Enlace covalente reversible de moléculas funcionales.

Uso de un compuesto de fórmula (Ia) como reactivo para enlazar un compuesto de fórmula R1-H que comprende una primera fracción funcional F1, a una segunda fracción funcional de fórmula F2 **Fórmula**

en donde:

- X y X' cada una representan oxígeno;

- Y es un grupo saliente electrófilo;

- R3 y R3' juntos forman un grupo de fórmula -N

(R33'), en donde R33, representa un átomo de hidrógeno o un grupo de fórmula Y, Nu, -L(Z)n o IG;

- R2 representa un átomo de hidrógeno o un grupo de fórmula Y, Nu, -L(Z)n o IG;

- cada grupo de fórmula Y es el mismo o diferente y representa un grupo saliente electrófilo;

- cada grupo de fórmula Nu es el mismo o diferente y representa un nucleófilo seleccionado de -OH, -SH, - NH2 y -NH(alquilo C1-6);

- cada grupo de fórmula L es el mismo o diferente y representa un grupo conector;

- cada grupo de fórmula Z es el mismo o diferente y representa un grupo reactivo unido a un grupo de fórmula L que es capaz de reaccionar con un compuesto que contienen una segunda fracción funcional, según se define en la reivindicación 1, de tal manera que dicha segunda fracción funcional se enlaza a dicho grupo de fórmula L;

- n es 1, 2 o 3; y

- cada grupo de fórmula IG es el mismo o diferente y representa una fracción que es un grupo alquilo C1-20, un grupo C2-20 alquenilo o un grupo C2-20 alquinilo, que es sustituido o no sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados de átomos de halógeno y grupos de ácido sulfónico, y en los que (a) 0, 1 o 2 átomos de carbono se reemplazan por grupos seleccionados de arileno C6-10, heteroarileno de 5- a 10- miembros, carbociclileno C3-7 y grupos heterociclileno de 5- a 10- miembros, y (b) 0, 1 o 2 grupos -CH2- se reemplazan por grupos seleccionados de grupos -O-, -S-, -S-S-, -C(O)- y -N(alquilo C1-6)-, en donde:

(i) dichos grupos arileno, heteroarileno, carbociclileno y heterociclileno son no sustituidos o sustituidos por uno o más sustituyentes seleccionados de átomos de halógeno y grupos alquilo C1- 6, alcoxi C1-6, alquiltiol C1-6, -N(alquilo C1-6) (alquilo C1-6), nitro y ácido sulfónico; y

(ii) 0, 1 o 2 átomos de carbono en dichos grupos carbociclileno y heterociclileno se reemplazan por grupos -C(O)-; y

- o bien:

- la primera fracción funcional o la segunda fracción funcional es una proteína que es un anticuerpo o fragmento de un anticuerpo que es capaz de unirse a un antígeno específico a través de un epítopo en el antígeno, y la otra de entre la primera fracción funcional y la segunda fracción funcional es un fármaco, o bien

- la primera fracción funcional o la segunda fracción funcional es una fracción polimérica seleccionada a partir de péptidos, proteínas, polisacáridos, poliéteres, poliaminoácidos, alcoholes polivinílicos, polivinilpirrolidonas, ácido poli(met)acrílico y derivados del mismo, poliuretanos y polifosfacenos, y la otra de entre la primera fracción funcional y la segunda fracción funcional es un fármaco;

en donde el grupo R1 se enlaza al compuesto de la fórmula (Ia) a través del ataque nucleófilo del primer grupo SH en el compuesto de fórmula R1-H en la posición 2 del compuesto de la fórmula (Ia), de tal manera que el grupo Y en la posición 2 es reemplazado por el grupo R1.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E12189317.

Solicitante: UCL BUSINESS PLC.

Nacionalidad solicitante: Reino Unido.

Dirección: The Network Building, 97 Tottenham Court Road London, W1T 4TP REINO UNIDO.

Inventor/es: SMITH, MARK, CADDICK,STEPHEN, BAKER,JAMES.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/543 (con un soporte insoluble para la inmovilización de compuestos inmunoquímicos)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/58 (en los que intervienen sustancias marcadas (G01N 33/53 tiene prioridad))
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/533 (con un marcador fluorescente)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/535 (con un marcador enzimático)

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Fragmento de la descripción:

Enlace covalente reversible de moléculas funcionales Introducción Es bien sabido que puede resultar deseable unir dos o más moléculas entre sí, que posean cada una propiedades específicas. De esta manera, se hace posible generar nuevas moléculas, conocidas como conjugados, que tienen 5 las características combinadas de sus componentes. Esta técnica proporciona un medio atractivo para modificar las propiedades existentes de moléculas funcionalmente útiles, o para añadir aspectos funcionales completamente nuevos a tales moléculas, de una manera controlada y de aplicación amplia.

