Dominios de unión de proteínas de la familia de proteínas de moléculas de orientación repulsiva (RGM) y fragmentos funcionales de las mismas, así como su uso.

Dominio de unión al receptor de neogenina de la molécula de orientación repulsiva

(RGM) con una secuencia de aminoácidos

de la posición de aminoácidos 200 a 350 según SEC ID Nº: 2,

de la posición de aminoácidos 200 a 325 según SEC ID Nº: 2, o

de la posición de aminoácidos 200 a 300 según SEC ID Nº: 2, o

de la posición de aminoácidos 200 a 285 según SEC ID Nº: 2, o

de la posición de aminoácidos 250 a 285 según SEC ID Nº: 2, o

de la posición de aminoácidos 260 a 285 según SEC ID Nº: 2, o

de la posición de aminoácidos 215 a 340 según SEC ID Nº: 2, o

de la posición de aminoácidos 260 a 340 según SEC ID Nº: 2, o

de la posición de aminoácidos 250 a 300 según SEC ID Nº: 2, o

de la posición de aminoácidos 260 a 291 según SEC ID Nº: 2, o

de la posición de aminoácidos 210 a 260 según SEC ID Nº: 2, o

de la posición de aminoácidos 290 a 350 según SEC ID Nº: 2,o

un fragmento de unión al receptor de neogenina funcional del mismo con una longitud de 10-30 restos de aminoácidos consecutivos, o equivalente de unión al receptor de neogenina funcional del mismo con una homología de secuencias de por lo menos el 75 %.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2006/009497.

Solicitante: AbbVie Deutschland GmbH & Co KG.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: Max-Planck-Ring 2a 65205 Wiesbaden ALEMANIA.

Inventor/es: MUELLER,REINHOLD, MÜLLER,BERNHARD K, SCHAFFAR,GREGOR.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales > C07K16/28 (contra receptores, antígenos celulares de superficie o determinantes celulares de superficie)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen antígenos... > A61K39/395 (Anticuerpos (aglutininas A61K 38/36 ); Inmunoglobulinas; Inmunosuero, p. ej. suero antilinfocitario)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS... > A61P25/00 (Medicamentos para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/71 (para factores de crecimiento; para reguladores de crecimiento)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/475 (Factores de crecimiento; Reguladores de crecimiento)

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Fragmento de la descripción:

de ias figuras

La Figura 1 muestra el alineamiento de secuencias de las formas humanas de RGM A (GenBank # NP_064596.1) RGM B (GenBank #NP_001012779) y RGM C (GenBank #NP_998818.1).

La Figura 2 muestra en representación esquemática la síntesis de moléculas de RGM. Entre el péptido señal del extremo N y el anclaje de GPI del extremo C están representados la secuencia de RGD, los dominios del factor de von Willebrand (vWF D), así como una secuencia hidrófoba en la zona del extremo C antes de la región de anclaje. Entre vWFD y la región hidrófoba se supone la zona de dominios de unión de interés según la invención. Debajo del diagrama están las posiciones de aminoácidos correspondientes para RGM A humana, los sitios de escisión proteolítica entre los aminoácidos 168 y 169.

La Figura 3A muestra mediante fotografías de microscopía de fluorescencia la influencia de distintos fragmentos de péptidos RGM A sobre el crecimiento de fibras nerviosas de células neuronales de rata. Mientras que el péptido 1 muestra actividad inhibidora a una concentración de 10 pg/ml, el péptido 4 es inactivo a la misma concentración. Se representan conjuntos de control correspondientes con tampón o PBS para comparación. La Figura 3B muestra un diagrama de barras de los índices de crecimiento de neuronas determinados (una masa para la superficie cubierta por neuronas en relación con el tamaño del agregado de células; se muestra el valor medio y la desviación estándar) para ¡lustrar la dependencia de la concentración de la actividad inhibidora del crecimiento de neuronas del péptido 1 de RGM-A según la invención. El diagrama de barras correspondiente para el péptido 4 de RGM-A se muestra en la Figura 3C.

