DISPOSITIVO Y PROCEDIMIENTO PARA LA EVALUACION MULTIPLE Y SIMULTANEA DE LA ACTIVIDAD CONTRACTIL DE SUSTANCIAS FARMACOLOGICAS MEDIANTE METODOS OPTICOS.

Dispositivo para la evaluación múltiple y simultánea de la actividad contráctil de sustancias farmacológicas mediante métodos ópticos caracterizados por el uso de placas multi-pocillo o equivalentes,

un módulo de adquisición digital de imágenes para la monitorización y cuantificación de la actividad farmacológica. Las preparaciones están termostatizadas y el sistema incorpora el procesado mediante algoritmos que permiten la cuantificación de la actividad contráctil de forma simultánea.

A diferencia de los métodos al uso, no requiere de transductores de fuerza o de desplazamiento para la cuantificación de la actividad contráctil. Su aplicación reduce de forma drástica el tiempo requerido para la obtención de resultados.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201000640.

Solicitante: UNIVERSIDAD DE LA LAGUNA.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: BORGES JURADO,RICARDO, BELTRAN BAUTE,BEATRIZ, SUAREZ MONTESINOS,MONICA, MACHADO PONCE,JOSÉ DAVID, RODRIGUEZ VALIDO,Manuel, DIAZ MARTIN,David, GONZALEZ MORALEZ,Yezer.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • G01N33/483 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Análisis físico de material biológico.

PDF original: ES-2390961_A1.pdf

 


Fragmento de la descripción:

SECTOR DE LA TÉCNICA

Biotecnología, investigación farmacéutica

ESTADO DE LA TÉCNICA

La evaluación de la actividad farmacológica de las sustancias químicas emanadas de los laboratorios de síntesis o de aislamiento requiere de un sustrato biológico sobre el cual hacer las pruebas. Tradicionalmente se han utilizado las técnicas en tejidos y en animales enteros. Para evaluar la actividad contráctil de un tejido (un vaso sanguíneo, una porción de intestino, un anillo traqueal o bronquial, etc ... ) se requiere de transductores que miden la fuerza contráctil o el desplazamiento de la preparación. Cada porción de tejido se coloca en una copa de baño termostatizada y el tejido, inmerso en una solución tampón fisiológica oxigenada, se somete a una tensión basal. Se estudia la acción del fármaco midiendo las contracciones o relajaciones del tejido. Con la llegada de los sistemas de producción masiva de sustancias esas técnicas resultaban muy lentas y costosas por lo que se relegaron a las últimas etapas del cribado farmacológico. Paralelamente se han ido desarrollando nuevos abordajes para el cribado masivo de sustancias (high throughput screening) que permitieron la robotización de los análisis de actividad farmacológica. Las dianas ahora ya no son los tejidos sino las células cultivadas o las enzimas, receptores, ADN inmovilizados sobre un sustrato que generalmente cambia de color cuando una sustancia química se liga a ellos. La base ya no es la copa del baño de órganos, ni el tejido perfundido sino la placa multipocillo. Las placas se han desarrollado con las mismas dimensiones independientemente de la casa que las fabrique o del número de pocillos (desde 6 hasta 1536) . Existen diversas modificaciones en el mercado que permiten extender sus aplicaciones como los colores (transparentes, blancas, negras) , el material del fondo, plástico, vidrio, polímeros, materiales de filtración, etc. Con todo, el desarrollo de los sistemas de manejo de líquidos se ha optimizado para el trabajo con multipipetas, lavadores de placas y todo tipo de robots. Simultáneamente se han desarrollado los sistemas de detección (colorimétricos, fluorescentes, fosforescencia, impedancia, etc.) . El resultado ha sido que un macro robot puede evaluar diariamente librerías de cientos de miles sustancias. El principal inconveniente radica en que ya no se trabaja con tejidos -la auténtica diana de

los fármacos-y que la información proporcionada no siempre es útil. Como ejemplo podríamos decir que si un compuesto X actúa sobre células cancerosas de varios tipos podemos estar ante un eficiente antitumoral o simplemente lejía. Los resultados del cribado masivo hasta la fecha han sido cuando menos decepcionantes.

El uso de transductores mecánicos (por ejemplo, galgas extensiométricas) introduce alteraciones reológicas en el tejido y con frecuencia lo daña. Además, el tiempo requerido para el montaje de la preparación es muy largo.

Para el caso de la invención que nos ocupa, el principio de medida prescinde de sistemas mecánicos, evitando muchas manipulaciones sobre el tejido. El transductor es sustituido por un sistema de adquisición digital de imágenes, como puede ser una simple cámara de fotos. Se emula así el registro continuo de imágenes, permitiendo observar los cambios (contracciones, dilataciones o variaciones de relación de aspecto entre ejes bidimensionales) que experimenta el tejido ante un fármaco.

Por ejemplo, en el ejemplo descrito, se utilizan placas de 96 pocillos. A diferencia de los métodos al uso, no requiere de transductores de fuerza o de desplazamiento para la cuantificación de la actividad contráctil. También reduce drásticamente el tiempo requerido para la obtención de resultados. La estructura matricial de las placas permite el manipulado en paralelo con pipetas multicanal o, en su caso, la automatización robótica del manejo de líquidos. Igualmente, se reduce la cantidad de tejido (y animales) necesarios para completar un estudio farmacológico. Al prescindir de transductores, copas de baño, equipos de amplificación, termostatización, etc. se abarata significativamente el coste inicial de implementación de la técnica. Además, el pequeño volumen de los pocillos reduce, al menos, en dos órdenes de magnitud la cantidad de producto necesario para conducir un análisis farmacológico.

