DETERMINACION DE PROBNP FELINO O CANINO.
Método para la determinación de proBNP felino o canino que comprende las etapas de:
- poner a disposición una muestra felina o canina,
- hacer entrar en contacto la muestra con al menos un anticuerpo que durante la determinación de proBNP felino se une con al menos un epítope en la zona de los aminoácidos 20 a 42 o en la zona de los aminoácidos 57 a 80 del proBNP felino y, durante la determinación de proBNP canino, con al menos un epítope en la zona de los aminoácidos 25 a 41 o en la zona de los aminoácidos 55 a 65 o en la zona de los aminoácidos 74 a 86 del proBNP canino, y
- determinar la presencia y/o concentración del proBNP felino o canino existente en la muestra
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2005/054446.
Solicitante: BIOMEDICA MEDIZINPRODUKTE GMBH & CO KG.
Nacionalidad solicitante: Austria.
Dirección: DIVISCHGASSE 4,1210 WIEN.
Inventor/es: WOLOSZCZUK,WOLFGANG, HAWA,GERHARD.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 14 de Julio de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- G01N33/68 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos.
Clasificación PCT:
- G01N33/68 G01N 33/00 […] › en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos.
Fragmento de la descripción:
Determinación de proBNP felino o canino.
La presente invención se refiere a un método para la determinación de proBNP o fragmentos del mismo en mamíferos.
Las enfermedades cardíacas no sólo desempeñan un papel importante en el ser humano, también los animales, particularmente los animales de compañía como perros y gatos se ven afectados por estas enfermedades. Los estudios han dado como resultado que, a modo de ejemplo, uno de cada diez corazones de perro presenta una disfunción. Las enfermedades cardíacas que se producen en este caso afectan, a modo de ejemplo, las válvulas cardiacas y el músculo cardiaco. Debido a que el corazón es capaz de compensar disfunciones, en primer lugar, por un trabajo adicional, una enfermedad de este tipo permanece oculta en la mayoría de los casos, lo que conlleva la consecuencia de que por la carga cardiaca aumentada el estado del corazón empeora. Los síntomas resultantes de enfermedades cardiacas como cansancio, debilidad cardiovascular y agotamiento, en la mayoría de los casos, son reconocibles cuando el corazón del animal de compañía ya no puede compensar la debilidad. En un caso de este tipo, la enfermedad cardiaca ya está tan avanzada que una curación completa casi ya no es posible.
Las modificaciones crónicas de la válvula cardiaca y el músculo cardiaco, por regla general, no se pueden curar, pudiéndose lentificar sin embargo por utilización de medicamentos el avance adicional de la enfermedad cardiaca. Debido a esto, es importante realizar un diagnóstico temprano para enfermedades cardiacas que se están produciendo. De forma rutinaria, se utilizan con esta finalidad sobre todo métodos físicos como la auscultación de los ruidos cardiacos, la grabación de un electrocardiograma y exámenes por rayos X y ultrasonido. Estos métodos de examen presentan sobre todo la desventaja de que se pueden ejecutar solamente cuando ya se pueden reconocer directamente en el corazón daños ya visibles o audibles. Además de eso, los métodos de examen físicos necesitan dispositivos adecuados y, por regla general, caros, para ejecutar un diagnóstico correspondiente.
Las enfermedades cardiacas que se producen en la mayor medida, a modo de ejemplo, en perros, son la descompensación cardiaca y la miocardiopatía dilatada, que afecta en la mayoría de los casos a animales grandes. La miocardiopatía dilatada es una enfermedad cardiaca, que conduce a un aumento de las cámaras cardiacas con un espesor normal de la pared, teniendo rápidamente como consecuencia este aumento una debilidad cardiaca en el animal afectado. Por la adición de taurina en alimentos para animales se pudo reducir significativamente el riesgo de enfermar con la miocardiopatía dilatada. En el caso de una enfermedad similar a la miocardiopatía dilatada, la miocardiopatía restrictiva que se observa a menudo en gatos mayores, es una disminución continua de la función cardiaca con una capacidad de bombeo reducida. La enfermedad cardiaca que se produce en gatos en mayor medida es la miocardiopatía hipertrófica. Esta enfermedad del músculo cardiaco conduce a que la pared cardiaca aumenta su grosor y, como resultado de eso, a una capacidad reducida de llenar las cámaras cardiacas con sangre. Esto conduce a una acumulación de sangre en la cámara cardiaca izquierda y a una cantidad de sangre muy reducida que se bombea a través del cuerpo.
