Diferenciación de las células madre de embriones humanos.

Un método para diferenciar células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático

, que incluye los siguientes pasos:

a. cultivo de las células madre pluripotentes,

b. diferenciación de las células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo, cultivando las células madre pluripotentes en un medio definido químicamente que comprende un medio complementado con B27 y que trata las células pluripotentes con activina A,

c. diferenciación de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo a células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático, tratando las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo con por lo menos un factor del crecimiento fibroblástico, o con ácido retinoico y por lo menos un factor de crecimiento fibroblástico y

d. diferenciación de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático a células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático, tratando las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático con un inhibidor de la secretasa gamma.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2008/070418.

Solicitante: LIFESCAN, INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 1000 GIBRALTAR DRIVE MILPITAS, CA 95035 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: Rezania,Alireza.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > C12N5/00 (Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/071 (Células o tejidos de vertebrados, p.ej. células o tejidos humanos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/074 (Células madre adultas)

PDF original: ES-2537578_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Diferenciación de las células madre de embriones humanos ÁMBITO DE LA INVENCIÓN

Esta es, en parte, la continuación de la solicitud de EE.UU. n° 11/736.98, presentada el 18 de abril del 27 que reclama la prioridad para: la solicitud provisional de EE.UU. n° 5/745.899, presentada el 28 de abril del 26; la solicitud provisional de EE.UU. n° 5/827.695, presentada el 3 de abril del 26 y la solicitud provisional de EE.UU. n° 5/882.67, presentada el 29 de diciembre del 26.

La presente Invención se refiere a los métodos para promover la diferenciación de las células madre pluripotentes. La presente Invención se refiere, en particular, al método mejorado para la formación del endodermo pancreático, de células que expresan la hormona pancreática y de la hormona pancreática que segrega células. La presente invención se refiere también a los métodos para promover la diferenciación de las células madre pluripotentes, sin hacer uso de una monocapa sustentadora celular.

ANTECEDENTES

Los avances en la terapia de sustitución celular para la diabetes mellitus tipo 1 y la escasez de islotes de Langerhans trasplantares han hecho que el Interés se centre en el desarrollo de fuentes de células productoras de insulina o de células R, apropiadas para los injertos. Una manera de enfocarlo consiste en la generación de células B funcionales a partir de células madre pluripotentes como, por ejemplo, células madre embrionarias.

En el desarrollo vertebrado embrionario, una célula pluripotente da lugar a un grupo de células compuestas de tres capas germinales (ectodermo, mesodermo y endodermo) en un proceso conocido como gastrulación. Tejidos como, por ejemplo, el tiroides, el timo, el páncreas, el intestino y el hígado se desarrollarán a partir del endodermo, a través de una etapa intermedia. La etapa intermedia en este proceso consiste en la formación de un endodermo definitivo. Las células del endodermo definitivo expresan un número de marcadores como, por ejemplo, HNF-3 beta, GATA4, Mixll, CXCR4 y Sox-17.

La formación del páncreas surge de la diferenciación del endodermo definitivo en el interior del endodermo pancreático. Las células del endodermo pancreático expresan el gen Pdx1 de la homeosecuencla pancreático duodenal. En ausencia de Pdx1, el páncreas no consigue desarrollar la formación de esbozos ventrales ni dorsales. Por tanto, la expresión de Pdx1 marca una fase crítica en la organogénesis pancreática. El páncreas maduro contiene tejido exocrino y tejido endocrino, entre otros tipos de células. Ambos tejidos surgen de la diferenciación del endodermo pancreático.

Las células que soportan las propiedades de los islotes se han derivado, según se informa, de células embrionarias del ratón. Por ejemplo, Lumelsky y otros autores (Science 292,1.389, 21) señalan que la diferenciación de las células madre de embriones de ratón en estructuras secretoras de insulina es similar a la de los islotes pancreáticos. Soria y otros autores (Diabetes 49, 157, 2) señalan que las células secretoras de insulina derivadas de las células madre de embriones de ratón normalizan la glucemia en ratones sometidos a la diabetes inducida por estreptozotocina.

En un ejemplo, Hori y otros autores (PNAS, 99-16.15, 22) divulgan que el tratamiento de las células madre de embriones de ratón con inhibidores de fosfoinositido 3-quinasa (LY2942) produjo células que se parecían a las células (í.

