Diagnóstico de la preeclampsia.

Un método para diagnosticar que una mujer embarazada tiene, o es susceptible de desarrollar,

un trastorno hipertensivo, que comprende medir los niveles de tirosina cinasa 1 similar a fms soluble (sFlt-1) y el factor de crecimiento placentario (PIGF) en una muestra de orina obtenida de la mujer, en el que la relación de la expresión de sFlt-1 a la expresión de PIGF se usa como base para un indicador con respecto a si la mujer está en riesgo de desarrollar un trastorno hipertensivo, siendo el indicador (uFP): log [sFlt-1/PIGF x 100].

Diagnostico de la preeclampsia ANTECEDENTES DE LA INVENCION

La preeclampsia es un trastorno hipertensivo que complica hasta el 6-8% de embarazos, y sigue siendo la causa principal de morbimortalidad materna y perinatal (1, 2) . No obstante, a pesar de los amplios esfuerzos de investigacion, la etiologia de este trastorno multisistematico todavia sigue estando incomprendida completamente. Parece que la activacion endotelial vascular, seguida de vasoespasmos, es el rasgo central en la patogenesis de la preeclampsia. Las teorias de esta causa incluyen implantacion y desarrollo anormal de la placenta, estres oxidativo, homeostasia de prostanoides y oxido nitrico endotelial alterada, polimorfismos geneticos, autoanticuerpos circulantes anormales, y una respuesta inflamatoria sistematica materna anormal (3, 4, 5, 6, 7) . Mas recientemente, ha habido un foco creciente sobre los efectos de las variaciones en los niveles de expresion de moduladores de angiogenesis, que provocan sintomas de preeclampsia, incluyendo hipertension, proteinuria, activacion de celulas endoteliales y aumento de la agregacion plaquetaria (8, 9, 10, 11, 12) .

Especificamente, estudios recientes han dado a conocer que las concentraciones sericas maternas del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , del factor de crecimiento placentario (PIGF) y tirosina cinasa-1 similar a fms soluble (sFlt-1) estan alteradas en pacientes con preeclampsia clinica (13, 14, 15) . VEGF y PIGF son factores de crecimiento implicados en el desarrollo placentario, y ambos contribuyen a la actividad mitogenica y a la angiogenesis que es crucial para un feto en desarrollo. sFlt-1 es una variante de corte y empalme del receptor de Flt

1. Carece de los dominios citoplasmicos y transmembranicos de Flt-1, un receptor que se une tanto a VEGF como a PIGF, activando sus rutas de senalizacion. El aumento de sFlt-1 serico precede al comienzo de preeclampsia clinicamente identificable en aproximadamente 5 semanas, y la reduccion de PIGF libre es evidente tan pronto como el primer trimestre (13, 15, 16) . Por el contrario, las concentraciones sericas de VEGF son bajas durante el embarazo en mujeres con preeclampsia clinica (15) .

Tambien parece que tales factores angiogenicos son significativos en la regulacion de la fisiologia vascular glomerular renal humana. sFlt-1 exogeno, administrado a roedores prenados, conduce a hipertension, proteinuria y endoteliosis glomerular (17) . De forma similar, la neutralizacion de VEGF, un factor de supervivencia mitogenico, clave para el endotelio vascular glomerular, conduce a apoptosis incrementada, reparacion capilar glomerular alterada, y proteinuria importante (18) . En preeclampsia grave, la endoteliosis glomerular, una caracteristica habitual del trastorno, da soporte adicional a la relacion entre los factores angiogenicos alterados en pacientes con trastornos hipertensivos y la funcion renal general (19, 20, 21, 22, 23) .

Actualmente, no hay un unico ensayo para predecir o diagnosticar la preeclampsia, o para pronosticar la gravedad de la afeccion que se desarrollara en un paciente particular. Los sintomas tempranos incluyen cefaleas persistentes, vision borrosa, o sensibilidad a la luz y dolor abdominal. Sin embargo, un diagnostico de la preeclampsia no se realiza tipicamente hasta que se revela una tension arterial elevada y proteina en la orina (proteinuria) , tipicamente en ensayos medicos rutinarios tras la 20a semana de embarazo (1) . Los efectos graves de la preeclampsia, incluyendo ataques, hemorragia cerebral, coagulacion intravascular diseminada e insuficiencia renal, pueden aparecer muy poco despues tras tal diagnostico. Estos metodos son imprecisos y proporcionan poca comprension sobre la probabilidad del desarrollo de sintomas mas graves. Ademas, los diagnosticos actuales requieren la inadvertencia medica y metodologias invasivas, retrasando y complicando adicionalmente la evaluacion temprana e inmediata. Se necesita un metodo temprano y exacto para la deteccion y diagnostico de preeclampsia y trastornos hipertensivos proteinuricos asociados.

