Electrodo biológico con la enzima hidrogenasa, procedimiento de obtención y sus aplicaciones.

En la presente invención se protegen electrodos biológicos modificados con enzimas hidrogenasas (ánodos) mediante los cuales es posible obtener energía eléctrica del hidrógeno en una configuración típica de pilas de combustible; asimismo, con estos electrodos modificados con hidrogenasa (cátodos) es posible producir hidrógeno a partir de agua en una configuración típica de célula electroquímica. Igualmente se describe los procedimientos de fabricación y sus aplicaciones

Electrodo biológico con la enzima hidrogenasa, procedimiento de obtención y sus aplicaciones.

Sector de la técnica

La presente invención se relaciona con electrodos biológicos para pilas de combustible de hidrógeno como alternativa a otros catalizadores de oxidación de hidrógeno tales como platino y otros metales, y también para la generación de hidrógeno en celdas electrolíticas. Por tanto, se relaciona con la biotecnología, ingeniería genética y más concretamente con el uso de enzimas como biocatalizadores y más en particular como biocatalizadores redox y más en particular con la biotecnología de la producción y utilización de hidrógeno.

Estado de la técnica

Un debate de acuciante actualidad gira en torno al tipo de combustible que se usará en el futuro para sostener la actividad humana, que ha pasado de utilizar sucesivamente y de modo mayoritario la madera, el carbón y luego el petróleo y el gas natural, en un lapso de tiempo relativamente corto. En la actualidad la tendencia es a diversificar las fuentes, con una progresiva utilización del metano, y con la mente puesta en las energías renovables, entre las que el hidrógeno obtenido a partir del agua es considerado por algunos como una fuente "inagotable" de energía, bien que al día de hoy el petróleo sigue siendo la materia prima a partir de la que se obtiene el hidrógeno que consumimos. Junto a la naturaleza del combustible a emplear, se debate el modo más conveniente para su utilización; a este respecto, interesa destacar que en cualquier escenario que se considere, e independientemente del combustible utilizado, se hace una apuesta clara por la implantación de las Pilas de Combustible como uno de los medios más seguro, limpio y eficaz de convertir la energía contenida en esos combustibles en electricidad (M.S. Dreseselhaus and I.L. Thomas, Alternative energy technologies. Nature, 414, 332-337 (2001)). En este contexto cabe resaltar el hecho de que en los últimos años se ha asistido a una intensa investigación en Biopilas de Combustible llamadas así porque en los electrodos de la pila interviene elementos biológicos, enzimas redox o células microbianas en ánodos y en cátodos (G. Tayhas, R. Palmore, and G.M. Whitesides, Microbial and Enzymatic Biofuel Cells in Enzymatic conversion of biomass for fuel production, M.E. Himmel, J.O. Baker and R.P. Overend, eds., American Chemical Society Symposium series, nº 566, ACS, Washington, DC., 271-290, 1994). En una reciente revisión, A. Heller da cuenta del estado de la investigación en el campo de las biopilas de combustible enzimáticas, en las que son mayoría las que utilizan como combustible glucosa y oxígeno. Generalmente se basan en un diseño en el que se conectan electrodos modificados con los enzimas glucosa oxidasa y lacasa en los que, respectivamente, se oxida la glucosa en el ánodo, con la concomitante reducción del oxígeno hasta agua en el cátodo. Hay que tener en cuenta que en estas biopilas de combustible se suelen utilizar mediadores redox (en disolución o en forma de polímeros redox) para transportar electrones entre los centros activos de los respectivos enzimas y los electrodos (A. Heller, Miniature biofuel cells, Phys. Chem. Chem. Phys., 6, 209-216, 2004).

La primera biopila de combustible que utiliza hidrógeno y oxígeno descrita por S. Tsujimura (S. Tsujimura, M. Fujita, H. Tatsumi, K. Kano, T. Ikeda, Bioelectrocatalysis-based dihydrogen/dioxygen fuel cell operating at physiological pH, Phys. Chem. Chem. Phys., 3, 1331-1335, 2001) utiliza células bacterianas de Desulfovibrio vulgaris como catalizador de consumo de hidrógeno en el ánodo; además añade el compuesto metil viológeno como mediador redox entre las bacterias y el electrodo.

