Dispositivo sensor interdigitado basado en anticuerpos no marcados y procedimiento para la detección y cuantificación de sus anclas presentes en líquidos.

Comprende una matriz de electrodos (4.1.1) interdigitados tapizados con antígeno para reaccionar con unos anticuerpos no marcados que se aportan después de unas sustancias a detectar y cuantificar, en un líquido, al sensor, siendo una parte de los anticuerpos capturada por los electrodos y otra parte es capturada por las moléculas a detectar y cuantificar reaccionando competitivamente respecto al antígeno, con dichos anticuerpos no marcados, incluyendo unos medios de detección de la variación en las propiedades eléctricas de la matriz de electrodos, provocada por los anticuerpos no marcados capturados por el antígeno.El método comprende realizar una primera medida de las propiedades eléctricas de los electrodos interdigitados con antígeno, aplicar una solución de una sustancia a detectar y de anticuerpos no marcados, realizar una segunda medida y comparar las medidas

Dispositivo sensor interdigitado basado en anticuerpos no marcados y procedimiento para la detección y cuantificación de sustancias presentes en líquidos.

La presente solicitud de patente de invención consiste conforme indica su enunciado, en un dispositivo sensor interdigitado basado en anticuerpos no marcados para la detección y cuantificación de sustancias presentes en líquidos, cuyas nuevas características de construcción, conformación y diseño proporcionan una seguridad y eficacia máximas para la función a la que va destinado.

Más concretamente, la presente invención se refiere a un dispositivo sensor para la detección de compuestos o moléculas en líquidos, con aplicación en la detección de contaminantes en suelos, aguas, al control de calidad de diversos alimentos, y similares.

Otro de los fines de la invención es posibilitar la fabricación de dispositivos sensores de bajo coste que permitan la detección y/o cuantificación altamente selectiva de especies químicas en bajas concentraciones. Además puede ser actuado y leído automáticamente por medios electrónicos y automáticos.

Otro de los fines de la invención es brindar la posibilidad de realizar las medidas a una sola frecuencia, lo que permite una fuerte reducción de costes en la circuitería de control. Así mismo, el dispositivo sensor puede también ser medido en un espectro de frecuencias con lo que se obtiene mayor fiabilidad de la respuesta y una mayor sensibilidad.

Las ventajas que incorpora el dispositivo sensor objeto de la invención son las de combinar una alta sensibilidad con una alta especificidad. El dispositivo sensor es altamente sensible, pues se basa en la reacción competitiva entre un antígeno inmovilizado en la superficie del dispositivo y las moléculas de la sustancia a detectar, por la captura por parte de ambos (antígeno y moléculas) de una parte de unos anticuerpos no marcados que se aportan, tras la sustancia a detectar en un liquido (en la solución de ensayo), al dispositivo, previamente funcionalizado con el antígeno. Como resultado de esta reacción competitiva, una cantidad de anticuerpo es capturado por el antígeno inmovilizado en la superficie del dispositivo y es medida, y otra parte es evacuada del dispositivo por acción de las moléculas a detectar, por lo que dicha cantidad de anticuerpo capturado por el antígeno inmovilizado está en relación con la concentración de moléculas a detectar presentes en la solución de ensayo. El dispositivo sensor es altamente selectivo gracias la especificidad de los anticuerpos. Es un dispositivo de sencilla fabricación y por tanto de bajo coste, en el que la medida es fácil de realizar, siendo sencillo automatizar su uso. Es un dispositivo sensor muy adecuado para detección y cuantificación en campo y cuando se requiere bajo coste del sistema.

La invención también comprende un procedimiento para la detección y cuantificación de sustancias presentes en líquidos en el que se utiliza dicho dispositivo sensor basado en anticuerpos no marcados y funcionalizado con el antígeno.

Estado de la técnica

Existe variedad de diseños propuestos en la literatura de dispositivos sensores de moléculas en líquidos. Muchos de estos dispositivos sensores se basan en procesos electroquímicos sobre células de detección. Estos dispositivos sensores usualmente se basan en configuraciones de 3 electrodos, con uno de referencia y otro que lleva una capa sensible que aporta selectividad al dispositivo sensor, en recipientes con soluciones liquidas. En estos dispositivos sensores las medidas se basan frecuentemente en la interpretación de las curvas de histéresis de corriente en función de la tensión aplicada en ciclos periódicos. La obtención de las concentraciones de las moléculas objetivo es un proceso relativamente complicado donde se requiere personal entrenado y/o software de cierta complejidad. Las células de detección se pueden reducir en tamaño, pero existen limites a esta miniaturización.