El documento WO 2004/008946 y el documento WO 98/28006 describen metodos para diagnosticar trastornos hipertensivos en mujeres embarazadas midiendo los niveles de VEGF, sFLt-1 y/o PLGF.

SUMARIO DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere a metodos para determinar o ayudar a determinar que una mujer embarazada esta en riesgo de desarrollar preeclampsia u otro trastorno o trastornos hipertensivos. En ciertas realizaciones, la invencion se refiere a metodos para determinar o ayudar a determinar que una mujer embarazada tiene preeclampsia. En realizaciones adicionales, la invencion se refiere a metodos de deteccion o deteccion previa de mujeres embarazadas para identificar aquellas mujeres embarazadas con un riesgo bajo de desarrollar trastornos hipertensivos, que reducen la necesidad de ensayos adicionales a lo largo del embarazo.

Se teorizo que los desajustes funcionales y morfologicos del rinon materno asociados con preeclampsia indican que las alteraciones en los niveles de sFlt-1, VEGF y PIGF urinarios pueden agrupar trastornos hipertensivos, y pueden diferenciar a mujeres embarazadas con preeclampsia grave de controles embarazadas normotensas. Mientras varios articulos suficientemente publicados han dado a conocer que niveles aumentados de sFlt-1 circulante y PIGF y VEGF reducidos en suero pueden predecir el comienzo de preeclampsia, la excrecion urinaria de estos factores antiangiogenicos no se ha estudiado previamente en profundidad, ni se ha analizado el efecto especifico de tales niveles de secrecion en el contexto de la gravedad de las enfermedades. La presente invencion proporciona la monitorizacion y uso de niveles de sFlt-1, VEGF y PIGF en muestras de orina como un indicador diagnostico de trastornos hipertensivos, incluyendo preeclampsia. Ademas, la invencion proporciona un metodo no invasivo para diferenciar preeclampsia grave de otros trastornos hipertensivos. Los metodos y ensayos desarrollados son simples y baratos, y se pueden utilizar tan pronto como el primer trimestre de embarazo, incrementando asi la probabilidad de una deteccion y tratamiento tempranos. Ademas, esta invencion se describe con referencia a mujeres embarazadas, los metodos descritos aqui tambien se pueden utilizar para evaluar el riesgo de mujeres no embarazadas a desarrollar trastornos hipertensivos durante el embarazo.

La invencion se describe mediante las reivindicaciones adjuntas.

En una realizacion, se describe un metodo para diagnosticar o ayudar a diagnosticar si una mujer embarazada tiene,

o tiene propension a desarrollar, un trastorno hipertensivo midiendo la concentracion de sFlt-1 en una muestra de orina obtenida del sujeto de ensayo, y comparando la concentracion con un patron apropiado. El patron puede ser, por ejemplo, la concentracion de sFlt-1 en orina obtenida de mujeres embarazadas cuyos embarazos son normales,

o de mujeres embarazadas que tienen un trastorno hipertensivo confirmado, incluyendo preeclampsia. Tales sujetos se denominan como sujetos de referencia. Las muestras de referencia se obtienen de sujetos de referencia quienes, cuando se obtiene la muestra, estan en la semana de embarazo correspondiente a aquella semana de embarazo en la que esta la sujeto de ensayo cuando se obtiene la muestra de ensayo. Las muestras de referencia se pueden obtener y analizar en el mismo momento en que las muestras de orina se obtienen de los sujetos de ensayo. Como alternativa, se puede utilizar un patron establecido (un patron previamente establecido, o uno desarrollado tras la evaluacion de la muestra de orina obtenida de un sujeto de ensayo) . Una concentracion incrementada de sFlt-1 en la orina de una mujer embarazada que se evalua (un sujeto de ensayo) , en comparacion con la concentracion de sFlt-1 en orina procedente de una mujer embarazada normal, indica que la mujer tiene mayor riesgo de desarrollar preeclampsia u otro trastorno o trastornos hipertensivos. Un incremento en la concentracion de sFlt-1 por encima de 9, 5 picogramos por miligramo de creatinina urinaria indica que la mujer embarazada tiene un mayor riesgo de desarrollar preeclampsia leve, mientras que un incremento en la concentracion de sFlt-1 por encima de 40 picogramos por miligramo de creatinina urinaria indica que la mujer embarazada tiene un mayor riesgo de desarrollar preeclampsia grave.