En otro ejemplo, Blyszczuk y otros autores (PNAS, 1-998, 23) señalan que la generación de células productoras de insulina a partir de células madre de embriones de ratón expresan, constitutivamente, el Pax4.

Micallef y otros autores señalan que el ácido retinoico puede regular la implicación de las células madre embrionarias en la formación de endodermos de Pdx1 pancreático positivos. El ácido retinoico es el más efectivo a una expresión inducida de Pdx1 cuando se añade a cultivos en el día 4 de la diferenciación de la célula madre embrionaria, durante un período que se corresponde con el final de la gastrulación en el embrión (Diabetes 54-31, 25).

Miyazaki y otros autores señalan que una línea de células madre de embrión de ratón sobre expresa el Pdx1. Sus resultados muestran que la expresión exógena de Pdx1 potencia claramente la expresión de los genes de la insulina, somatostatina, glucoquinasa, Neurogenin 3, P48, Pax6 y HNF-6 en las células diferenciadas resultantes (Diabetes 53-1.3, 24).

Skoudy y otros autores señalan que la activina A (miembro de la superfamilia TGFI3) activa la expresión de los genes exocrinos pancreáticos (p48 y amilasa) y de los genes endocrinos (Pdx1, insulina y glucagón) en células madre de

embrión de ratón. Se observó que se alcanzaba el máximo efecto utilizando para ello la actlvlna A InM. También observaron que la expresión del nivel de Insulina y de mRNA de Pdx1 no se veían afectados por el ácido retinoico; sin embargo, el tratamiento con FGF7 de 3nM dio como resultado un incremento en el nivel de la transcripción Pdx1 (.Biochem, J. 379-749, 24).

Shiraki y otros autores estudiaron los efectos de los factores de crecimiento que potencian, específicamente, la diferenciación de las células madre embrionarias en el interior de las células de Pdx1 positivas. Observaron que la reproducibilidad de TGFI32 producía una mayor proporción de células de Pdx1 positivas (Genes Cells, Jun. 25; 1(6)-53-16).

Gordon y otro autores demostraron la Inducción de Brachyury+/HNF-3beta+ células del endodermo a partir de células madre de embriones de ratón, en ausencia de suero y en presencia de actlvlna, junto con un Inhibidor de señalización de Wnt (EE. UU. 26/3446A1).

Gordon y otro autores (PNAS, vol. 13, página 16.86, 26) manifiestan que "se requirieron, simultáneamente, Wnt y TGFU/Nodal/señallzaclón de actlvlna para la generación de la anterior línea primitiva".

Sin embargo, el desarrollo del modelo de células madre de embriones de ratón puede no mlmetlzar exactamente el programa de desarrollo en mamíferos superiores como, por ejemplo, los seres humanos.

Thomson y otros autores aislaron las células madre embrionarias de los blastocltos humanos (Science 282,114, 1998). Al mismo tiempo, Gearhart y sus colaboradores derivaron gérmenes embrionarios humanos (hEG) y líneas celulares a partir del tejido gonadal fetal (Shamblott y otros autores, Proc. Nati. Acad. Sci, EE. UU. 95, 13.726, 1998). A diferencia de las células madre de embriones de ratón a las que se les Impidió la diferenciación simplemente mediante el cultivo con el factor inhibidor de la leucemia (LIF), las células madre de embriones humanos deben conservarse bajo unas condiciones muy especiales (Pat. de EE. UU. n° 6.2.86; WO 99/2.741; WO 1/51.616).

D'amour y otros autores describen la producción de cultivos enriquecidos con células madre de embriones humanos derivadas del endodermo definitivo, en presencia de una elevada concentración de actlvlna y baja de suero (D'amour KA y otros autores, 25). Trasplantar estas células bajo la cápsula renal de los ratones dio como resultado la diferenciación en el interior de más células maduras con las características de algunos órganos endodérmicos. Las células madre de embriones humanos derivadas de las células del endodermo definitivo pueden diferenciarse mejor en el interior de células de Pdx1 positivas tras la adición de FGF1 (EE. UU. 25/266554A1)

