Dispositivo, kit y procedimiento para la captura y detección de antígenos de anquilostoma.

Un procedimiento de detección de la presencia o ausencia de antígeno de anquilostoma en una muestra fecal de un mamífero que comprende:

a. poner en contacto la muestra fecal con uno o más anticuerpos específicos para proteína secretada por Ancylostoma de Ancylostoma caninum de anquilostomas (ASP5); y

b. detectar la presencia o ausencia de uno o más antígenos de anquilostoma o uno o más complejos de anticuerpo/antígeno de anquilostoma.

Dispositivo, kit y procedimiento para la captura y detecciïn de antïgenos de anquilostoma

Antecedentes de la invenciïn 1. Campo de la invenciïn La presente invenciïn se refiere a dispositivos, kits y procedimientos para la detecciïn de anquilostoma en animales. Mïs particularmente, la invenciïn se refiere a dispositivos basados en anticuerpos, kits y procedimientos para capturar y detectar antïgenos de anquilostoma en las heces de un animal con el fin de diagnosticar que tal animal tiene o no tiene una infecciïn por anquilostoma. Incluso mïs particularmente, la invenciïn se refiere a dispositivos basados en anticuerpos, kits y procedimientos para diagnosticar una infecciïn por anquilostoma en un animal antes o despuïs de que los huevos de anquilostoma aparezcan por primera vez en las heces del animal. Todavïa mïs particularmente, la invenciïn se refiere a dispositivos basados en anticuerpos, kits y procedimientos para confirmar la presencia o ausencia de una infecciïn por anquilostoma en un animal independientemente de si ese animal estï infectado o no por uno o mïs de ascïride, tricocïfalo, cïstodo y gusano del corazïn.

2. Descripciïn de la tïcnica anterior

Los anquilostomas son parïsitos intestinales hematïfagos que pueden hacer que su portador sufra enfermedad grave, tal como anemia, debilitamiento y desarrollo retardado. Por ejemplo, el anquilostoma Ancylostoma caninum produce enfermedad significativa en tanto perros como seres humanos (Prociv y col., Acta Trop. septiembre de 1996; 62 (1) : 2344) . El diagnïstico de una infecciïn por anquilostoma normalmente se realiza siguiendo el procedimiento de flotaciïn fecal, que implica obtener una muestra fecal del animal que se diagnostica e inspeccionarla visualmente por microscopio para huevos de anquilostoma. Sin embargo, este procedimiento de diagnïstico microscïpico requiere tiempo y requiere equipo especializado. Ademïs, la exactitud del diagnïstico usando este procedimiento es altamente dependiente de la habilidad y experiencia del profesional clïnico que realiza la inspecciïn. (Por ejemplo, un ojo inexperto frecuentemente confundirï huevos de otros nematodos parasitarios con los de anquilostoma y viceversa.) Esta posibilidad de diagnïstico errïneo es desafortunada debido a que a un animal errïneamente diagnosticado puede dïrsele un tratamiento que es ineficaz contra anquilostoma y por tanto no se aliviarïa el sufrimiento del animal o no se detendrïa el debilitamiento progresivo de su salud.

Otra limitaciïn significativa del diagnïstico por detecciïn microscïpica de huevos es que debido a que los huevos de anquilostoma generalmente no son detectables en heces del portador hasta mucho despuïs de manifestarse la infecciïn, ello no permite una detecciïn temprana de la infecciïn por anquilostoma. Por ejemplo, los huevos de anquilostoma generalmente no aparecen en las heces caninas hasta aproximadamente 17 dïas despuïs de la ingestiïn por vïa oral del parïsito por el can. Esto es un problema debido a que sïntomas tales como pïrdida grave de peso y diarrea hemorrïgica frecuentemente hacen sufrir al portador antes de que los huevos de anquilostoma aparezcan por primera vez en las heces. Por tanto la detecciïn temprana es altamente deseable.

Por estos motivos, sigue habiendo grandes posibilidades de desarrollo de un dispositivo, kit y procedimiento que pueda usarse para diagnosticar correctamente a un animal como que tiene o no tiene una infecciïn por anquilostoma, especïficamente, a diferencia de una infecciïn por nematodos, generalmente. Tambiïn sigue habiendo grandes 45 posibilidades de un dispositivo y procedimiento tales que puedan usarse para hacer este diagnïstico pronto despuïs de infectarse el animal. Ademïs, es deseable tener un dispositivo y procedimiento tales adecuados para detectar anquilostoma en una muestra de animal que sea fïcilmente obtenible. Una muestra particularmente conveniente es heces debido a que a diferencia de la sangre, por ejemplo, las heces son rïpidamente excretadas por los animales. La capacidad para usar una muestra de animal que se obtiene fïcilmente obviarïa la necesidad de transportar el animal, que en algunos casos puede estar demasiado enfermo para viajar, a un profesional veterinario para la recogida de la muestra, tal como puede necesitarse cuando debe recogerse, por ejemplo, sangre.