Los dispositivos sensores presentados en la literatura muestran generalmente mayor complejidad, tanto para la realización de la medida como para la interpretación. A continuación mostramos algunos ejemplos de dispositivos sensores potenciométricos y amperométricos:

Entre los dispositivos sensores potenciométricos encontramos el Light-addressable potentiometric sensor (LAPS), el cual es un dispositivo sensor químico basado en un semiconductor con una estructura electrolyte-insulator-semiconductor (EIS). Si bien el uso de este dispositivo sensor ha sido muy recurrente en la literatura para la detección de diferentes especies, el sistema de detección implica inicialmente aplicar un voltaje de a lo largo de la estructura EIS para conseguir un cambio en la capacidad en la interfaz aislante-semiconductor. Esta capacidad cambia con el potencial de la superficie, el cual es una función de la concentración de iones en la solución electrolito. Entonces, para que esta capacidad pueda ser leída hará falta iluminar el substrato semiconductor con una luz modulada y lo que se medirá será la fotocorriente alterna, ac, generada. Finalmente, la medida se deberá realizar mediante un circuito externo.

Como vemos, este sistema, a diferencia del que presentamos en esta patente implica una estructura compleja y con miniaturización limitada.

Entre los dispositivos sensores amperométricos encontramos el Microsens Amperometric Sensor de la firma MICROSENS S.A., el cual es un dispositivo electroquímico miniaturizado mediante tecnología microelectrónica. Este sensor puede ser usado para determinar la concentración de una amplia gama de especies químicas activas redox. Si bien este es un sensor de pequeño tamaño, bajo consumo de analito y bajo coste, utiliza un diseño de tres electrodos.

El principio de amperometría está basado en la medida de la corriente entre el electrodo de trabajo y el electrodo auxiliar, la cual es inducida por una reacción redox en el electrodo de trabajo. Las condiciones son escogidas de tal forma que la corriente es directamente proporcional a la concentración de una especie activa redox en la solución de analito. El potencial eléctrico entre el electrodo de trabajo y la solución medida es alcanzado gracias a un electrodo de referencia separado y es controlado por un sistema potenciostato electrónico. El electrodo de trabajo y el electrodo auxiliar se fabrican mediante capas de película delgadas de platino sobre una oblea de Si mediante un proceso de depósito específico. Además el electrodo de referencia integra una capa delgada de Ag/AgCl el cual se fabrica por un proceso similar. Adicionalmente, se fotopolimerizan membranas orgánicas sobre el área de electrodo de trabajo para separar la superficie de electrodo de la solución medida. La selectividad para una especie química activa redox se obtiene mediante un potencial de polarización conveniente y una membrana bien definida fotopolimerizada.

Puede verse que este sistema consigue buenas prestaciones, sin embargo, a diferencia del sistema que se presenta en esta invención el proceso de fabricación del dispositivo sensor requiere una elevada complejidad.

Exposición de la invención

El dispositivo sensor objeto de esta patente se basa en la reacción competitiva entre el antígeno tapizado en la superficie del dispositivo y la(s) sustancia(s) a detectar, por los anticuerpos no marcados que se aportan tras la solución de la muestra a detectar y cuantificar al dispositivo. Una cantidad de estos anticuerpos, capturada por las moléculas a detectar es evacuada del dispositivo juntamente con estas moléculas, y otra parte es capturada por el dispositivo y puede medirse. En efecto, esta cantidad de anticuerpo capturada por el dispositivo está en relación con la concentración de moléculas a detectar presentes en la solución de ensayo.

La presente invención está basada en una matriz de electrodos interdigitados (IDE's), funcionalizada y en los anticuerpos no marcados.

Para la fabricación de estos electrodos podemos utilizar diferentes metales conductores (Ej.: oro, platino), así como diferentes substratos (Ej.: pirex, plástico). Así mismo, la geometría (Ej.: barra, zig-zag), las dimensiones de los electrodo (Ej.: mm, sub-mm) y el grosor entre dedos así como el espacio intersticial o gap (Ej.: μm, nm) también pueden ser escogidos.

Los IDE's serán funcionalizados previamente con una capa de antígeno tapizado (Ej.: AT-BSA). Sobre esta capa se realizará el ensayo competitivo...

1. Dispositivo sensor interdigitado basado en anticuerpos no marcados, para la detección y cuantificación de sustancias presentes en líquidos, que comprende:

- una matriz de electrodos interdigitados funcionalizados con una capa de antígeno tapizado en la superficie de los electrodos, mediante una técnica de inmovilizado por absorción, estando dicha capa de antígeno prevista para reaccionar con unos anticuerpos no marcados que se aportan, después de dichas sustancias a detectar y cuantificar contenidas en un líquido, al dispositivo sensor, de manera que una parte de dichos anticuerpos no marcados es capturada por dicha superficie de los electrodos funcionalizada y otra parte es capturada por las moléculas de la sustancia a detectar y cuantificar, que es evacuada, reaccionando competitivamente dichas moléculas respecto a la reacción de dicha capa de antígeno, con dichos anticuerpos no marcados; y

- unos medios de detección previstos para detectar la variación en las propiedades eléctricas de dicha matriz de electrodos interdigitados, provocada por dicha parte de anticuerpos no marcados capturados por dicha capa de antígeno en cada ensayo de una sustancia.

2. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un generador de funciones que excita el sistema de electrodos interdigitados mediante una señal sinusoidal de baja amplitud a una frecuencia de trabajo.