La posibilidad de conjugar entre sí dos o más compuestos funcionales ha potenciado un interés, particularmente alto, en el campo de la biotecnología. La conjugación de biomoléculas tales como proteínas o moléculas 10 biológicamente activas, tales como fármacos, a un compuesto funcional secundario ha sido utilizada en una extensa variedad de aplicaciones, incluyendo técnicas de detección, estudios de proteómica, métodos de purificación y en el diagnóstico y tratamiento de una enfermedad. Es tal la omnipresencia de estas metodologías que actualmente se encuentran disponibles manuales estándar dedicados por completo a este tema. Un manual de este tipo es "Bioconjugate Techniques" (Greg T. Hermanson, Academic Press Inc., 1996) , cuyo contenido se incorpora a la 15 presente patente a modo de referencia en su totalidad.

Los métodos para unir entre sí diversos compuestos funcionales se focalizan, habitualmente, en el uso de moléculas entrecruzadoras pequeñas. Un reactivo de unión de este tipo contiene al menos dos grupos funcionales. Cada uno de estos grupos funcionales es capaz de reaccionar con una molécula funcional para generar una molécula conjugada entrecruzada final. 20

Una amplia variedad de grupos funcionales para reactivos entrecruzadores han sido desarrollados para reaccionar con grupos funcionales diana específicos presentes en las moléculas funcionales que van a ser unidas entre sí. Por ejemplo, entrecruzadores que contienen grupos éster activados tales como los ésteres de N-hidroxisuccinimida han sido utilizados durante mucho tiempo para reaccionar con fracciones funcionales que contienen grupos amina reactivos, tales como proteínas. Los entrecruzadores que contienen hidrazida (por ejemplo, dihidrazida de ácido 25 adípico) , han sido utilizados para funcionalizar moléculas funcionales que contienen carboxilo tales como glicoproteínas.

El entrecruzamiento de una molécula funcional con otra puede además lograrse estableciendo como diana un grupo tiol reactivo en una molécula funcional. Este enfoque puede resultar particularmente atractivo cuando la molécula funcional en cuestión es un péptido o una proteína. Una razón para ello está basada en que los residuos de cisteína 30 que contienen tiol habitualmente tienen una baja presencia natural en las proteínas, abriendo, por tanto, la posibilidad a procedimientos de modificación sumamente selectivos. Las técnicas estándar de mutagénesis dirigida también permiten la fácil inserción de un residuo de cisteína en una localización específica en una proteína, generando así un grupo tiol reactivo, que puede entonces ser modificado por una fracción funcional mediante un entrecruzador adecuado. 35

Diversos compuestos han sido utilizados como reactivos de unión capaces de reaccionar con un grupo tiol. Estos reactivos incluyen derivados de eteno 1, 2-dicarbonílico, compuestos -halo carbonilo y tiosulfonatos. De estos, los derivados de eteno 1, 2-dicarbonílico, tales como las maleimidas, son reconocidos por ser los reactivos más selectivos para la reacción con un tiol, en particular con una fracción de cisteína. El grupo tiol en una molécula funcional que contiene tiol ("R-SH") reacciona con la maleimida para producir un enlace tioéter tal como sigue a 40 continuación:

La fracción de amida reactiva en la maleimida está disponible para reaccionar con un compuesto funcional adicional, para producir un conjugado en el que la molécula funcional que contiene tiol se une a una fracción funcional adicional. Los reactivos de maleimida son por lo tanto útiles para conjugar proteínas que contienen cisteína con 45

varias moléculas secundarias (por ejemplo, un fluoróforo, biotina, un polietilenglicol o un carbohidrato) . Estas moléculas secundarias están a menudo unidas al anillo de maleimida mediante una especie químicamente inerte de conector.

Desafortunadamente, sin embargo, esta aproximación a la generación de conjugados presenta varias desventajas. Por ejemplo, habitualmente la manipulación química del producto de reacción únicamente es posible en la fracción 5 de amida. Esto significa que puede ser difícil añadir más de un grupo funcional adicional al compuesto que contiene tiol con un único conector de maleimida. Además, el enlace tioéter formado entre la molécula funcional que contiene tiol y el entrecruzador de maleimida es irreversible. Por consiguiente, la derivatización efectuada mediante el entrecruzador es permanente y no es posible regenerar el reactivo nativo que contiene tiol.

