Método de diagnóstico de vCJD en una muestra diagnóstica de un tejido o fluido corporal válido tomado de un sujeto humano,

que comprende detectar una concentración aumentada de beta-actina en la muestra diagnóstica, en comparación con una muestra de un sujeto humano de control

Diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere al diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas, concretamente la variante de la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (vCJD).

La neuropatología de la enfermedad de Creutzfeld-Jakob, como de otras enfermedades priónicas, se manifiesta por sí misma como un aspecto espongiforme característico del tejido cerebral, muerte de células neuronales en el sistema nervioso central, acompañado por proliferación de astrocitos y en algunos casos la deposición de placas amiloides. Característico de todas las enfermedades priónicas es la acumulación en el cerebro de una forma alterada, asociada a enfermedad, de la proteína priónica normal (PrP^c) representada como PrP^Sc. Cuatro tipos de PrP^Sc están asociados con enfermedad priónica humana. De éstas, el tipo 4 está asociado sólo con la variante de CJD (vCJD) que salió a la luz en el RU en 1996. Se cree que ha surgido del consumo por los seres humanos de carne de ternera infectada con BSE. Ninguna muestra de otras enfermedades priónicas ha mostrado un perfil de tipo 4.

Las dificultades del diagnóstico de la vCJD han conducido a la necesidad de que se desarrollen métodos adicionales.

Sumario de la invención

La invención proporciona el uso de beta-actina y el precursor de apolipoproteína A-IV en o para el diagnóstico de la vCJD. Se ha encontrado que estas proteínas marcadoras se expresan de manera diferencial en electroforesis bidimensional y/o perfilado de plasma por espectrometría de masas en tiempo de vuelo mediante desorción-ionización por láser de superficie (SELDI).

La descripción identifica las proteínas marcadoras y sus características de expresión diferencial tal como sigue:

(Tabla pasa a página siguiente)

2. Proteínas presentes en una concentración aumentada o disminuida en una muestra de vCJD en comparación con un control:

La invención se define en las reivindicaciones.

La proteína marcadora puede está presente en el tejido corporal en cualquier forma biológicamente relevante, por ejemplo en una forma glicosilada, fosforilada, multimérica o precursora.

Aunque hay un alto grado de confianza en la identificación de las proteínas marcadoras especificadas anteriormente, las proteínas pueden definirse alternativamente en cuanto a ser manchas expresadas de manera diferencial en un gel electroforético bidimensional, concretamente los identificados en las figuras 2 a 5 en el presente documento, independientemente de los nombres y las identificaciones de bases de datos facilitados anteriormente.

Definiciones

La expresión "expresado de manera diferencial" en el contexto de electroforesis en gel bidimensional significa que las manchas que portan proteína teñida están presentes a una densidad óptica superior o inferior en el gel de la muestra tomada para el diagnóstico (la "muestra diagnóstica") que en el gel de una muestra control u otra muestra comparativa, y en el contexto de SELDI-TOF significa que el pico de proteína es a una intensidad superior o inferior en el espectrograma de masas de la muestra tomada para el diagnóstico (la "muestra diagnóstica") que el espectrograma de masas de una muestra control u otra muestra comparativa. Se deduce que las proteínas están presentes en el plasma de la muestra diagnóstica a una concentración superior o inferior que en la muestra control u otra muestra comparativa en la misma dirección de expresión diferencial observada en la electroforesis en gel S-dimensional y SELDI-TOF.

El término "control" se refiere a un sujeto humano que no padece vCJD.

La terminología "concentración aumentada/disminuida... en comparación con una muestra de un control" no implica que se acometa realmente una etapa de comparación, puesto que en muchos casos será obvio para el experto que la concentración es anómalamente alta. Además, cuando el estadio de la evolución de la vCJD está monitorizándose progresivamente, la comparación realizada puede ser con la concentración anteriormente observada en el mismo sujeto más temprano en la evolución de la enfermedad.

La expresión "pareja de unión" incluye una sustancia que reconoce o tiene afinidad por la proteína marcadora. Puede estar o no marcada por sí misma.

La expresión "proteína marcadora" incluye todas las formas biológicamente relevantes de la proteína identificada.

El término "diagnóstico", tal como se usa en el presente documento, incluye determinar si está presente o ausente la vCJD y también incluye determinar el estadio hasta el que ha evolucionado. El diagnóstico puede servir como base de un pronóstico en cuanto al desenlace futuro para el paciente.