En otra realizacion se describe un metodo para evaluar o ayudar a evaluar la probabilidad de que una mujer embarazada desarrolle un trastorno hipertensivo midiendo la concentracion de PIGF y sFlt-1 en una muestra de orina obtenida de la mujer embarazada, y someter los valores obtenidos a analisis posterior. Se usa una formula para analizar los valores y calcular lo que se denomina como el uFP de la mujer,... [Seguir leyendo]

1. Un metodo para diagnosticar que una mujer embarazada tiene, o es susceptible de desarrollar, un trastorno hipertensivo, que comprende medir los niveles de tirosina cinasa 1 similar a fms soluble (sFlt-1) y el factor de crecimiento placentario (PIGF) en una muestra de orina obtenida de la mujer, en el que la relacion de la expresion de sFlt-1 a la expresion de PIGF se usa como base para un indicador con respecto a si la mujer esta en riesgo de desarrollar un trastorno hipertensivo, siendo el indicador (uFP) : log [sFlt-1/PIGF x 100].

2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el indicador obtenido se puede utilizar para evaluar el riesgo de una mujer embarazada de desarrollar una afeccion asociada con un trastorno hipertensivo, en el que la afeccion se selecciona del grupo que consiste en: acido urico serico incrementado; parto por cesarea; tensiones arteriales sistolica y diastolica incrementadas; proteinuria en tira reactiva; embarazo; bajo peso fetal en el parto; ruptura de la placenta; restriccion del crecimiento intrauterino (EJGR) ; hemolisis; trombocitopenia; enzimas hepaticas elevadas y sindrome HELLP (hemolisis, enzimas hepaticas elevadas, bajo recuento plaquetario) .

3. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en el que un uFP mayor que 1, 4 es un indicador de pronostico de un mayor riesgo de que una mujer embarazada necesitara tratamiento para prevenir el desarrollo o empeoramiento de sintomas asociados con trastornos hipertensivos.

4. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en el que un uFP mayor que 2, 1 es un indicador de diagnostico de preeclampsia grave.

5. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en el que un uFP mayor que 2, 1 es un indicador de diagnostico de un mayor riesgo de que una mujer embarazada necesitara alumbrar por cesarea.

6. Uso de un kit que comprende:

(a) un receptaculo para recibir una muestra de orina;

(b) un medio para detectar sFlt-1;

(c) un medio para detectar PIGF;

(d) instrucciones para uso del kit para calcular un indicador en cuanto a si la mujer esta en riesgo de desarrollar un trastorno hipertensivo, siendo el indicador (uFP) una relacion de la expresion de sFlt-1 a la expresion de PIGF: log [sFlt-1/PIGF x 100], en un metodo para diagnosticar una mujer embarazada que tiene, o que es susceptible de desarrollar, un trastorno hipertensivo, comprendiendo el metodo medir los niveles de tirosina cinasa 1 similar a fms soluble (sFlt-1) y del factor de crecimiento placentario (PIGF) en una muestra de orina obtenida de la mujer, en el que la relacion de la expresion de sFlt-1 a la expresion de PIGF se usa como base para un indicador en cuanto a si la mujer esta en riesgo de desarrollar un trastorno hipertensivo, siendo el indicador (uFP) : log [sFlt-1/PIGF x 100].