En la Figura 4A se representan fotografías de microscopía de fluorescencia de células NTera neuronales humanas que ¡lustran la influencia del péptido 1 y péptido 4 de RGM-A (respectivamente a una concentración de 30 pg/ml) sobre el crecimiento de fibras nerviosas de estas células. Al igual que la comparación con la fotografía de control también representada (incubación con PBS en lugar de péptido), el péptido 1 provoca exclusivamente una inhibición del crecimiento de fibras nerviosas. En la Figura 4B se representan los índices de crecimiento de neuronas correspondientemente determinados para la serie de experimentos con el péptido 1, péptido 4 y control (PBS) (diagrama superior: mediciones individuales y valor medio, diagrama inferior: diagrama de barras con valor medio y desviación estándar).

La Figura 5A muestra los resultados de un análisis de fragmentos de RGM A en la prueba de crecimiento de fibras NTera. Los dos fragmentos de RGM A 2 (218 - 284) y 6 (168 - 422) se añadieron a neuronas NTera a una concentración de 90 nM. Ambos fragmentos inhiben fuertemente el crecimiento de fibras nerviosas de las neuronas NTera. ***= p < 0,001 Significación en comparación con control de PBS.

La Figura 5B muestra fotografías de microscopía de fluorescencia de los resultados de las pruebas de fragmentos de RGM A en la prueba de crecimiento de fibras nerviosas NTera. Los fragmentos de RGM A 2 (218 - 284), 3 (266 - 335), 4 (316-386) y 6 (168 - 422) se pipetearon a neuronas NTera a las concentraciones especificadas. Los fragmentos 2, 3 y 6 fueron activos, es decir, inhibidores del crecimiento de neuronas, el fragmento 4 fue inactivo.

La Figura 5C muestra otros resultados de los análisis de fragmentos de RGM A en la prueba de crecimiento de fibras nerviosas NTera. Los dos fragmentos de RGM A 3 (286 - 335) y 6 (168 - 422) se añadieron a neuronas NTera a una concentración de 6 pg/ml. Ambos fragmentos inhiben fuertemente el crecimiento de fibras nerviosas de las neuronas NTera. **= p < 0,01 Significación en comparación con control de tampón, ***= p < 0,001 Significación en comparación con control de tampón

La Figura 6A muestra el resultado del análisis del péptido 1 de RGM A y dos péptidos que se solapan con él parcialmente (Down-1 y Up-1) en la prueba de crecimiento de fibras nerviosas NTera. Los péptidos se añadieron a los agregados de NTera a una concentración de 10 pg/ml o 30 pg/ml. 24 - 36 horas después, los cultivos se fijaron, se tiñeron y se evaluaron. A una concentración de 30 pg/ml, los 3 péptidos de RGM A fueron activos e inhibieron significativamente el crecimiento de fibras nerviosas.

La Figura 6B muestra el resultado del análisis de otros tres péptidos de RGM A en la prueba de crecimiento de fibras nerviosas NTera. Los péptidos de RGM A se añadieron a los agregados de NTera a una concentración de 10 pg/ml o 30 pg/ml. 24 - 36 horas después, los cultivos se fijaron, se tiñeron y se evaluaron. A una concentración de 10 pg/ml, los 3 péptidos de RGM A (5-Ak, 6-Ak, 7-Ak) fueron inactivos; solo los péptidos 7-Ak y 6-Ak mostraron a la mayor concentración una clara tendencia en dirección a la inhibición del crecimiento de fibras nerviosas.

La Figura 7A muestra el resultado de la prueba de unión de RGM A - neogenina. En esta prueba, los anticuerpos policlonales, que se dirigen contra el péptido Down-1, fueron muy potentes y bloquearon a las concentraciones más bajas (Down 1 8641 y Down 1 8640) la interacción del ligando de RGM A con su receptor, la proteína neogenina. Un anticuerpo de control (control de ratón) no tuvo ningún efecto, mientras que un anticuerpo policlonal que puede obtenerse comercialmente de la empresa R & D Systems (PAB anti RGM) también bloqueó la interacción RGM A- neogenina, pero esencialmente menos eficazmente.

La Figura 7B muestra cómo el anticuerpo policlonal específico para Down-1 neutralizó la actividad inhibidora del potente fragmento 2 de RGM A en la prueba de crecimiento de fibras nerviosas NTera. Los cultivos de NTera se trataron en la prueba de crecimiento con PBS, fragmento 2 (2 pg/ml) o con fragmento 2 (2 pg/ml) y al mismo tiempo con anticuerpo policlonal Down-1 (0,6 pg/ml).