La expresión "tejido corporal válido" significa cualquier tejido en el que puede esperarse razonablemente que se acumule una proteína marcadora en relación con la vCJD. Aunque será principalmente un fluido corporal, también incluye tejido del cerebro o de los nervios, la amígdala, el bazo u otro tejido linforreticular, se entiende que el diagnóstico puede realizarse o bien pre mortem o bien post mortem.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es una fotografía de un gel bidimensional típico realizado para fines analíticos, mediante el método descrito en el ejemplo 1 a continuación, en una muestra derivada de un paciente con vCJD. El peso molecular (masa molecular relativa) se muestra en la ordenada en kiloDaltons. Los marcadores de peso molecular se muestran en el lado izquierdo. El punto isoeléctrico (pI) se muestra en la ordenada, aumentando de izquierda a derecha.

La figura 2 es una fotografía de un gel similar, pero marcado con las manchas 1713, 1893, 1960, 2730 y 2732, explicados en detalle en el ejemplo 1. La mancha 1960, aunque es una proteína marcadora para HD (no para vCJD), se muestra aquí por conveniencia, puesto que aparece en pacientes con vCJD, a aproximadamente el mismo nivel que en un control.

La figura 3 es una fotografía ampliada para mostrar una parte del gel de la figura 1 y las manchas 846 y 1526.

La figura 4 es una fotografía ampliada para mostrar otra parte del gel de la figura 1 y la mancha 1488. Las manchas 1293 y 2885 se muestran también, pero no se continuó más con ellos, tal como se explica en el ejemplo 1.

La figura 5 es similar a la figura 2, pero mostrando las manchas 1713 y 1960 en una muestra derivada de un paciente con HD.

Las figuras 6 a 13 son rastros de SELDI, tal como se describe más completamente en el ejemplo 2.

La figura 14 es una imagen de un gel teñido con plata del material extraído de chips Q10 de plasma empobrecido, tal como se describe en el ejemplo 2.

La figura 15 es una imagen de un gel teñido con plata del material extraído de chips WCX CM10 de plasma empobrecido, tal como se describe en el ejemplo 2.

Descripción de realizaciones...

1. Método de diagnóstico de vCJD en una muestra diagnóstica de un tejido o fluido corporal válido tomado de un sujeto humano, que comprende detectar una concentración aumentada de beta-actina en la muestra diagnóstica, en comparación con una muestra de un sujeto humano de control.

2. Método según la reivindicación 1, que comprende detectar una concentración aumentada de dos o más proteínas en la muestra diagnóstica, en comparación con una muestra de un sujeto humano normal de control, siendo las proteínas:

3. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la detección se realiza sobre la muestra diagnóstica mediante un ensayo de unión para la beta-actina.

4. Método según la reivindicación 3, en el que el ensayo de unión comprende provocar que la beta-actina de la muestra diagnóstica interaccione con una pareja de unión específica respectiva y detectar la interacción.

5. Método según la reivindicación 4, en el que la pareja de unión específica marcada es un anticuerpo marcado que reconoce la beta-actina.

6. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la muestra diagnóstica se somete a electroforesis en gel bidimensional para producir un gel teñido y se detecta la concentración aumentada o disminuida de la beta-actina mediante una intensidad aumentada o disminuida de una mancha que contiene proteína sobre el gel teñido, en comparación con un gel control correspondiente.

7. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la vCJD se diagnostica con cualquier otra enfermedad.

8. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la muestra diagnóstica es un fluido corporal.

9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el tejido corporal válido es de cerebro, nervio, amígdala, bazo u otro tejido linforreticular.

10. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que otra enfermedad, que puede o no ser neurológica, se diagnostica en la misma muestra del tejido corporal, mediante un método que comprende detectar una concentración aumentada de otra proteína en la muestra diagnóstica, en comparación con una muestra de un sujeto humano normal de control.

11. Uso para el diagnóstico de vCJD de un material de pareja que reconoce, se une a o tiene afinidad por la beta-actina según la reivindicación 1.

12. Uso según la reivindicación 11, en el que el material de pareja es un anticuerpo.

13. Uso según la reivindicación 12, en el que el anticuerpo se inmoviliza sobre una fase sólida.

14. Uso según la reivindicación 12, en el que el anticuerpo se inmoviliza sobre perlas o como un chip.