo de la Tm de la secuencia de referencia, y se puede determinar mediante los métodos descritos aquí. A la Te, los dúplex de secuencia diana-referencia (y los dúplex de secuencia diana-diana solamente si tienen una Tm menor que la secuencia de referencia) están sustancialmente desnaturalizados, mientras que los dúplex de diana-diana (si tienen una Tm igual o mayor que la Tm de la secuencia de referencia) y los dúplex de secuencia de referencia-referencia están sustancialmente no desnaturalizados. ''Sustancialmente" significa al menos 60%, preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 80%, incluso más preferiblemente al menos 90%, y lo más preferible al menos 98% en una forma desnaturalizada o no desnaturalizada dada. Tras la desnaturalización preferente de los dúplex de diana-referencia y dúplex de diana-diana (aquellos que tienen una Tm menor que la secuencia de referencia), se aplica una temperatura reducida a la mezcla de reacción para permitir que un par de cebadores se hibride a la secuencia diana. Los cebadores hibridados se alargan entonces, enriqueciendo así la secuencia diana con respecto a la secuencia de referencia en la muestra.

Se describe otro método para enriquecer una secuencia diana. En este método, una muestra de ácido nucleico sospechosa... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para enriquecer una secuencia diana en una mezcla de reacción, comprendiendo dicho método:

a. someter una mezcla de reacción sospechosa de tener un dúplex de secuencia diana y un dúplex de secuencia de referencia a una primera temperatura de desnaturalización que está por encima de la temperatura de fusión (Tm) del dúplex de la secuencia de referencia y del dúplex de la secuencia diana, para permitir la desnaturalización de dicho dúplex de secuencia diana y de dicho dúplex de secuencia de referencia, en el que dicho dúplex de secuencia diana comprende una o más inserciones, supresiones o alteraciones y difiere en al menos un nucleótido de dicho dúplex de secuencia de referencia, y en el que dicha secuencia diana es al menos 50% homologa a dicho dúplex de secuencia de referencia y es amplificable por el mismo par de cebadores que dicho dúplex de secuencia de referencia, y en el que la secuencia diana es menos predominante en la mezcla de reacción que la secuencia de referencia;

b. reducir la temperatura de la mezcla de reacción hasta una temperatura de hibridación para permitir la formación de dúplex de hebra diana/hebra de referencia y evitar la unión de dicho par de cebadores a las hebras diana y de referencia desnaturalizadas en la mezcla de reacción, en el que la temperatura de hibridación está por debajo de la temperatura critica (Te) y por encima de la temperatura de hibridación del cebador;

c. incrementar dicha mezcla de reacción de amplificación hasta una temperatura crítica (Te) que está por debajo de la Tm de dicho dúplex de secuencia de referencia, para permitir la desnaturalización preferente de dichos dúplex de la etapa (b) para formar hebras diana y de referencia desnaturalizadas;

d. reducir la temperatura de la mezcla de reacción hasta una temperatura de hibridación del cebador para permitir que dicho par de cebadores se hibride a dichas hebras diana y de referencia; y

e. alargar dicho par de cebadores para enriquecer dicha secuencia diana con respecto a dicha secuencia de

referencia;

en el que el método se repite durante dos o más ciclos.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dichas secuencia diana y de referencia se amplifican en primer lugar sometiendo la mezcla de reacción a PCR.

3. El método de la reivindicación 1, en el que dicha secuencia diana es un alelo mutante que difiere de la secuencia de referencia en entre 1 y 10 nucleótidos.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que:

(i) dichas secuencias diana y de referencia comprenden 25 a 500 bases, y/o

(ii) dicha Te está 0,3°C a 5°C por debajo de la Tm de dicha secuencia de referencia, y/o

(iii) dicha Te está por debajo de la Tm de la secuencia diana, y/o

(iv) dicho método se repite entre 5 y 40 ciclos, y/o

(v) dicho método se repite entre 10 y 30 ciclos.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además la etapa de analizar dicha mezcla de reacción con secuencia diana enriquecida

en el que dicho análisis usa opcionalmente uno o más de los métodos seleccionados del grupo que consiste en: MALDI-TOF, fusión de HR, secuenciación didesoxi, secuenciación de una sola molécula, pirosecuenciación, SSCP, RFLP, dHPLC, PCR digital y PCR cuantitativa.

6. El método de la reivindicación 1, en el que dicha Te se aplica entre 1 segundo y 5 minutos.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha secuencia diana está metilada diferentemente de la secuencia de referencia, y, antes de implementar el método de la reivindicación 1 en la mezcla de reacción, la mezcla de reacción se trata opcionalmente con bisulfito de sodio.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha mezcla de reacción contiene un colorante de detección de ácido nucleico, y se lleva a cabo opcionalmente en un dispositivo de PCR en tiempo real.

9. El método de la reivindicación 1, llevado a cabo en condiciones de reacción en tiempo real utilizando un agente de detección de ácido nucleico.

10. El método de la reivindicación 1, en el que dicho método se usa para enriquecer dos o más secuencias diana diferentes, y dicho método comprende además uno o más pares adicionales de cebadores específicos para dichas secuencias diana.

11. El método de la reivindicación 1, en el que dicho par de cebadores tiene una temperatura de fusión que está por 5 debajo de la temperatura aplicada en la etapa (b), opcionalmente al menos 5°C por debajo de la temperatura en la

etapa (b).

12. El método de la reivindicación 1, en el que la mezcla de reacción incluye un ácido nucleico modificado.

13. Un método para enriquecer una secuencia diana como se cita en la reivindicación 1, que comprende además: repetir las etapas b) y c) más de una vez por ciclo antes de ejecutar la etapa d).

10 14. El método de la reivindicación 13, en el que la secuencia diana es al menos 70% homologa a la secuencia de

referencia, y preferiblemente al menos 80% homologa a la secuencia de referencia.

15. Un medio legible por ordenador que comprende instrucciones de programa adaptadas para llevar a cabo el método de la reivindicación 1.