Método para el diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa.

Un método para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer, que comprende medir el nivel de expresión de la proteína mutante S-transferasa de glutatión A140D identificada por el nº de orden P78417 de SwissProt en una muestra de plaquetas aisladas a partir de una persona sospechosa de tener la enfermedad de Alzheimer,

y determinar si el nivel de expresión está alterado en comparación con un control, en donde un nivel de expresión reducido cuando se compara con un control sano sin la enfermedad, de la proteína mutante S-transferasa de glutatión A140D identificada por el nº de orden P78417 de SwissProt, indica que existe un riesgo de enfermedad de Alzheimer.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10183043.

Solicitante: RANDOX LABORATORIES LTD..

Nacionalidad solicitante: Reino Unido.

Dirección: Ardmore, Diamond Road Crumlin, Co. Antrim, Northern Ireland, BT29 4QY REINO UNIDO.

Inventor/es: ZELLNER,MARIA, OEHLER,RUDOLF.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K14/47 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de mamíferos.
  • C12Q1/68 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • G01N33/68 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos.

PDF original: ES-2533086_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Método para el diagnóstico de una enfermedad neurodegenerativa Campo de la invención Esta invención se refiere a un método para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer.

Antecedentes de la invención Las enfermedades neurodegenerativas están aumentando drásticamente. Los datos sugieren que los problemas sanitarios neuronales se encuentran entre los factores que más contribuyen a la carga mundial de enfermedad y discapacidad.

Los marcadores diagnósticos para trastornos neurológicos son especialmente importantes en el diagnóstico temprano en el curso de la enfermedad, cuando los compuestos terapéuticos tienen mayor efecto potencial, pero un diagnóstico exacto es difícil. Se dispone de pocos marcadores diagnósticos para trastornos neuronales en estadio temprano; los que están disponibles se basan en el análisis de material de una muestra (por ejemplo, líquido cefalorraquídeo) , cuya obtención es difícil y dolorosa. Por lo tanto, la caracterización de marcadores diagnósticos que son detectables en la sangre periférica es de gran importancia. Tales marcadores periféricos permitirían la detección preventiva de una población en riesgo.

La enfermedad de Alzheimer es la principal causa de demencia en los países industrializados. En una menor parte de los casos hay una clara historia familiar, con mutaciones autosómicas en el gen de la proteína precursora de amiloide. Sin embargo, la mayoría de los pacientes con enfermedad de Alzheimer no tienen una historia familiar obvia y se clasifican como con enfermedad de Alzheimer esporádica. La etiología de la enfermedad de Alzheimer esporádica se desconoce en gran parte (Blennow K y VanMechelen E, J. Neural. Transm. Suppl. 1998; 53:223-35) .

Actualmente, la enfermedad de Alzheimer se diagnostica principalmente por la exclusión de otras causas conocidas de demencia. El diagnóstico en un estadio temprano antes de que tengan lugar cambios irreversibles es prácticamente inexistente. Sin embargo, la terapia farmacéutica es probablemente la más eficaz al principio en el curso de la enfermedad, antes de que la neurodegeneración sea demasiado grave y generalizada. Por lo tanto, existe una gran necesidad de marcadores diagnósticos mínimamente invasivos para el diagnóstico temprano en el curso de la enfermedad.

Cattabeni et al (2004. Progress in Neuro-psychopharmacology & Biological Psychiatr y 28 (5) :763-770) describen que las plaquetas expresan y procesan la proteína precursora de amiloide (APP) de una manera similar a la observada en el cerebro.

El documento de solicitud de patente de Estados Unidos US 2003/0064411 describe la reducción de la expresión de la proteína S-transferasa de glutatión identificada por el nº de orden P78417 de SwissProt en tejidos cerebrales obtenidos a partir de pacientes que padecen la enfermedad de Alzheimer.

Compendio de la invención La presente invención se basa en la identificación de proteínas, aisladas a partir de plaquetas, que se pueden utilizar como marcadores para la enfermedad de Alzheimer.