Dado que el dispositivo, kit y procedimiento necesarios deben poder detectar la presencia o confirmar la ausencia de anquilostoma en un animal si estïn o no organismos de anquilostoma, incluyendo huevos de anquilostoma, en la 55 muestra de prueba tomada del animal, el dispositivo y procedimiento deben tener como objetivo el nivel molecular. En particular, el dispositivo, kit y procedimiento pueden ser un dispositivo y procedimiento basados en anticuerpos que son capaces de detectar la presencia o ausencia de antïgenos especïficos de anquilostoma. Aunque generalmente existen estrategias basadas en anticuerpos para detectar antïgenos de nematodos, ninguna ha permitido especïficamente la detecciïn temprana de, o confirmaciïn de la ausencia de, anquilostoma en una muestra fecal de un animal que tambiïn puede infectarse por uno o mïs de ascïride, tricocïfalo, cïstodo y gusano del corazïn.

A partir del documento US 2004/214244 se conoce un procedimiento general para la detecciïn de una infecciïn por gusano parasitario. No se describe antïgeno especïfico para anquilostoma. Lo mismo es cierto para el documento WO 03/032917 y para Jones y col., Drug Discover y Today: Disease Mechanismus, Elsevier, vol. 1, n.ï: 2, 1 de noviembre de 65 2004, pïginas 217-222, que no desvelan un antïgeno de diagnïstico especïfico, sino que se refieren solo a vacunaciïn.

Por tanto lo que se necesita es un dispositivo, kit y procedimiento para probar una muestra fecal de un animal para determinar si el animal estï infectado por anquilostoma. El dispositivo, kit y procedimiento necesarios deben adicionalmente poder detectar especïficamente la presencia o ausencia de anquilostoma en un animal tanto si estïn presentes como si no huevos de anquilostoma en las heces del animal. Incluso ademïs, el dispositivo, kit y

procedimiento necesarios deben poder detectar especïficamente anquilostoma en una muestra fecal que tambiïn puede incluir uno o mïs de ascïride, tricocïfalo, cïstodo y gusano del corazïn.

Sumario de la invenciïn La presente invenciïn se basa en parte en el descubrimiento de propiedades inesperadas de un anticuerpo policlonal. Especïficamente, se determinï que un anticuerpo policlonal producido contra proteïna 5 secretada de Ancylostoma de Ancylostoma caninum de anquilostomas (ASP5) puede usarse para capturar y detectar la presencia de coproantïgenos de anquilostoma en un animal canino tan pronto como entre nueve dïas y 13 dïas despuïs de que el can se haya infectado por anquilostoma. Antes de la presente invenciïn no se sabïa si cualquier proteïna de nematodos parasitarios aparecïa o no en las heces de un portador canino antes de la apariciïn de los huevos de nematodos. La capacidad de la presente invenciïn para detectar la proteïna ASP5 tan rïpidamente despuïs de que la infecciïn se introduzca al portador es interesante debido a que significa que los coproantïgenos de anquilostoma reconocidos por el anticuerpo policlonal aparecen en las heces del portador antes de que cualquier anquilostoma completo, incluyendo huevos de anquilostoma, aparezca en las heces. El procedimiento de detecciïn se define como se ha descrito en las reivindicaciones de procedimiento adjuntas.

Ademïs, se determinï que el mismo anticuerpo policlonal puede usarse para capturar y detectar la presencia o ausencia de coproantïgenos de anquilostoma en animales que tambiïn estïn infestados por uno o mïs de ascïride, tricocïfalo, cïstodo y gusano del corazïn. Esta especificidad por anquilostoma es sorprendente debido a que los anquilostomas,

ascïrides, tricocïfalos y gusanos del corazïn son todos nematodos relacionados y cabrïa esperar que un anticuerpo policlonal producido contra una proteïna particular de uno cualquiera de estos gusanos reaccionara de forma cruzada con uno o mïs de los otros gusanos. La invenciïn incluye condiciones de ensayo segïn las que este anticuerpo policlonal puede usarse para capturar y detectar especïficamente la presencia o ausencia de coproantïgenos de anquilostoma en animales, incluyendo en animales tambiïn infestados por uno o mïs de ascïride, tricocïfalo, cïstodo y gusano del corazïn.