3. Dispositivo según la reivindicación 2, caracterizado porque dichos medios de detección comprenden un medidor de impedancia para la lectura de la impedancia existente entre los electrodos interdigitados de dicha matriz de electrodos interdigitados, estando éstos sumergidos en una solución tampón, antes y después de la captura, por parte de la capa de antígeno, de dicha parte de anticuerpos no marcados.

4. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un analizador de impedancias previsto para excitar el sistema de electrodos interdigitados mediante una señal sinusoidal de baja amplitud en el espectro de frecuencias de trabajo y que además captura los datos de impedancia resultantes de la medida, estando dichos electrodos sumergidos en una solución tampón antes y después de la captura, por parte de la capa de antígeno, de dicha parte de anticuerpos no marcados.

5. Dispositivo según la reivindicación 3 ó 4, caracterizado por comprender un bloque de procesado de datos que incluye una tabla almacenada en un microcontrolador y una circuitería de control para determinar la concentración de la(s) sustancia(s) a detectar.

6. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un sistema de micro-jeringas previsto para realizar el depósito sobre los electrodos interdigitados de unas soluciones de dicha capa de antígeno de funcionalización, y de una solución de una sustancia a analizar.

7. Dispositivo según la reivindicación 6, caracterizado porque cada electrodo de dicha matriz de electrodos interdigitados integra un grupo propio de micro jeringas permitiendo inyectar diferentes soluciones a cada electrodo, o diferentes réplicas de la misma solución para mostrar un promedio de detección.

8. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un sistema fluídico previsto para realizar el depósito de unas soluciones de funcionalización de dicha capa de antígeno sobre los electrodos interdigitados, y de una solución de una sustancia a analizar.

9. Dispositivo según la reivindicación 8, caracterizado porque dicho sistema fluídico dispone de un único canal de entrada y un único canal de salida para todos los electrodos interdigitados de la matriz, permitiendo introducir a través de dicho canal de entrada una solución contenedora de una o más moléculas a detectar.

10. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque dichos electrodos interdigitados tienen forma de barra y están dispuestos sobre un substrato de pirex.

11. Dispositivo según la reivindicación 10, caracterizado porque dichos electrodos interdigitados son de oro.

12. Dispositivo según la reivindicación 11, caracterizado porque comprende una capa de cromo como metal de adhesión entre los electrodos de oro y dicho substrato de pirex.

13. Dispositivo según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado por incorporar medios para aportación de un gas de secado para el secado de los electrodos interdigitados entre cada paso de su funciona-lización.

14. Dispositivo según la reivindicación 1, caracterizado porque los terminales de los electrodos interdigitados se encuentran conectados a un equipo de medida mediante un sistema de conexión con contactos "clip-on" formado por dos piezas:

i) una matriz de electrodos interdigitados que incluyen unas salidas simétricas y externas, y

ii) un "espejo" de estas salidas externas, las cuales conectan dichos IDE's con dicho equipo de medida).

15. Procedimiento para la detección y cuantificación de sustancias presentes en líquidos, que comprende:

a) funcionalizar con una capa de antígeno la superficie de unos electrodos interdigitados, tapizando dicha superficie;

b) realizar una primera medida de las propiedades eléctricas de dichos electrodos interdigitados,

c) aplicar una solución con unas moléculas a detectar seguida de una solución con anticuerpos no marcados sobre dichos electrodos interdigitados, para que dichos antígenos y dichas moléculas de la sustancia a detectar, que luego es evacuada, reaccionen competitivamente con dichos anticuerpos no marcados;

d) realizar una segunda medida de las propiedades eléctricas de dichos electrodos interdigitados, una vez que una parte de los anticuerpos no marcados han sido capturados por dicha capa de antígeno;

e) comparar dichas segundas medidas con dichas primeras medidas; y

f) detectar, en función de la variación detectada en dicha comparación, a qué sustancia pertenecen dichas moléculas, por comparación con unas tablas de referencia para cada sustancia analizada.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque dicha etapa f) comprende además cuantificar el número de moléculas incluidas en dicha solución de moléculas a detectar.

17. Procedimiento según la reivindicación 15 ó 16, caracterizado porque dicha etapa f) comprende detectar simultáneamente varias sustancias mediante la aplicación, en dicha etapa c), de varias soluciones con anticuerpos específicos al antígeno inmovilizado en dicha etapa a), y el uso de matrices de electrodos integrables.

18. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque comprende, tras dicha etapa f), limpiar a los electrodos de todo agente biológico, así como de las nanopartículas conductoras, y reutilizar dichos electrodos interdigitados realizando de nuevo dichas etapas a) a f).

19. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque dichas etapas b) y d) comprenden una media de impedancia a una sola frecuencia, utilizando PBS como solución tampón en la que están sumergidos los electrodos interdigitados.

20. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque dichas etapas b) y d) comprenden una media de impedancia en un espectro de frecuencias, utilizando PBS como solución tampón en la que están sumergidos los electrodos interdigitados.