MÉTODO PARA EL DIAGNÓSTICO DE VERTICILOSIS EN EL OLIVO.

Método para el diagnóstico de verticilosis en el olivo.

La presente invención se refiere a una secuencia de nucleótidos aislada del genoma del olivo que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 2

, y que se sobreexpresa en respuesta a una infección por Verticillium spp. Por lo tanto, la invención se relaciona con un método para detectar la presencia de Verticillium spp. en un olivo que comprende determinar el nivel de expresión de dicha secuencia de nucleótidos o el nivel de proteína codificada por dicha secuencia en una muestra procedente de dicho olivo y, si dicha expresión es mayor que un valor de referencia, entonces se puede concluir que el olivo está infectado con Verticillosis spp., diagnosticando así verticilosis.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201331633.

Solicitante: UNIVERSIDAD DE JAEN.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: LUQUE VAZQUEZ,FRANCISCO, MERCADO BLANCO,JESUS, BARROSO ALBARRACÍN,Juan Bautista, LEYVA PÉREZ,Maria De La O.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)

PDF original: ES-2535577_A2.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

La presente invención se refiere a una secuencia de nucleótidos del genoma del olivo y su uso en el diagnóstico de verticilosis. Por lo tanto, la presente invención se engloba dentro del campo fitosanitario.

ESTADO DE LA TÉCNICA

El estado fitosanitario del olivar andaluz se enfrenta al reto del importante avance que la Verticilosis está teniendo en los últimos años. La pérdida de árboles por enfermedades producidas por patógenos del suelo, como la mencionada Verticilosis, causada por el hongo VerticilJium dahliae, o la denominada "seca" producida por

especies del género oomiceto Phytophthora, supone un coste importante para muchas explotaciones. No se dispone de métodos de detección precoz de estas enfermedades y, una vez producidas, determinar cuál ha sido el agente infeccioso es demasiado complejo como para que en la práctica se utilice de forma rutinaria. De esta forma lo más habitual es que cuando en una plantación se produce la pérdida de un olivo (si bien es más frecuente la afectación de varios) por alguna de estas patologías caracterizadas por síndromes parecidos y fácilmente confundibles, no se determine el agente causal de la enfermedad.

Evidentemente, la ausencia de un diagnóstico exacto impide la correcta evaluación de las causas y la toma adecuada de soluciones. Sin embargo, aun siendo importante determinar la causa por la que se secan los árboles en plantaciones afectadas, más importante aún es evitar la diseminación de material de plantación afectado aunque asintomático, ya que pueden estar introduciendo en nuevas plantaciones inóculos de los agentes etiológicos de estas enfermedades. Teniendo en cuenta la preocupante expansión actual de la Verticilosis deberían extremarse las medidas para evitar la diseminación del patógeno a zonas no afectadas. En este sentido la calidad fitosanitaria de los plantones suministrados por los viveristas debería estar certificada mediante métodos diagnósticos fiables y lo suficientemente sencillos como para utilizarse de forma rutinaria en los árboles/plantones aparentemente sanos antes de ser vendidos a los agricultores. De hecho, esta necesidad se encuentra plasmada en el Real Decreto 1678/1999 , de 29 de octubre, por el que se modifica el Real Decreto 929/1995, de 9 de junio, por el que se aprueba el Reglamento técnico de control y certificación de plantas de vivero de frutales, Disposición Transitoria Única: Plantas madre de olivo, se determinan los patógenos para los que debe certificarse que las plantas de viveros están libres: Hongos: Verticillium dahliae; Bacterias: Pseudomonas savaslanoi (Tuberculosis) ; Virosis o similares: Mosaico del Arabis (ArMv) , Enrollado del ciruelo (CLRV) , Mosaico del pepino (CMV) y Virus latente de las manchas anulares de la fresa (SLRV) .

No obstante, en la actualidad es difícil para los viveristas garantizar que las plantas que suministran están realmente libres de patógenos, especialmente en el caso de Verticillium dahliae. Esto se debe a que los métodos diagnósticos que existen necesitan de laboratorios muy especializados, son caros y no garantizan la detección precoz de la enfermedad, por lo que plantas aparentemente sanas, pero infectadas, pueden estar siendo distribuidas y contribuyendo a la dispersión de la enfermedad.