La irreversibilidad de la reacción de derivatización conocida entre el reactivo que contiene tiol y un entrecruzador 10 puede poner serias limitaciones en lo referente a su utilidad práctica en áreas tales como purificación de proteínas, análisis proteómico cuantitativo, en la hibridación de sitios de unión, en posibilitar estudios estructurales y en la administración de fármacos. Por ejemplo, en un método de purificación que implique la generación de un conjugado entre una proteína que contenga tiol y una etiqueta de afinidad (tal como la biotina) , no sería posible regenerar la proteína nativa después de la purificación mediante el desprendimiento de la maleimida. La incapacidad para 15 regenerar los reactivos que contienen tiol puede ser también un problema serio cuando se llevan a cabo procedimientos que implican proteínas que son difíciles de expresar, tales como muchos GPCRs (receptores acoplados a proteínas G) . La irreversibilidad del proceso de entrecruzamiento también impide la explotación de la metodología de bioconjugados en áreas donde la labilidad del enlace entre el entrecruzador y la proteína es importante (por ejemplo, donde la entidad de entrecruzamiento se diseña para bloquear la actividad de una enzima 20 durante únicamente un periodo limitado y preferiblemente controlable) .

La presente invención se basa en el sorprendente hallazgo de que es ventajoso incorporar un grupo saliente electrófilo al enlace doble C=C de un conocido reactivo de entrecruzamiento de eteno 1, 2-dicarbonílico. Esa modificación química permite que una fracción funcional que contenga tiol, tal como un péptido o una proteína, se enlace al reactivo de entrecruzamiento a la vez que conserva el enlace doble C=C. Esto presenta las siguientes 25 ventajas:

- La reacción entre el entrecruzador y el compuesto tiol puede ser realizada a menudo rápidamente y con un elevado rendimiento, utilizando únicamente una cantidad sustancialmente estequiométrica del entrecruzador.

- El enlace tioéter entre el entrecruzador y la molécula que contiene tiol es fácilmente reversible, y en particular puede escindirse de forma controlada en un momento elegido por el experto en el arte. 30

- El mantenimiento del enlace doble en el compuesto obtenido después de enlazar la fracción que contiene tiol al entrecruzador, constituye un sitio de reacción para el enlace a compuestos funcionales adicionales. Puede por lo tanto resultar más sencillo añadir fracciones funcionales al conjugado.

La nueva metodología de entrecruzamiento se puede aplicar fácilmente a través de todo el espectro completo de métodos conocidos... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Uso de un compuesto de fórmula (Ia) como reactivo para enlazar un compuesto de fórmula R1-H que comprende una primera fracción funcional F1, a una segunda fracción funcional de fórmula F2

en donde: 5

- X y X cada una representan oxígeno;

- Y es un grupo saliente electrófilo;

- R3 y R3 juntos forman un grupo de fórmula -N (R33) , en donde R33, representa un átomo de hidrógeno o un grupo de fórmula Y, Nu, -L (Z) n o IG;

- R2 representa un átomo de hidrógeno o un grupo de fórmula Y, Nu, -L (Z) n o IG; 10

- cada grupo de fórmula Y es el mismo o diferente y representa un grupo saliente electrófilo;

- cada grupo de fórmula Nu es el mismo o diferente y representa un nucleófilo seleccionado de -OH, -SH, -NH2 y -NH (alquilo C1-6) ;

- cada grupo de fórmula L es el mismo o diferente y representa un grupo conector;

- cada grupo de fórmula Z es el mismo o diferente y representa un grupo reactivo unido a un grupo de 15 fórmula L que es capaz de reaccionar con un compuesto que contienen una segunda fracción funcional, según se define en la reivindicación 1, de tal manera que dicha segunda fracción funcional se enlaza a dicho grupo de fórmula L;