PºC_R rta1º d_N rta21 PE rta1 m vd dadd

Cºººººººº ºººº ºººººtº Edad: anos, media [ººººI] 26, 4 [23, 7-29, 1] 29, 8 [27, 2-32, 3] 24, 4 [21, 6-27, 2] p=0, 021 t Gravidez: mediana [intervalo] 2 [1-6] 2 [1-8] 1 [1-7] p=0, 063: Numero de partos: mediana [intervalo] 1 [0-3] 0 [0-5] 0 [0-4] p=0, 250 : Peso materno: kg, media [ººººI] 81, 8 [74, 0-89, 6] 100 [84, 7-115, 3] 88, 8 [74, 8-101, 6] p=0, 166 t Edad gestacional: semanas, mediana [intervalo]

28, 6 [7, 0-39, 0] 34, 4 [16, 6-40, 4] 31, 3 [24, 1-40, 2] p=0, 304 :

reclutamiento Edad gestacional: semanas, mediana [intervalo]

38, 5 [37, 4-39, 6] 34, 4 [32, 4-36, 6] 32 [29, 5-1-34, 4] p=0, 003 :

parto Cºººººººº ºººº ºººººº

Peso del nacido: g, media [ººººI] 3355 [3093-3617] 2105 [1593-2617] 1622 [1095-2150] p=0, 001 t

Mºtººº ºººººtº ºººtººº TA sistolica: mmHg, media [ººººI] 105, 5 [99, 1-111, 9] 160, 0 [149, 7-170, 4] 162, 4 [155, 7-169, 2] p 0, 001 t TA diastolica: mmHg, media [ººººI] 64, 4 [58, 9-70, 0] 94, 6 [89, 0-100, 3] 101, 5 [94, 4-108, 6] p 0, 001 t Sintomas neurologicos n [º] 0, 0 [0, 0] 3, 0 [14, 3] 7, 0 [41, 2] p=0, 0081 m

El dato se analizo mediante ANOVA de una via (t) , ANOVA de Kruskal-Wallis (:) , Chi cuadrado (m)

Figura 1

d_N rta21 PE rta1 m vd da Et ºº ºººtººº ºº ºººººº Proteinuria en tira reactiva: mediana [intervalo] 1, 5 [0-4] 3 [1-4] p 0, 001 ï Proteinuri.

2. h: g/dl, mediana [intervalo] 0, 9 [0, 1-13, 1] 3, 0 [0, 7-5, 4] p=0, 109 ï AST:U/l mediana [intervalo] 20, 0 [8, 0-59, 0] 26, 0 [5, 0-1380, 0] p=0, 166 ï ALT:U/l mediana [intervalo] 14, 0 [4, 0-32, 0] 25, 0 [9, 0-550, 0] p=0, 010 ï plaquetas: celulas/ulx103 media [ººººI] 263, 3 [221, 5-305, 1] 194, 3 [149, 2-239, 4] p=0, 035 ï LDH: U/l mediana [intervalo] 204, 0 [153, 0-366, 0] 245, 0 [184, 0-2940, 0] p=0, 015 ï

ºcido urico: mg/dl, mediana [intervalo] 5, 8 [5, 1-6, 4] 6, 7 [6, 2-7, 3] p=0, 025 ï

El dato se analizo mediante la prueba de Mann-Whitney (ï) , prueba de la t de Student (ï)

Figura 2

NPºC_R rta14 PºC_R rta1 d_N rta21 PE rta1 m vd da VEGF: pg/mgc 93, 5 [21, 2-258, 6] 152, 0 [26, 8-488, 3] 140, 6 [42, 3-483, 5] 214, 8 [17, 1-817, 6] p=0, 019 :

mediana [intervalo]

PLGF: pg/mgc 14, 7 [7, 3-21, 2] 65, 7 [8, 5-304, 1] 22, 1 [6, 2-255, 2] 19, 2 [8, 0-99, 2] p 0, 001 :

mediana [intervalo]

sFLT: pg/mgc 10, 5 [0, 4-48, 1] 15, 6 [0, 1-65, 8] 56, 1 [7, 6-453, 5] 145, 5 [6, 4-990, 7] p 0, 001 :

mediana [intervalo]

Proteina: mg/mgc 6, 4 [4, 3-9, 2] 7, 3 [2, 4-23, 4] 7, 4 [5, 4-32, 3] 11, 8 [4, 3-28, 7] p 0, 001 :

mediana [intervalo]