Descripción detallada de la invención

i. Expiraciones de término aeneraies

"Receptores" designa en el marco de la presente invención especialmente a moléculas superficiales unidas a una membrana celular que pueden interaccionar con un ligando, por ejemplo soluble, y como consecuencia de esta interacción pueden desencadenar una señal, por ejemplo, dirigida al interior de la célula o una cascada de señales (también denominado señalización).

"Ligando" designa un componente de unión de bajo o de alto peso molecular natural, es decir, formado /n v/vo o generado artificialmente, para un "receptor". El ligando puede moverse libremente preferiblemente en el entorno extracelular.

"Inmunogén" designa un fragmento de péptido según la invención en forma glucosilada o no glucosilada que es adecuado para la inducción de la formación de anticuerpos contra el inmunogén. Dado el caso, puede ser ventajosa una unión del inmunogén (como hapteno) a un vehículo macromolecular.

"Epítope" o determinante antigénico designa la zona de un antígeno que determina la especificidad de un anticuerpo como, por ejemplo, de una proteína. Si este epítope se forma de nuevo en una sección de la proteína, por ejemplo, mediante influencias externas, como, por ejemplo, una interacción de una proteína con un ligando, o se expresa sobre la superficie de la molécula accesible, entonces se habla de un "neoepítope".

"Dominio" de una proteína o anticuerpo designa una estructura compleja formada por elementos de hélice alfa y/u hoja plegada beta limitada dentro de la proteína.

Si no se hacen otras indicaciones, entonces el término "proteína de RGM según la invención" comprende tanto el dominio de unión a neogenina como también los péptidos derivados del mismo de un miembro de la familia de moléculas de RGM, especialmente... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Dominio de unión al receptor de neogenina de la molécula de orientación repulsiva (RGM) con una secuencia de aminoácidos

de la posición de aminoácidos 200 a 350 según SEC ID N°: 2,

de la posición de aminoácidos 200 a 325 según SEC ID N°: 2, o

de la posición de aminoácidos 200 a 300 según SEC ID N°: 2, o

de la posición de aminoácidos 200 a 285 según SEC ID N°: 2, o

de la posición de aminoácidos 250 a 285 según SEC ID N°: 2, o

de la posición de aminoácidos 260 a 285 según SEC ID N°: 2, o

de la posición de aminoácidos 215 a 340 según SEC ID N°: 2, o

de la posición de aminoácidos 260 a 340 según SEC ID N°: 2, o

de la posición de aminoácidos 250 a 300 según SEC ID N°: 2, o

de la posición de aminoácidos 260 a 291 según SEC ID N°: 2, o

de la posición de aminoácidos 210 a 260 según SEC ID N°: 2, o

de la posición de aminoácidos 290 a 350 según SEC ID N°: 2,o

un fragmento de unión al receptor de neogenina funcional del mismo con una longitud de 10-30 restos de aminoácidos consecutivos, o equivalente de unión al receptor de neogenina funcional del mismo con una homología de secuencias de por lo menos el 75 %.

2. Dominio de unión al receptor de neogenina con una secuencia de aminoácidos según la región de secuencia de la posición 260 a 291 ó 267 a 285 según SEC ID N°: 2, o

la región de secuencia de la posición 260 a 325 según SEC ID N°: 4 o

la región de secuencia de la posición 250 a 300 según SEC ID N°: 6;o fragmento de unión al receptor de neogenina del mismo, que presenta por lo menos 10 restos de aminoácidos adyacentes del mismo.

3. Fragmento de polipéptido antigénico del dominio de unión al receptor de neogenina según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el fragmento antigénico presenta por lo menos 10 restos de aminoácidos contiguos del dominio.

4. Fragmento de polipéptido antigénico según la reivindicación 3, que es útil para la preparación de moléculas de ¡nmunoglobulina que modulan la unión de RGM al receptor de neogenina.

5. Fragmento de polipéptido antigénico según la reivindicación 3, que comprende por lo menos 10 restos de aminoácidos contiguos de un péptido con una de las secuencias según SEC ID N°: 7, 8, 9, 10 ó 23 a 29 ó 31 a 34.

6. Uso de un dominio de unión al receptor de neogenina según una de las reivindicaciones 1 y 2 o de un fragmento de polipéptido según una de las reivindicaciones 3 a 5 para la preparación de un antisuero policlonal o anticuerpo

monoclonal contra RGM.

7. Uso según la reivindicación 6, en el que el antisuero o el anticuerpo modula la unión de RGM al receptor de neogenina.