En muchas enfermedades cardiacas como, por ejemplo, la insuficiencia cardiaca, miocardiopatía dilatada, miocardiopatía hipertrófica, hipertrofia y disfunción ventricular izquierda, se libera una hormona peptídica, el denominado BNP (brain natriuteric peptide). Esta hormona provoca la eliminación de líquido a través del riñón y regula de este modo el sistema cardiovascular. Debido a que se produce este péptido en el corazón y se produce de forma intensificada con una sobrecarga y un sobrellenado del corazón, la determinación del nivel de BNP en la sangre es un medio adecuado para la evaluación de la debilidad cardiaca.
El BNP, así como también otros péptidos natriuréticos desempeñan un papel importante en la regulación del equilibrio del agua y de la presión sanguínea. Cuando se dilata la pared cardiaca, la misma libera de forma intensificada BNP, lo que conduce a una eliminación de sodio y líquido a través del riñón y a una expansión de los vasos sanguíneos, que en la suma pueden bajar la presión sanguínea y el llenado del corazón. El BNP se sintetiza por las células musculares cardiacas como proBNP, que finalmente se disocia en proBNP N-terminal y BNP. Ambas partes del BNP se entregan a la sangre y se pueden determinar en la misma.
Entre otras, las siguientes publicaciones relevantes se dedican a enfermedades cardiacas en animales: Bright JM y Cali JV, J Am Vet Med Assoc 2000, 216:1110-4; Guglielmini C, Vet Res Commun 2003, 27 Suppl 1:555; Boswood A et al., J Small Anim Pract 2003, 44:104-8; Takemura N et al., J Vet Med Sci 2003, 65:1265-7; MacDonald KA et al., J Vet Intern Med 2003, 17:172-7; Greco DS et al., Can Vet J 2003, 44:293-7; Monnet E et al., J Am Vet Med Assoc 1997, 211:569-72; Hamlin RL et al., J Vet Intern Med 1996, 10:85-7; Gaschen L et al., J Vet Intern Med 1999, 13:346-56.
En el estado de la técnica ya se conoce una pluralidad de métodos con cuya ayuda se puede detectar proBNP humano o sus fragmentos en el suero de un individuo. De forma ilustrativa, se deben mencionar en este documento los documentos EP 0 648 228 B1, WO 03/87819 y FR 2 843 396.
En el documento US 2004/0018577 se describe un inmunoensayo que comprende al menos tres anticuerpos, que se pueden unir todos en diferentes epítopes de un analito. Los analitos que se tienen que detectar en este caso se refieren particularmente a la detección de marcadores con referencia a enfermedades cardiacas, pudiendo detectarse también, entre otras cosas, BNP y proBNP.
Biondo A.W. et al. (Vet.Pathol. 2003, 40(5):501-506) describen un método para la identificación de ANP y BNP en gatos mediante anticuerpos policlonales, que se dirigen contra un péptido del ANP que comprende los aminoácidos 1 a 28 o contra un péptido que comprende los aminoácidos 43 a 56 de proBNP.
En el documento EP 1 016 867 A1 se describe un inmunoensayo para la identificación de preproBNP en mamíferos. En este caso, se usan anticuerpos que se dirigen contra péptidos, que comprenden los aminoácidos 27 a 102, 73 a 102 y 27 a 64 de BNP humano.