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, un método para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer comprende medir el nivel de expresión de la proteína mutante S-transferasa de glutatión A140D identificada por el nº de orden P78417 de SwissProt en una muestra de plaquetas aisladas a partir de una persona sospechosa de tener la enfermedad de Alzheimer, y determinar si los niveles de expresión están alterados en comparación con un control, en donde un nivel de expresión reducido cuando se compara con un control no enfermo, sano, de proteína mutante S-transferasa de glutatión A140D identificada por nº de orden P78417 de SwissProt, indica que existe un riesgo de contraer la enfermedad de Alzheimer.

El diagnóstico implica el aislamiento de plaquetas. En una realización preferida, las plaquetas no se deben activar durante la purificación a partir de una muestra de sangre.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, el uso de un kit para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en una persona de la cual se sospecha que padece la enfermedad de Alzheimer, en un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo el kit una sonda que permite la identificación de la proteína mutante S-transferasa de glutatión A140D y reactivos para un inmunoensayo, electroforesis en gel 2D o una reacción de polimerasa para detectar el nivel de expresión de la proteína mutante S-transferasa de glutatión A140D identificada por nº de orden P78417 de SwissProt.

Descripción de los dibujos La invención se describe haciendo referencia a los siguientes dibujos, en los que:

La Figura 1 ilustra los niveles de activación celular para plaquetas sin tratar, plaquetas preparadas usando cromatografía y plaquetas preparadas mediante centrifugación; y la Figura 2 ilustra la técnica de electroforesis diferencial en gel (DIGE) .

Descripción detallada de la invención Esta invención proporciona métodos para diagnosticar que existe un riesgo de padecer la enfermedad de Alzheimer, basados en la detección del nivel de expresión de una proteína específica, que se expresa en las plaquetas de una persona de la cual se sospecha que padece la enfermedad. El nivel de expresión de la proteína en las plaquetas se determina fuera del cuerpo (ex-vivo) de la persona sospechosa de tener la enfermedad, en un ensayo in vitro. La proteína que se puede detectar para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer se indica en la Tabla 1. La columna "% de cambio" representa el aumento o la disminución (número negativo) de la expresión relacionada con la enfermedad, en comparación con un control no enfermo.

Tabla 1 Marcadores de la enfermedad de Alzheimer

nº de orden de SwissProt * Nombre de la proteína Variante pI calculado PM (kDa) % de cambio EA/Control

P78417 S transferasas de glutatión Ï1 A140D 5, 87 30, 0 -32

* La base de conocimientos de proteínas SwissProt es una base de datos de secuencias de proteínas anotadas, establecida en 1986. Se gestiona en colaboración con el Instituto Suizo de Bioinformática (SIB) y el Instituto Europeo de Bioinformática (EBI) . La versión de SwissProt a la que se hace referencia en esta memoria es v50.1, del 13 de junio de 2006. Se puede acceder a SwissProt en http://expasy.ch y en los sitios web de SIB y EBI, www.isb-sib.ch y www.ebi.ac.uk, respectivamente. Una revisión de la base de datos SwissProt la proporcionan Bairoch A et al, Brief Bioinform. 2004 Mar; 5 (1) 39-55.

La Tabla 1 indica el número de orden de Swiss Prot para la proteína. Este identifica el producto del ARNm que codifica la proteína.

La variante específica indicada en la columna 3 de la Tabla 1 se utiliza de acuerdo con la invención. Más preferiblemente, la proteína tiene el pl (cuando se indica) y el peso molecular (PM) indicados en las columnas 4 y 5 de la Tabla 1. La determinación del PM de una proteína es un experimento de rutina para un experto en la técnica, por ejemplo, esto se puede realizar mediante SDS-PAGE. La determinación del pl también es rutinaria para un experto en la técnica, usando la técnica de enfoque isoeléctrico. El pl de la proteína en la Tabla 1 se determinó mediante el programa informático DeCy der® 2D analysis (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, Reino Unido) .