- n es 1, 2 o 3; y - cada grupo de fórmula IG es el mismo o diferente y representa una fracción que es un grupo alquilo C1-20, 20 un grupo C2-20 alquenilo o un grupo C2-20 alquinilo, que es sustituido o no sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados de átomos de halógeno y grupos de ácido sulfónico, y en los que (a) 0, 1 o 2 átomos de carbono se reemplazan por grupos seleccionados de arileno C6-10, heteroarileno de 5- a 10- miembros, carbociclileno C3-7 y grupos heterociclileno de 5- a 10- miembros, y (b) 0, 1 o 2 grupos -CH2- se reemplazan por grupos seleccionados de grupos -O-, -S-, -S-S-, -C (O) - y -N (alquilo C1-6) -, en donde: 25

(i) dichos grupos arileno, heteroarileno, carbociclileno y heterociclileno son no sustituidos o sustituidos por uno o más sustituyentes seleccionados de átomos de halógeno y grupos alquilo C1-6, alcoxi C1-6, alquiltiol C1-6, -N (alquilo C1-6) (alquilo C1-6) , nitro y ácido sulfónico; y (ii) 0, 1 o 2 átomos de carbono en dichos grupos carbociclileno y heterociclileno se reemplazan por grupos -C (O) -; y 30

- o bien:

- la primera fracción funcional o la segunda fracción funcional es una proteína que es un anticuerpo o fragmento de un anticuerpo que es capaz de unirse a un antígeno específico a través de un epítopo en el antígeno, y la otra de entre la primera fracción funcional y la segunda fracción funcional es un fármaco, o bien 35

- la primera fracción funcional o la segunda fracción funcional es una fracción polimérica seleccionada a partir de péptidos, proteínas, polisacáridos, poliéteres, poliaminoácidos, alcoholes polivinílicos, polivinilpirrolidonas, ácido poli (met) acrílico y derivados del mismo, poliuretanos y polifosfacenos, y la otra de entre la primera fracción funcional y la segunda fracción funcional es un fármaco;

en donde el grupo R1 se enlaza al compuesto de la fórmula (Ia) a través del ataque nucleófilo del primer grupo SH en 5 el compuesto de fórmula R1-H en la posición 2 del compuesto de la fórmula (Ia) , de tal manera que el grupo Y en la posición 2 es reemplazado por el grupo R1.

2. Uso según la reivindicación 1, en donde:

(A) :

Y es un átomo de halógeno o un triflato, tosilato, mesilato, N-hidroxisuccinimidilo, N-10 hidroxisulfosuccinimidilo, alquiltiol C1-6, heterocicliltiol de 5- a 10- miembros, ariltiol C6-10, carbocicliltiol C3-7, -OC (O) CH3, -OC (O) CF3, feniloxi, grupo -NRxRyRz + o - PRxRyRz +, en el que Rx, Ry y Rz son los mismos o diferentes y se seleccionan de átomos de hidrógeno y grupos alquilo C1-6 y fenilo; y/o (B) :

L representa una fracción que es un grupo alquileno C1-20, un grupo alquenileno C2-20 o un grupo alquinileno 15 C2-20, que es no sustituido o sustituido por uno o más sustituyentes seleccionados de átomos de halógeno y grupos de ácido sulfónico, y en el que (a) 0, 1 ó 2 átomos de carbono son reemplazados por grupos seleccionados de grupos arileno C6-10, heteroarileno de 5 a 10- miembros, carbociclileno C3-7 y heterociclileno de 5- a 10- miembros, y (b) 0, 1 ó 2 grupos -CH2- son reemplazados por grupos seleccionados de grupos -O-, -S-, S-S, -C (O) - y 20

- grupos N (alquilo C1-6) -, en donde:

(i) dichos grupos arileno, heteroarileno, carbociclileno y heterociclileno son no sustituidos o sustituidos por uno o más sustituyentes seleccionados de átomos de halógeno y grupos alquilo C1-6, alcoxi C1-6, alquiltiol C1-6, -N (alquilo C1-6) (alquilo C1-6) , nitro y ácido sulfónico; y (ii) 0, 1 o 2 átomos de carbono en dichos grupos carbociclileno y heterociclileno se reemplazan por 25 grupos -C (O) -; y/o (C) :

Z representa:

(a) un grupo de fórmula -LG, -C (O) -LG, -C (S) -LG o -C (NH) -LG en donde LG es un grupo saliente electrófilo;

(b) un nucleófilo Nu seleccionado de grupos -OH, -SH, -NH2, -NH (alquilo C1-6) y -C (O) NHNH2; 30

(c) una fracción cíclica Cyc, que es capaz de una reacción electrófila de apertura de anillo con un nucleófilo;

(d) un grupo de fórmula -S (O2) (Hal) , en donde Hal es un átomo de halógeno;