8. Antisuero policlonal o anticuerpo monoclonal contra RGM según la definición en una de las reivindicaciones 6 y 7 para su uso en el diagnóstico o terapia.

9. Uso de un antisuero policlonal o de un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 8 para la preparación de un producto farmacéutico para el diagnóstico o terapia de enfermedades o estadios de enfermedad que están mediados por una interacción del receptor de neogenina con RGM o un fragmento de RGM.

10. Uso según la reivindicación 9, en el que las enfermedades o estadios de enfermedad están seleccionados de

a) lesiones mecánicas del cráneo, cerebro y médula espinal,

b) enfermedades crónicas, seleccionadas de entre enfermedades neurodegenerativas, inflamatorias o autoinmunitarias,

c) trastornos de la regeneración neuronal, del brote axónico, de la extensión de neuronas y de la plasticidad neuronal,

d) enfermedades tumorales y metastatización tumoral.

11. Uso de un dominio de unión al receptor de neogenina según una de las reivindicaciones 1 y 2 o de un fragmento de polipéptido según una de las reivindicaciones 3 a 5 para la preparación de un agente para el diagnóstico o terapia de enfermedades o estadios de enfermedad que están mediados por una interacción alterada o perjudicada de RGM o un fragmento de RGM con el receptor correspondiente.

12. Uso según la reivindicación 11, en el que las enfermedades o estadios de enfermedad están seleccionados de entre

a) procesos de neuritogénesis modificados en enfermedades psicóticas y estados de dolor crónico que son provocados por la excesiva formación de brotes de neuronas y/o sinaptogénesis patológica

b) enfermedades asociadas a un metabolismo del hierro alterado;

c) enfermedades asociadas a un crecimiento óseo alterado

d) enfermedades asociadas a modificaciones degenerativas del cartílago

e) enfermedades asociadas a lesiones discales y de los cuerpos vertebrales

f) enfermedades asociadas a procesos de migración celular desregulados incontrolados.

13. Dominio de unión al receptor de neogenina según una de las reivindicaciones 1 y 2 o de un fragmento de polipéptido según una de las reivindicaciones 3 a 5 para su uso como diana para la detección o para la identificación de ligandos que se unen a RGM.

14. Dominio de unión al receptor de neogenina según una de las reivindicaciones 1 y 2 o de un fragmento de polipéptido según una de las reivindicaciones 3 a 5 para su uso como inmunogén para inmunización activa o pasiva.

15. Antisuero policlonal que puede obtenerse mediante la inmunización de un mamífero con una cantidad antigénica de un dominio de unión al receptor de neogenina según una de las reivindicaciones 1 y 2 o de un fragmento de polipéptido según una de las reivindicaciones 3 a 5.

16. Anticuerpo monoclonal contra un dominio de unión al receptor de neogenina según una de las reivindicaciones 1 y 2 o contra un fragmento de polipéptido según una de las reivindicaciones 3 a 5, o un fragmento que se une al antígeno del mismo, dado el caso en forma humanizada.

17. Producto farmacéutico que comprende en un vehículo farmacéuticamente compatible por lo menos un constituyente activo seleccionado de entre:

a) un dominio de unión al receptor de neogenina según una de las reivindicaciones 1 y 2 o un fragmento de polipéptido según una de las reivindicaciones 3 a 5,

b) anticuerpos monoclonales o policlonales según una de las reivindicaciones 15 y 16.

18. Producto farmacéutico según la reivindicación 17 para administración intratecal, intravenosa, subcutánea, oral o

parenteral, nasal y por inhalación.

19. Vector de expresión, que comprende por lo menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un dominio de unión al receptor de neogenina según una de las reivindicaciones 1 y 2 o un fragmento de polipéptido según una de las reivindicaciones 3 a 5, operativamente ligado con por lo menos una secuencia de ácidos nucleicos reguladora.

20. Microorganismo recombinante que lleva por lo menos un vector según la reivindicación 19.

21. Línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 16.

22. Procedimiento para la preparación de un dominio de unión al receptor de neogenina según una de las reivindicaciones 1 y 2 o de un fragmento de polipéptido según una de las reivindicaciones 3 a 5, en el que se cultiva un microorganismo recombinante según la reivindicación 20 y el producto de proteína producido se aísla del cultivo.

23. Procedimiento para la preparación de un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 16, en el que se cultiva una línea celular de hibridoma según la reivindicación 21 y el producto de proteína producido se aísla del cultivo.