Estos métodos están basados en la identificación del patógeno en medios de cultivo, o en procedimientos moleculares basados en distintos protocolos de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa ("polymerase chain reaction", PCR) (MercadoBlanco el al., 2001 .Plant Pathol. 50:609-619; Mercado-Blanco el al., 2002. European Journal of Plant Pathology 108: 1-13; Mercado-Blanco, J. el al. 2003. Plant Dis.

87:1487-1494; Morera, B., Páez, JI. , Vega JM., and Montes F. 2005. Comparación de métodos de diagnóstico de VerticilJium dahliae en olivo: Aislamiento en medio de cultivo y PCR. Bol. San. Veg. Plagas, 31 :267-275; Collado-Romero et al., 2009. Plant Pathology 58:515-526; López-Escudero, F.J. y Mercado-Blanco, J. 2011 . Plant Soil,

344: 1-50) . Entre las limitaciones de la PCR está el hecho de que en las épocas en las que el hongo no es activo, como son el verano y el invierno, suelen dar falsos negativos (Morera el al. 2005, citado ad supra ) , además de que al tratarse de procedimientos de PCR-"NESTED" (PCR secuencial o anidada) , altamente sensible pero también fácilmente contaminable, supone una complicación más para su uso generalizado ya que se requiere de laboratorios especializados y personal con experiencia. En cuanto al diagnóstico/detección por métodos tradicionales (aislamiento e identificación en medios de cultivo microbiológicos) , a pesar de ser de más fácil implementación, es más lento, ocasionalmente inconsistente, y ofrece resultados menos sensibles que la PCR. Por lo tanto, podemos concluir que el requerimiento de laboratorios especializados y personal cualificado para realizar el

diagnóstico de la verticilosis hace que en la práctica no se esté utilizando de forma habitual ningún método diagnóstico.

Por lo tanto, existe en el estado de la técnica la necesidad de desarrollar nuevos métodos de diagnóstico de verticilosis que solventen los inconvenientes anteriormente mencionados.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

Los inventores de la presente invención han descubierto que cuando un olivo es infectado por Verlicillium spp., el agente causal de la verticilosis, se produce una 10 alteración en el perfil de expresión génica del olivo, en particular, se produce la sobreexpresión de un gen no descrito previamente en el estado de la técnica y que ha sido identificado en la presente invención como contig_172143. Para ello, los inventores realizaron un estudio transcriptómico de plantas de olivo en condiciones de estrés e inoculadas con Verlicillium dahliae mediante la secuenciación del ARN total 15 del olivo de estudio, y seleccionaron un ARN mensajero (ARNm) cuya expresión solo se observa en plantas inoculadas con V. dahliae (Ejemplo 1) . El ADN complementario (ADNc) correspondiente a dicho ARNm se denominó contig_172143 y presenta la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEO ID NO: 1. Por otro lado, la traducción de dicha secuencia de ARNm corresponde con una proteína que presenta la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEO ID NO: 2.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un marcador genético que permite detectar una infección por Verlicillium spp. en el olivo, permitiendo a su vez el diagnóstico de la verticillosis mucho antes de que aparezcan los primeros síntomas 25 asociados a dicha infección o cuando dicha infección está latente. Basado en este descubrimiento, los inventores han desarrollado un método de diagnóstico de la verticilosis en el olivo que solventa todos los inconvenientes que existen en el estado de la técnica , pues dicho método es más sensible y más rápido que los métodos tradicionales de cultivo del microorganismo, permite una detección precoz de Verlicillium spp. (es decir, permite su detección en plantas asintomáticas) evitando así la diseminación del material infectado y evita la aparición de falsos negativos debido a que es posible detectar la presencia de Verlicillium spp. e incluso cuando el hongo está inactivo.

A continuación, se describe en detalle el método de diagnóstico desarrollado, así como otros aspectos inventivos derivados del mismo.

Secuencia de nucleótidos de la invención y sus usos Tal como se ha explicado previamente, los inventores de la presente invención han descubierto que cuando una planta es infectada por VerticilJium spp., se produce la sobreexpresión de un nuevo gen, cuyo cONA se ha denominado contig_172143 (SEQ ID NO: 1) , y que codifica para una proteína que presenta la secuencia SEO ID... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una secuencia de nucleótidos aislada que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de identidad con la 5 secuencia SEO ID NO: 2.

2. Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos tiene al menos un 95%, en particular al menos un 98%, más en particular, al menos un 99% de identidad con la secuencia SEO ID NO: 2.

3. Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 2, en el que la secuencia de aminoácidos tiene un 100% de identidad con la secuencia SEO ID NO: 2.

4. Secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que 15 la secuencia de nucleótidos es ARN .

5. Secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la secuencia de nucleótidos es ADNc.

6. Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 5, en el que el ADNc comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 95%, preferiblemente, al menos un 98%, más preferiblemente al menos un 99% de identidad con la secuencia SEO ID NO: 1.

7. Secuencia de aminoácidos según la reivindicación 6, en el que el ADNc comprende una secuencia de nucleótidos que tiene un 100% de identidad con la secuencia SEO ID NO: 1.

8. Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 6 ó 7, en el que el ADNc

comprende una secuencia de nucleótidos que comprende covalentemente unida a su extremo 5' la secuencia SEO ID NO: 3 y/o operativamente unida a su extremo 3' la secuencia SEO ID NO: 4.

9. Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 8, en el que el ADNc comprende una secuencia de nucleótidos SEO ID NO: 5.

10. Una construcción génica que comprende una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, operativa mente unida a una secuencia reguladora de la expresión heteróloga respecto a la secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

. Un vector que comprende una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, o una construcción génica según la reivindicación 10.

12. Una célula que comprende una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, una construcción génica según la reivindicación 10, o un vector según la reivindicación 11 .

13. Una planta que comprende una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, una construcción génica según la reivindicación 10, un vector 15 según la reivindicación 11 o una célula según la reivindicación 12.

14. Una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9

15. Secuencia de aminoácidos según la reivindicación 14, en el que dicha secuencia comprende la secuencia de aminoácidos SEO ID NO: 2.

16. Uso in vitro de una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, una construcción génica según la reivindicación 10, un vector

según la reivindicación 11 o una secuencia de aminoácidos según la reivindicación 14 ó 15 como marcador de diagnóstico para la verticilosis del olivo.

17. Uso según la reivindicación 16, en el que la verticilosis del olivo es causada por

una infección de Verticilium sPP., en particular, por una infección de Verlicillium 30 dahliae.

18. Uso según la reivindicación 16 ó 17, en el que la secuencia de nucleótidos está sobreexpresada respecto a un valor de referencia, o la secuencia de aminoácidos está en una alta concentración respecto a un valor de referencia.

19. Un método in vitro para detectar la presencia de VerticiJIium spp. en un olivo que comprende: a) determinar el nivel de expresión de una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o el nivel de la secuencia de aminoácidos según la

reivindicación 14 ó 15, en una muestra biológica procedente de dicho olivo; y b) comparar el nivel de expresión obtenida en el apartado a) con un valor de referencia.

20. Método según la reivindicación 19, en el que si el nivel de expresión obtenido en el

apartado a) es mayor que el valor de referencia, o el nivel de la secuencia de aminoácidos es mayor que un nivel de referencia, entonces el olivo está infectado por VerticiJIium spp., en particular, Verticillium dahliae.

. Método según la reivindicación 19 ó 20, en el que la muestra biológica procede de 15 una hoja, del tronco, de la corteza o de la raiz del olivo.

22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 , en el que el nivel de expresión de la secuencia de nucleótidos se determina midiendo la cantidad de ARNm

o ADNc.

23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, en el que el nivel de expresión de la secuencia de nucleótidos se lleva a cabo mediante northern blotting o PCR cuantitativa.

24. Método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, en el que el nivel de la secuencia de aminoácidos se lleva a cabo mediante Western blotting.

25. Un kit que comprende Una pareja de cebadores especificos para amplificar una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, Una sonda de ácido nucleico diseñada de forma específica para hibridar con una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, y/o Un anticuerpo específico de la proteína codificada por una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

26. Kit según la reivindicación 25, en el que la pareja de cebadores comprende un cebador directo que comprende la secuencia de nucleótidos SEO ID NO: 6 y un cebador inverso que comprende la secuencia de nucleótidos SEO ID NO: 7.

27. Uso de un kit según la reivindicación 25 o 26 para detectar la presencia de Verticillium spp. en un olivo, en particular, de Verticillium dahliae.