Más recientemente se ha publicado una patente (United States Patent Application 20040214053, A1, October 28, 2004, Foreing Application data: Aug 24, 2001, GB, nº 0120698.6) sobre una biopila de combustible biológica, que emplea hidrógeno como combustible, en el que el ánodo está recubierto con la hidrogenasa de tipo Ni-Fe purificada a partir de extractos de la bacteria Allochromatium vinosum. Muy importante, en relación con nuestra patente, es que en esta invención el enzima se deposita por adsorción en presencia de polímeros catiónicos sobre el electrodo de carbón lo que da lugar a electrodos funcionales pero fueron poco estables. Previamente se habían publicado artículos científicos en los que enzimas hidrogenasa de distintos microorganismos se han depositado sobre electrodos mediante diferentes tipos de uniones no covalentes:

(a) Por adsorción en carbón vítreo (glassy carbon), con ó sin adiciones de sulfato de polimixina B (Butt, J. N.; Filipiak, M.; Hagen, W. R. Direct Electrobiochemistry of Megasphaera elsdenii iron hydrogenase: Definition of the enzyme's catalytic operating potential and quantitation of the catalytic behaviour over a continuous potential range. Eur. J. Biochem. 245, 116-122, 1997). En este documento se obtienen corrientes eléctricas en atmósfera de hidrógeno, pero las corrientes no son persistentes lo que atribuyen bien a pérdida de proteína o a una orientación no favorable de los centros redox del enzima respecto a la superficie del electrodo;

(b) por adsorción en grafito pirolítico "edge" con adición de sulfato de polimixina B, (Pershad, H.R., Duff, J.L.D., Heering, H. A., Duin, E. C., Albracht, S.P.J., Armstrong, F.A. Catalytic electron transport in Allochromatium vinosum [Ni-Fe]-hydrogenase: Application of voltametry in detecting redox-active centres and establishing that hydrogen oxydation is very fast even at potentials close to the reversible H⁺/H₂ value Biochemistry, 38, 8992-8999, 1999). Estos autores demuestran que la hidrogenasa de Ni-Fe que estudian, que es muy similar a la utilizada en la presente invención, es extremadamente activa, aun cuando no saben si tiene más de una capa de enzima y no saben la orientación, a diferencia de nosotros que por nuestro método se obtiene una sola monocapa y con las moléculas en la orientación favorable para el intercambio de corriente con el electrodo.

(c) Enzyme electrokinetics: Hydrogen evolution and oxidation by Allochromatium vinosum [Ni-Fe]-hydrogenase. Leger, C.; Jones, A. K.; Roseboom, W.; Albracht, S. P. J.; Armstrong, F. A. Biochemistry. 41, 15736-15746, 2002. En este documento se usa el mismo electrodo que en el trabajo anterior, grafito pirolítico "edge" por adorción.

(d) Direct and electrically wired bioelectrocatalysis by hydrogen from Thiocapsa roseopersicina. Morozov, S. V.; Karyakina, E. E.; Zorin, N. A.; Varfolomeyev, S. D.; Cosnier, S.; Karyakin, A. A. Bioelectrochemistry 55, 169-171, 2002. Aquí se emplea carbón vítreo y filamentos de carbón, por adsorción física.

(e) Inhibition and aerobic kinetics of Desulfovibrio fructosovorans NiFe hydrogenase studied by protein film voltammetry. Leger, C.; Dementin, S.; Bertrand, P.; Rousset, M.; Guigliarelli, B. J. Am. Chem. Soc. 126, 12162-12172, 2004. Aquí se emplean grafito pirolítico "edge" por adsorción física.

(f) Hydrogenases from the hyperthrmophilic bacterium Aquilex aeolicus: electrocatalysis of the hydrogen production/consumption reactions at carbon electrodes. Lojou, E.; Giudici-Orticoni, M. T.; Bianco, P. J. Electroanal. Chem., 577, 79-86, 2005. Se realiza sobre grafito y con enzimas hipertermofílicas, no estudian la estabilidad, pero no hay unión covalente.