Sin embargo, estos documentos, a pesar de hacer uso de procesado de imagen para realizar medidas y análisis, están lejos de la propuesta presentada a continuación, ya que en este caso particular se determina el área encerrada en los tejidos así como su evolución como respuesta a los fármacos. La presente invención permite además solucionar los problemas descritos y proporciona un procedimiento y un dispositivo para el estudio de la actividad farmacológica elevado de muestras.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: Diagrama de bloques del sistema está formado por: A) Placa de pocillos con las muestras a analizar. B) Módulo de Adquisición de Imagen, compuesto por una óptica correctora (B.I) y una cámara digital (B.2) . C) Módulo de Procesado, integrado por un procesador (C.l) , un bloque de memoria (C.2) y una interfaz de usuario (e.3) . D) Usuario. En este diagrama se muestra el flujo general de información entre los distintos elementos expresando el orden mediante la secuencia de números.

Figura 2. Descripción montaje del sistema. En el ejemplo que se muestra, el principio consiste en cortar secciones de tejido, en este caso anillos de la arteria aorta de rata de 500700 11m de grosor y colocarlos en una placa de cultivos de 96 pocillos en los que hemos puesto solución tampón fisiológica (100 I1L de Krebs-HEPES) . En la parte A se muestra un esquema de la vista lateral donde una cámara digital (a) enfoca la placa de 96 pocillos (b) . Esta se encuentra situada sobre una placa calefactora, en nuestras condiciones a 37°C. La placa calefactora puede utilizar agua en recirculación o un sistema peltier. Ambas placas se sitúan dentro de una cámara de metacrilato para mantener un mejor control de la temperatura (c) . En el panel B se muestra una vista aérea de una placa de 96 pocillos (b) . En e vemos una representación de cuatro anillos de aorta (e) .

Figura 3. Algoritmo de cuantificación. A, imagen original de un sólo pocillo. B, imagen acondicionada (reducción de brillos y reflejos) . C, imagen intermedia invertida, aquí se localiza y se identifica el tejido (objeto de interés) . D, área resultante a medir obtenida combinando la imagen A ylos parámetros extraídos de la imagen e.

Figura 4. Experimento llevado a cabo en una multiplaca de 96 pocillos (sólo se muestran 25) para la evaluación de la actividad contráctil de la aorta torácica de rata por métodos ópticos. A, anillos aórticos antes de administrar el agonista alfa-adrenérgico fenilefrina. B, los mismos anillos tras cinco minutos de estimulación. e, representación del experimento. Curva concentración respuesta obtenida de la placa (en eje Y reducción de área, en eje X -Log[M]) .

La curva superior representa la evolución de las muestras de control, mientras que la curva inferior representa la respuesta de los anillos al fármaco. Cada punto corresponde a la media ± error estándar de 8 anillos. La contracción fue normalizada al valor inicial (entendido como 100%) del área de la luz arterial de cada anillo.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La invención permite evaluar la actividad contráctil de sustancias farmacológicas (Figura 1) determinando cómo responden los tejidos al aplicar dichas sustancias. Se caracteriza por:

l. Unas placas multipocillo (en esta memoria las hemos usado de 96 pocillos) en sustitución de las copas de baño tradicionales. Con estas placas se permite el análisis simultáneo de muchas sustancias en decenas de preparaciones. 2. Una cámara fotográfica para adquirir imágenes a distintos intervalos de tiempo y de esa forma conocer cómo responden los tejidos ante el fármaco administrado.

3. Un procedimiento para el cribado farmacológico que permite cuantificar la actividad contráctil. Este procedimiento se realiza mediante la aplicación de algoritmos que se basan en la ejecución de una serie de fases:

Fase 1. Configuración del experimento

Primeramente, se coloca la placa de pocillos sobre el soporte de fijación, de forma que quede perfectamente alineada con el sensor de la cámara. En el caso de no disponer en... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento que permite evaluar la actividad contráctil de sustancias farmacológicas analizando el cambio que experimentan los tejidos a los que son

aplicadas, caracterizado por ejecutar las siguientes fases: -Fase 1 de configuración, donde una placa multipocillos o equivalente se sitúa de manera alineada con una cámara fotográfica o un sistema de adquisición de imágenes y se genera una base de datos de los parámetros físicos de la placa: diámetro, número de pocillo y profundidad.

-Fase 2 de extracción de medida, que consiste en aplicar un algoritmo donde se captura una imagen, se convierte a escala de grises y se divide en tantas subimágenes como pocillos se dispongan en la placa. En una segunda etapa se eliminan rasgos indeseados que dificultarían la detección del tejido. A continuación, cada subimagen se segmenta. Seguidamente, se identifica la región del tejido que interese

estudiar mediante la aplicación de descriptores y se determina su posición. Finalmente, se selecciona el área inscrita por esa región del tejido que interese estudiar y se extraen los datos deseados, en particular un cambio de área. Fase 3 de presentación de resultados, donde los resultados correspondientes a la medición del área de cada tejido son almacenados de forma dinámica yen formato

estándar, y se analiza la variación del área de tal forma que si disminuye se considera que la sustancia analizada presenta actividad contráctil. Un aumento del área implica que la sustancia analizada presenta actividad dilatadora.


 

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