D'amour y otros autores (Nature Biotechnology-24, 1.392-1.41 (26) manifiestan:" hemos desarrollado un proceso de diferenciación que convierte las células madre de embriones humanos (hES) en células endocrinas capaces de sintetizar las hormonas pancreáticas: insulina, glucagón, somatostatina, polipéptido pancreático y grellna. Este... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para diferenciar células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático, que incluye los siguientes pasos:

a. cultivo de las células madre pluripotentes,

b. diferenciación de las células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo, cultivando las células madre pluripotentes en un medio definido químicamente que comprende un medio complementado con B27 y que trata las células pluripotentes con activina A,

c. diferenciación de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo a células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático, tratando las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo con por lo menos un factor del crecimiento fibroblástico,

con ácido retinoico y por lo menos un factor de crecimiento fibroblástico y

d. diferenciación de las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático a células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático, tratando las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático con un inhibidor de la secretasa gamma.

2. El método de la reivindicación 1, cuando las células madre pluripotentes se cultivan en un medio definido químicamente que comprende DMEM-F12 complementado con B27 y activina A.

3. El método de la reivindicación 1, cuando el paso (b) también incluye el prensado de las células madre pluripotentes en un sustrato de cultivo de tejido recubierto con una matriz extracelular.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde B27 se usa a una concentración de aproximadamente

1 %.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde B27 se usa a una concentración de aproximadamente 1 %.

6. El método de la reivindicación 1, donde el paso de la diferenciación de las células madre pluripotentes a células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se consigue por un método que comprende los pasos:

a. prensado de las células madre pluripotentes en un sustrato de cultivo de tejido recubierto con una matriz extra celular,

b. cultivo de las células madre pluripotentes con activina A y un ligando de Wnt en un primer medio de cultivo complementado con B27 y

c. cultivo de las células madre pluripotentes con activina A en un segundo medio de cultivo complementado con B27.

7. El método de la reivindicación 1, donde el paso de diferenciación de las células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos del linaje de endodermo definitivo se consigue por un método que también incluye el prensado de las células madre pluripotentes en una capa de distribuidor fibroblástico.

8. El método de la reivindicación 7, donde las células madre pluripotentes se cultivan en un medio definido químicamente que comprende DMEM-F12 complementada con B27, un ligando de Wnt y activina A.

9. El método de la reivindicación 7, donde las células madre pluripotentes se cultivan en un medio definido químicamente que comprende DMEM-LG complementado con B27, un ligando Wnt y activina A.

1. Un método para diferenciar células madre pluripotentes a células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático, que comprende los siguientes pasos:

a. cultivo de las células madre pluripotentes en un medio definido químicamente que comprende un medio complementado con B27,

b. diferenciación de las células madre pluripotentes en células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo, tratando las células pluripotentes con activina Ay

c. diferenciación de las células que expresan los marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo a células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático, tratando las células que expresan marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo con por lo menos un factor de crecimiento fibroblástico, o con ácido retinoico y por lo menos un factor de crecimiento fibroblástico.

11. Un método para diferenciar células madre pluripotentes a células que expresan marcadores que son característicos del linaje endodérmico definitivo, que comprende los siguientes pasos:

a. prensado de las células madre pluripotentes en un sustrato de cultivo de tejido recubierto con una matriz extracelular y

b. cultivo de las células madre pluripotentes en un medio definido químicamente que incluya un medio complementado con B27 y tratamiento de las células pluripotentes con activina A.

12. El método de la reivindicación 11, donde las células madre pluripotentes se cultiven en un medio definido químicamente que comprenda DMEM-F12 complementado con B27, un ligando Wnt y activina A.

13. El método de la reivindicación 11, donde las células madre pluripotentes se cultiven en un medio definido 5 químicamente que comprenda DMEM-LG complementado con B27, un ligando Wnt y activina A.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, donde el B27 se use a una concentración de aproximadamente ,5 % a aproximadamente 1 %.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, donde el B27 se use a una concentración de

aproximadamente 1 %.

16. El método de la reivindicación 1 o reivindicación 11, donde el paso de la diferenciación de las células madre pluripotentes a células que expresen marcadores característicos del linaje endodérmico definitivo se consigue por un 15 método que también incluye el prensado de células madre pluripotentes en una capa de administración de fibroblasto.