(g) Design and characterization of redox enzyme electrodes: new perspectives on established techniques with application to an extremophile hydrogenase. Johnston, W.; Cooney, M. J.; Liaw, B. Y.; Sapra, R.; Adams, M. W. W. Enzyme Microb. Technol., 36, 540-549, 2005. Estos autores depositan un enzima hipertermofílico sobre papel de carbón pirolítico poroso y sobre grafito empaquetado en columna, también por adsorción directa. En todos los casos en que han estudiado la estabilidad de los electrodos las respuestas electrocatalíticas no fueron persistentes y los autores han atribuido esta disminución de la actividad catalítica de los electrodos a la pérdida de enzima hidrogenasa de la superficie del electrodo donde se mantenía a través de interacciones débiles, principalmente de tipo electrostático, o a desplazamiento de la hidrogenasa adsorbida por otras especies de la disolución.

En resumen, en otros trabajos no existen estudios de estabilidad de la enzima y en ninguno de los trabajos publicados, hay inmovilización de enzima hidrogenasa por unión covalente tal como se describe en esta patente...

1. Electrodo biológico caracterizado porque contiene una enzima tipo hidrogenasa, de Ni-Fe o de tipo "sólo Fe", como catalizador de oxidación de hidrógeno, unida covalente a un electrodo de un material conductor de electricidad a través de, respectivamente, residuos carboxílicos ó residuos amino expuestos en su superficie ó introducidos en la superficie de dicho electrodo.

2. Electrodo biológico según la reivindicación 1 caracterizado porque la enzima tipo hidrogenasa es una hidrogenasa aislada de microorganismos activadores de hidrógeno u obtenida mediante ingeniería genética recombinante.

3. Electrodo biológico según la reivindicación 2 caracterizado porque la enzima tipo hidrogenasa es aislada de bacterias activadoras de hidrógeno pertenecientes al siguiente grupo:

4. Electrodo biológico según la reivindicación 2 caracterizado porque la enzima tipo hidrogenasa es aislada de algas, tanto procariotas como eucariotas, que metabolizan hidrógeno, pertenecientes a las siguientes especies: Scenedesmus obliquus, Anabaena cilíndrica y Anabaena variabilis, Anacystis nidulas, Synechocystis sp PCC 6803, Nostoc PCC73102 y Synechococcus PCC6301.

5. Electrodo biológico según la reivindicación 1 caracterizado porque la enzima tipo hidrogenasa es una enzima con actividad de hidrogenasa modificada con motivos de afinidad localizados en lugares específicos de su superficie que permiten su inmovilización orientada sobre el electrodo conductor convenientemente modificado con motivos complementarios de afinidad.

6. Electrodo biológico según la reivindicación 5 caracterizado porque la modificación consiste en un agrupamiento de histidinas.

7. Electrodo biológico según la reivindicación 1 caracterizado porque el electrodo de material conductor pertenece al siguiente grupo: material metálico o material carbonáceo.

8. Electrodo biológico según la reivindicación 7 caracterizado porque el material metálico pertenece al siguiente grupo: oro, cobre, plata o platino.

9. Electrodo biológico según la reivindicación 7 caracterizado porque el material carbonáceo pertenece al siguiente grupo: carbón vítreo, carbón pirolítico "basal", carbón pirolítico borde ("edge"), hilo de carbón, tela de carbón, carbón microporoso, tamices moleculares carbonosos, nanotubos de carbono, nanofibras de carbono.

10. Electrodo biológico según la reivindicación 1 caracterizado porque la enzima tipo hidrogenasa es la enzima aislada de la bacteria Desulfovibrio gigas E.C.1.18.89.1 (la secuencia de aminoácidos del enzima utilizada tiene el código PDB 1H2A de referencia en la base de datos Protein Data Bank) y el electrodo conductor es de oro.