Creatinina: mg/ml1, 3 [0, 3-2, 5] 1, 0 [0, 2-2, 8] 0, 5 [0, 1-2, 0] 0, 7 [0, 1-1, 6] p=0, 032 :

mediana [intervalo]

El dato se analizo mediante ANOVA de Kruskal-Wallis (:) ; los valores se dan por mg de creatinina (mgc) Figura 3

ººA ººº ELISAº ººº1 ELSIAºº PIº_

Experimentos de ELISA representativos para sFlt-1 (A) y PIGF (B) . Los pocillos de la izquierda muestran las curvas patron respectivas. Los pocillos a la derecha de cadaexperimento muestran la inmunorreactividad de 8 muestras de orina. Los cuatro superiores (mostrados en el recuadro) proceden de 4 pacientes diferentes conpreeclampsia grave (sPE) , mientras que los cuatro inferiores proceden de 4 pacientes embarazadas normales (CRL) .

CHoja de analisis representativa usada para el calculo de uFP a partir del experimento en la diapositiva previa. : D: uFP media (+SD) de pacientes con preeclampsia grave (sPE) frente a controles (CRL) . El asterisco indica significancia estadistica (p 0, 001) . La linea punteada indica el corte en uFP con valor de diagnostico para sPE a partirde nuestra publicacion [Am º Obstet Gynecol. 00º ºar, 1º º LR - 1].

NPºC_R PºC_R ºPE PE m vd dad

VEº º ººv dºaººº ºd 176, 6 [78, 7-819, 0] 1, 6 [0, 0-59, 8] 0, 2 [0, 0-123, 9] 0, 1 [0, 0-48, 1] P 0, 001 : ºvºº dºaººººººd 74, 0 [5, 4-116, 7] 97, 6 [21, 4-219, 3] 45, 2 [7, 6-231, 3] 114, 1 [8, 2-817, 6] p=0, 021 :

º ººv dºaººº ºd 31, 8 [20, 1-64, 9] 433, 7 [189, 0-1992, 2] 1618, 0 [539, 4-3329, 9] 2252, 6 [1626, 8-3328, 2] p 0, 001 : ºvºº dºaººººººd 2, 4 [0, 7-35, 4] 1, 5 [0, 3-17, 9] 10, 9 [1, 6-217, 7] 81, 7 [12, 7-990, 7] p 0, 001 :

PIº º ººv dºaººº ºd 8, 3 [5, 4-10, 0] 330, 0 [26, 2-933, 7] 169, 2 [46, 4-805, 6] 58, 5 [4, 6-269, 8] P 0, 001 : ºvºº dºaººººººd 9, 9 [4, 3-16, 8] 55, 8 [10, 0-476, 9] 13, 6 [3, 9-163, 0] 17, 3 [7, 3-99, 2] p=0, 001 :

Pºººººtº

º ººv dººººº ºd 62, 8 [45, 0-93, 6] 60, 8 [52, 5-81, 3] 55, 7 [21, 5-91, 4] 48, 6 [29, 7-57, 2] p 0, 001 :

º ººººd dav º ºº ººv ººººº d5, 5 [3, 9-8, 6] 6, 8 [4, 5-16, 3] 5, 7 [2, 2-24, 8] 10, 5 [4, 0-38, 5] p=0, 007 : ºd vºº dººººººººd

Aººt º ººv dººººº ºd 23, 0 ï 1, 5 23, 1 ï 1, 5 30, 8 ï 5, 71 19, 5 ï 1, 4 p=0, 235 : ºvºº dº ººººººd 2, 8 [1, 3-7, 2] 5, 6 [1, 7-21, 5] 37, 4 [7, 8-503, 6] 173, 5 [52, 1-3069, 0] p 0, 001 :

Cºººººtºtºº ººv dºººº ºd 0, 81 ï 0, 1 0, 59 ï 0, 1 0, 66 ï 0, 1 0, 80 ï 0, 1 p=0, 013 t ºvºº dºººº ºd 121, 5 ï 26, 1 120, 3 ï 11, 3 136, 5 ï 24, 8 103, 9 ï 15, 7 p=0, 634 t

El dato se analizo mediante ANOVA de una via (t) , ANOVA de Kruskal-Wallis (:)

Figura 9