(e) un grupo de fórmula -N=C=O o -N=C=S;

(f) un grupo de fórmula -S-S (IG) en donde IG representa un grupo de fórmula IG, según se define en la reivindicación 2; 35

(g) un grupo AH, que es un grupo arilo C6-10 que es sustituido por uno o más átomos de halógenos;

(h) un grupo fotoreactivo que es capaz de activarse por la exposición a la luz ultravioleta;

(i) un grupo de fórmula -C (O) H o -C (O) (alquilo C1-6) ;

(j) un grupo maleimido;

(k) un grupo de fórmula -C (O) CHCH2;

(l) un grupo de fórmula -C (O) C (N2) H o -PhN2+, donde Ph representa un grupo fenilo; o (m) un grupo epóxido; y/o (D) :

IG representa una fracción que es un grupo alquilo C1-6, un grupo alquenilo C2-6 o un grupo alquinilo C2-6, en 5 el que (a) 0 o 1 átomo de carbono es reemplazado por un grupo seleccionado de grupos fenileno, heteroarileno de 5- a 6- miembros, carbociclileno C5-6 y heterociclileno de 5- a 6- miembros, en donde dichos grupos fenileno, heteroarileno, carbociclileno y heterociclileno son no sustituidos o sustituidos por uno o dos sustituyentes seleccionados de átomos de halógeno y grupos alquilo C1-4 y alcoxi C1-4, y (b) 0, 1 o 2 grupos -CH2- son reemplazados por grupos seleccionados de grupos -O-, -S- y-C (O) -; y/o 10

(E) :

n es 1.

3. Uso según la reivindicación 1 o 2, en donde el compuesto de fórmula (Ia) es un compuesto de fórmula (Ib)

en donde: 15

- X y X cada uno representa un átomo de oxígeno;

- R33 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C1-6;

- Y representa un átomo de halógeno; y - R2 representa un átomo de hidrógeno o halógeno o un grupo alquilo C1-6.

4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde: 20

- R1 es un grupo de fórmula -F1;

- F1 es un péptido o proteína que comprende al menos un primer residuo de cisteína; y - el grupo R1 se enlaza al compuesto de fórmula (Ia) mediante ataque nucleófilo del grupo tiol de dicho primer residuo de cisteína en la posición 2 del compuesto de fórmula (Ia) , de tal manera que el grupo Y es reemplazado por el grupo tiol en el primer residuo de cisteína en el grupo R1; 25

y en donde opcionalmente:

- R2 es un grupo de fórmula Y;

- R1 además comprende al menos un segundo residuo de cisteína; y - el grupo R1 se enlaza adicionalmente al compuesto de fórmula (Ia) mediante ataque nucleófilo del grupo tiol de dicho residuo de cisteína en la posición 3 de la fracción de fórmula (Ia) , de tal manera que el grupo R2 es reemplazado por el grupo tiol en el segundo residuo de cisteína en el grupo R1.

5. Proceso para producir un conjugado, cuyo proceso comprende (i) hacer reaccionar un compuesto de la fórmula (Ia) con un compuesto de fórmula R1-H, produciendo de 5 este modo un compuesto de la fórmula (II)

(ii) posteriormente enlazando una fracción de fórmula F2 a dicho compuesto de la fórmula (II) ;

en donde la etapa (i) implica unir el grupo R1 a través de un ataque nucleófilo del primer grupo SH en el compuesto de fórmula R1-H en la posición 2 del compuesto de la fórmula (Ia) , de tal manera que el grupo Y 10 en la posición 2 es reemplazado por el grupo R1, y en donde X, X, Y, R1, R2, R3, R3 y F2 son todos tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Proceso según la reivindicación 5, en donde:

(A) : 15

el proceso comprende enlazar F2 al compuesto de fórmula (II) a través de una reacción electrófila de adición de F2 a través del enlace doble de carbono-carbono entre la posición 2 y la posición 3 de la fórmula (II) ; o (B) :

R33 representa un átomo de hidrógeno o un grupo de fórmula Y, Nu o -L (Z) n y el proceso comprende 20 enlazar F2 al compuesto de fórmula (II) a través de una reacción entre F2 y (i) el átomo de nitrógeno de la fracción de fórmula -N (R33) o (ii) dicho grupo de fórmula Y, Nu o -L (Z) n; o (C) :