11. Electrodo biológico según la reivindicación 1 caracterizado porque la enzima tipo hidrogenasa es la enzima aislada de la bacteria Desulfovibrio gigas E.C.1.18.89.1 (la secuencia de amonoácidos del enzima utilizada tiene el código PDB 1H2A de referencia en la base de datos Protein Data Bank) y el electrodo conductor es de carbón pirolítico "edge".

12. Electrodo biológico según la reivindicación 1 caracterizado porque está constituido por un electrodo de material carbonáceo modificado con grupos carboxilos que se modifica además con N,N-bis(carboxymetil)-L-lisina que forman complejos del tipo nitrilotriacético con iones Ni, Cu ó Co (estos complejos metálicos poseen afinidad por agrupamientos de histidinas) y una enzima hidrogenasa modificada o mutada que comprende un motivo de histidinas en lugares adecuados de la superficie de la enzima.

13. Procedimiento de obtención del electrodo biológico según las reivindicación 1 caracterizado porque el electrodo conductor es de material carbonáceo y porque comprende las siguientes etapas:

a) modificación del electrodo de carbón por electroreducción de un arilderivado de sales de diazonio en medio aprótico o en medio acuoso ácido, que genera grupos amino primarios,

b) unión covalente de las moléculas de hidrogenasa en tampón fosfato entre 0.01 y 1.0 M, pH entre 5.0 y 9.0, a través de sus grupos carboxilos activados con N-hidroxisuccinimida en presencia de etilcarbodiimida soluble durante un periodo adecuado, y

c) lavado posterior del electrodo con tampón fosfato.

14. Procedimiento de obtención del electrodo biológico según la reivindicación 13 caracterizado porque el arilderivado de sales de diazonio del punto a) pertenece al siguiente grupo: sal de nitrobenzildiazonio y el 2,5-dimetoxy-4-([4-nitrofenil]azo)bencenodiazonio.

15. Procedimiento de obtención del electrodo biológico según la reivindicación 13 caracterizado porque el paso de unión covalente se realiza en tampón fosfato 0.01 M, pH 6.0 en presencia de N-hidroxisuccinimida 1 mM y etilcarbodiimida 2 mM, durante 90 minutos de incubación.

16. Procedimiento de obtención del electrodo biológico según la reivindicación 13 caracterizado porque el electrodo conductor es un electrodo de carbón pirolítico "edge" modificado previamente con el reactivo tetrafluoborato 4-nitrobenceno diazonio que se pone en contacto con una disolución 27 µM de hidrogenasa purificada de Desulfovibrio gigas en tampón fosfato 0.01 M, pH 6.0 en presencia de N-hidroxisuccinimida 1 mM y etilcarbodiimida 2 mM, durante 90 minutos de incubación en esta disolución y lavado posterior del electrodo con tampón fosfato.

17. Procedimiento de obtención del electrodo biológico según la reivindicación 13 caracterizado porque la modificación de la superficie del electrodo de carbón de a) en concreto de material carbonáceo se lleva a cabo mediante irradiación con plasma para generar carboxilos que convenientemente modificados con diaminas, en presencia de carbodiiimida, y eventualmente N-hydroxisuccinimida recubren el electrodo de aminas primarias.

18. Procedimiento de obtención del electrodo biológico según la reivindicación 1 caracterizado porque el electrodo conductor es metálico y porque la modificación del electrodo metálico se lleva a cabo mediante un recubrimiento con una monocapa de moléculas alquiltioles bifuncionales que llevan en uno de sus extremos grupos tioles con tendencia a la quimisoción y en el otro extremo grupos funcionales que reaccionan con grupos funcionales expuestos en la enzima hidrogenasa para su inmovilización orientada.

19. Procedimiento de obtención del electrodo biológico según la reivindicación 18 caracterizado porque 1 electrodo metálico es de oro.

20. Uso del electrodo biológico según las reivindicaciones 1 a la 12 en la fabricación de un ánodo de una pila de combustible o de un cátodo de una celda electroquímicas.

21. Pila de combustible caracterizada porque comprende un electrodo biológico según las reivindicaciones 1 a la 12.

22. Celda electrolítica caracterizada porque comprende un electrodo biológico según las reivindicaciones 1 a la 12.