La invenciïn, en un aspecto, es un dispositivo para detectar la presencia o ausencia de coproantïgeno de anquilostoma, como se describe en las reivindicaciones de dispositivo adjuntas. La invenciïn proporciona ademïs un dispositivo tal... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de detecciïn de la presencia o ausencia de antïgeno de anquilostoma en una muestra fecal de un mamïfero que comprende:

a. poner en contacto la muestra fecal con uno o mïs anticuerpos especïficos para proteïna 5 secretada por Ancylostoma de Ancylostoma caninum de anquilostomas (ASP5) ; y

b. detectar la presencia o ausencia de uno o mïs antïgenos de anquilostoma o uno o mïs complejos de anticuerpo/antïgeno de anquilostoma.

2. El procedimiento de la reivindicaciïn 1, en el que los uno o mïs anticuerpos son policlonales.

3. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el mamïfero es un can.

4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra fecal estï sustancialmente libre de

huevos de anquilostoma y la muestra fecal es excretada por el mamïfero despuïs de que el mamïfero se infecte por anquilostoma.

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la muestra fecal es excretada por el mamïfero no mïs de 13 dïas despuïs de de que el mamïfero se haya infectado por anquilostoma.

6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que los uno o mïs anticuerpos especïficos para ASP5 no son capaces de detectar uno o mïs coproantïgenos seleccionados del grupo que consiste en ascïride, tricocïfalo, cïstodo y gusano del corazïn.

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la detecciïn de la presencia o ausencia de uno o mïs complejos de anticuerpo/antïgeno incluye la etapa de proporcionar un anticuerpo secundario que se une al uno o mïs complejos de anticuerpo/antïgeno, preferentemente el anticuerpo secundario estï marcado.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que uno o mïs de los uno o mïs anticuerpos estïn marcados.

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que los uno o mïs anticuerpos se inmovilizan sobre un soporte sïlido.

10. El procedimiento de la reivindicaciïn 9, en el que el soporte sïlido forma parte de un dispositivo de ensayo de inmunoabsorciïn enzimïtica, preferentemente un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral.

11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende ademïs la etapa de aplicar la muestra a uno o mïs reactivos para detectar uno o mïs del grupo que consiste en: uno o mïs parïsitos no anquilostomas, uno o mïs parïsitos no gusanos, uno o mïs virus y una o mïs bacterias.

12. El procedimiento de la reivindicaciïn 11, en el que los uno o mïs reactivos estïn seleccionados del grupo que consiste en uno o mïs anticuerpos o uno o mïs antïgenos reconocidos por anticuerpos especïficos para los uno o mïs parïsitos gusanos no anquilostoma, los uno o mïs parïsitos no gusanos, los uno o mïs virus o las una o mïs bacterias.

13. Un dispositivo para detectar la presencia o ausencia de antïgeno de anquilostoma en una muestra fecal de un mamïfero, comprendiendo el dispositivo un soporte sïlido, en los que uno o mïs anticuerpos especïficos para proteïna 5 secretada de Ancylostoma de Ancylostoma caninum de anquilostomas (ASP5) se inmovilizan sobre el soporte sïlido.

14. El dispositivo de la reivindicaciïn 13, en el que los uno o mïs anticuerpos son policlonales.

15. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14, en el que los uno o mïs anticuerpos especïficos para anquilostoma ASP5 no son especïficos para uno o mïs coproantïgenos seleccionados del grupo que consiste en ascïride, tricocïfalo, cïstodo y gusano del corazïn.

16. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que uno o mïs de los uno o mïs anticuerpos estïn marcados.

17. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que el dispositivo es un dispositivo de inmunoabsorciïn enzimïtica, preferentemente un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral.

18. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en el que el dispositivo incluye adicionalmente uno o mïs reactivos para la detecciïn de uno o mïs del grupo que consiste en uno o mïs parïsitos gusanos no anquilostoma, uno

o mïs parïsitos no gusanos, uno o mïs virus y una o mïs bacterias, dichos uno o mïs reactivos seleccionados del

grupo que consiste en uno o mïs anticuerpos o uno o mïs antïgenos reconocidos por anticuerpos especïficos para uno o mïs parïsitos no gusanos, uno o mïs virus y una o mïs bacterias.

19. Un kit para la detecciïn de uno o mïs coproantïgenos de anquilostoma en una muestra fecal de un mamïfero, comprendiendo el kit el dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 13-18 y uno o mïs reactivos suficientes para la detecciïn de los uno o mïs antïgenos.

20. El kit de la reivindicaciïn 19, en el que los uno o mïs reactivos estïn seleccionados del grupo que consiste en uno o mïs reactivos indicadores, uno o mïs compuestos de marcado de anticuerpos, uno o mïs anticuerpos, uno o mïs reactivos de captura de antïgenos, uno o mïs inhibidores y uno o mïs reactivos de lavado.