R2 representa un grupo de fórmula Y, Nu o -L (Z) n, y el proceso comprende enlazar F2 al compuesto de fórmula (II) mediante una reacción entre F2 y dicho grupo de fórmula Y, Nu o -L (Z) n. 25

7. Proceso para producir un conjugado, cuyo proceso comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula R1-H con un compuesto de fórmula (IIa)

en donde:

- R3a y R3a juntos forman un grupo de fórmula -N (R33a) , en donde R33a representa un grupo de fórmula R33, o un grupo de fórmula F2 o -L (F2) m (Z) n-m;

- R2a representa un grupo de fórmula R2 o un grupo de fórmula F2 o -L (F2) m (Z) n-m;

- m es un número entero que tiene un valor de cero a n; 5

- - el compuesto de formula (IIa) comprende al menos un grupo de formula F2;

- F2 es según se define en la reivindicación 1;

- X, X, R3, R3, R33 R2, L, Z y n son todos según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3

- R1 es según se define en la reivindicación 1 o 4; y - el proceso implica unir el grupo R1 a través de ataque nucleófilo del primer grupo SH en el compuesto de 10 fórmula R1-H en la posición 2 del compuesto de fórmula (IIa) , de tal manera que el grupo Y en la posición 2 es reemplazado por el grupo R1.

8. Proceso que comprende (i) proporcionar un compuesto de fórmula (III) o (IIIa) ; y (ii) escindir el enlace entre el grupo R1 y el átomo de carbono en la posición 2 del compuesto de fórmula (III) 15 o (IIIa)

en donde - R3a y R3a juntos forman un grupo de fórmula -N (R33a) , en donde R33a representa un grupo de fórmula R33, 20 o un grupo de fórmula F2 o -L (F2) m (Z) n-m;

- R2a representa un grupo de fórmula R2 o un grupo de fórmula F2 o -L (F2) m (Z) n-m;

- m es un número entero que tiene un valor de cero a n;

- R1 es según se define en la reivindicación 1 o 4;

- F2 es según se define en la reivindicación 1;

- X, X, R3, R3, R33 R2, L, Z y n son todos según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3;

y en donde cuando el proceso implica el compuesto de la fórmula (IIIa) :

- R1 del compuesto de la fórmula (IIIa) comprende al menos un primer grupo tiol y un segundo grupo tiol, donde dicho primer grupo tiol está unido a la posición 2 en el compuesto de la fórmula (IIIa) y donde el 5 segundo grupo tiol está unido a la posición 3 en el compuesto de la fórmula (IIIa) ; y - la etapa (ii) además implica escindir el enlace entre el grupo R1 y el átomo de carbono en la posición 3 de la fracción de la fórmula (IIIa) .

9. Compuesto, cuyo compuesto es:

(A) un compuesto de fórmula (IIa) según se define en la reivindicación 7; o 10

(B) un compuesto de fórmula (III) según se define en la reivindicación 8, que comprende al menos un grupo de fórmula F2 y en el que R2a no es un átomo de hidrógeno.

10. Compuesto de fórmula (IIIa) según se define en la reivindicación 8.

11. Compuesto según la reivindicación 10, que comprende al menos un grupo de fórmula F2.

12. Compuesto según la reivindicación 10 u 11, en donde R1 es un péptido o proteína que comprende al menos dos 15 residuos de cisteína, cuyos residuos de cisteína forman preferiblemente un puente disulfuro interno en el péptido o proteína cuando dicho péptido o proteína no está enlazada en el compuesto de fórmula (IIIa) .

13. Compuesto de fórmula (IVa) o (IVb)

en donde 20

- R1 es según se define en la reivindicación 1 o 4;

- X, X, R2a, R3a y R3a son según se define en la reivindicación 8;

- R4 es un átomo de halógeno, un grupo hidroxilo, alcoxi C1-6, tiol, alquiltiol C1-6 o alquilcarboniloxi C1-6, o un grupo de fórmula F2;

- al menos uno de los grupos R2a y R4 comprende un grupo de fórmula F2; y 25

- F2 es según se define en la reivindicación 1.

14. Compuesto según se define en (B) de la reivindicación 9, reivindicación 11 o reivindicación 13, para su uso en un método de tratamiento del organismo humano o animal mediante cirugía o terapia, o método de diagnóstivo practicado en el organismo humano o animal.

15. Proceso según se define en cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde dicho conjugado comprende un 30 anillo de maleimida y dicho proceso adicionalmente comprende efectuar una apertura de anillo de dicho anillo de maleimida.