El método requiere la detección del nivel de expresión de la proteína especificada, a partir de plaquetas de una persona, por lo general una persona de la cual se sospecha que padece la enfermedad de Alzheimer o una persona que se cree que tiene una predisposición a la enfermedad. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "nivel de expresión" se refiere a la cantidad de la proteína especificada (o de ARNm que codifica la proteína) en las plaquetas de la muestra. El nivel de expresión se compara después con el nivel de expresión de la proteína procedente de las plaquetas de un control. El control puede ser una muestra de plaquetas de una persona de la que se sabe que padece la enfermedad, o una muestra de una persona de la que se sabe que no padece la enfermedad. Para el experto en la técnica será evidente que la comparación de los niveles de expresión de un control y la muestra del ensayo permitirá tomar una decisión en cuanto a si el nivel de expresión en la muestra del ensayo y en el control son similares o diferentes y, por lo tanto, si el paciente padece la enfermedad o corre el riesgo de padecerla. En la invención, la expresión de la proteína procedente de la muestra del ensayo se comparará con un control sano, es decir, que no está enfermo. La proteína puede tener el mismo incremento o disminución de la expresión o uno similar (en comparación con el control)... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer, que comprende medir el nivel de expresión de la proteína mutante S-transferasa de glutatión A140D identificada por el nº de orden P78417 de SwissProt en una muestra de plaquetas aisladas a partir de una persona sospechosa de tener la enfermedad de Alzheimer, y determinar si el nivel de expresión está alterado en comparación con un control, en donde un nivel de expresión reducido cuando se compara con un control sano sin la enfermedad, de la proteína mutante S-transferasa de glutatión A140D identificada por el nº de orden P78417 de SwissProt, indica que existe un riesgo de enfermedad de Alzheimer.

2. El método según la reivindicación 1, en el que la detección de la expresión de la proteína mutante Stransferasa de glutatión A140D identificada por el nº de orden P78417 de SwissProt se lleva a cabo en una muestra de plasma.

3. El método según cualquier reivindicación precedente, en el que las plaquetas se purifican para estar sustancialmente exentas de otros componentes de la sangre.

4. El método según cualquier reivindicación precedente, en el que las plaquetas no están activadas.

5. El método según cualquier reivindicación precedente, en el que el nivel de expresión de la proteína mutante S-transferasa de glutatión A140D identificada por el nº de orden P78417 de SwissProt en las plaquetas se determina a partir de un extracto de proteína plaquetaria.

6. El método según la reivindicación 5, en el que un extracto de proteína plaquetaria se aísla a partir de una muestra de sangre usando un método que comprende las etapas de:

(i) retirar los glóbulos rojos y blancos de la sangre de la muestra mediante sedimentación o centrifugación suave;

(ii) retirar las plaquetas de la muestra resultante;

(iii) poner en contacto las plaquetas obtenidas en la etapa (ii) con un agente para lisar las plaquetas y precipitar el extracto de proteínas plaquetarias;

(iv) opcionalmente centrifugar el lisado resultante para obtener las proteínas precipitadas.

7. Uso de un kit para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en una persona sospechosa de tener la enfermedad de Alzheimer en un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, comprendiendo el kit una sonda que permite la identificación de la proteína mutante S-transferasa de glutatión A140D y reactivos para un inmunoensayo, una electroforesis en gel 2D o una reacción de polimerasa para detectar el nivel de expresión de la proteína mutante S-transferasa de glutatión A140D identificada por el nº de orden P78417 de SwissProt.

8. El uso según la reivindicación 7, en el que la sonda se une específicamente a la proteína mutante Stransferasa de glutatión A140D identificada por el nº de orden P78417 de SwissProt.

9. El uso según la reivindicación 8, en el que la sonda es un anticuerpo o un aptámero.

10. El uso según la reivindicación 7, en el que la sonda es un ácido nucleico que se hibrida con un ARNm que codifica la proteína mutante S-transferasa de glutatión A140D identificada por nº de orden P78417 de SwissProt.

11. El uso según la reivindicación 7, en el que el kit comprende dextrano, un gel de exclusión por tamaño, ácido tricloroacético o etanol y una sonda que permite la identificación de la proteína mutante S-transferasa de glutatión A140D identificada por el nº de orden P78417 de SwissProt.

 

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