Jortani S.A. et al. (Clin.Chem.2003,50(2):265-278) describen el uso de BNP y sus formas prepro- y pro- como posibles marcadores para enfermedades cardiacas. En este artículo no se menciona ninguna región peptídica preferida de BNP que sería adecuada para identificar enfermedades cardiacas en perros y gatos. De forma comparable a esto, se describe también en el documento WO00/71576 el uso de BNP como marcador.
En el documento WO 2000/35951 se describen varios péptidos, contra los que se pueden producir anticuerpos que son adecuados en un método para el diagnóstico de enfermedades cardiacas. En este caso, se describen tres péptidos que comprenden los aminoácidos 1 a 13, 37 a 49 y 65 a 76 de la proteína humana de Nt-pro-BNP, a los que también se puede recurrir para la producción de anticuerpos que se dirigen contra estos péptidos.
El documento US 6.586.396 se refiere a un método para el tratamiento de seres humanos y perros con péptidos, que presentan una actividad natriurética. En este caso, se administra BNP humano o canino de forma subcutánea. Además, se pueden usar los BNP o fragmentos de los mismos descritos en el documento de Estados Unidos para la producción de antisueros o anticuerpos monoclonales que, a su vez, se pueden utilizar en inmunoensayos.
De forma comparable al documento US 6.586.396 se describen también en el documento US 5.114.923 partes de la secuencia de aminoácido del BNP canino.
En el documento US 2004/096920 se describe un ELISA, en el que se pueden usar diferentes anticuerpos policlonales que se dirigen contra diferentes zonas del BNP humano.
El documento WO 00/45176 se refiere a un método para la identificación de proBNP N-terminal en una muestra con al menos dos anticuerpos, que son capaces de reconocer diferentes epítopes del proBNP N-terminal.
En el documento US 2003/069186 se describen proteínas quiméricas, que pueden comprender, entre otras cosas, fragmentos de NP N-terminales.
Además de eso, existen en el mercado varios kits de ensayo para la detección de proBNP humano o sus fragmentos (por ejemplo, de...
Reivindicaciones:
1. Método para la determinación de proBNP felino o canino que comprende las etapas de:
2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que durante la determinación de proBNP felino el al menos un anticuerpo se une con al menos un epítope en la zona de los aminoácidos 25 a 35 o en la zona de los aminoácidos 60 a 80 del proBNP felino.
3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado por que al menos un anticuerpo adicional se une con el al menos un anticuerpo o con el al menos un epítope.
4. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que el al menos un anticuerpo y/o el al menos un anticuerpo adicional está marcado.
5. Método de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado por que el al menos un anticuerpo y/o el al menos un anticuerpo adicional está marcado con peroxidasa, particularmente peroxidasa de rábano picante, biotina, colorante fluorescente, oro coloidal o radioisótopos.
6. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que el al menos un anticuerpo o el al menos un anticuerpo adicional está unido con una fase sólida.
7. Método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que la determinación de proBNP felino o canino se realiza por un método seleccionado entre el grupo que consiste en el radioinmunoensayo, ensayo de inmunounión, transferencia de Western, inmunohistoquímica, ensayo inmunoenzimático, dispositivo de flujo lateral (LFD, tira de ensayo) y combinaciones de los mismos.
8. Anticuerpo o mezcla de anticuerpos, caracterizado por que el/la mismo/misma se une con al menos un epítope en la zona de los aminoácidos 20 a 42 o en la zona de los aminoácidos 57 a 80 del proBNP felino, preferiblemente en la zona de los aminoácidos 25 a 35 o en la zona de los aminoácidos 60 a 80 del proBNP felino.
9. Anticuerpo o mezcla de anticuerpos, caracterizado por que el/la mismo/misma se une con al menos un epítope en la zona de los aminoácidos 25 a 41 o en la zona de los aminoácidos 55 a 65 o en la zona de los aminoácidos 74 a 86 del proBNP canino.
10. Péptido que consiste en los aminoácidos 20 a 42 y/o los aminoácidos 57 a 80, preferiblemente, los aminoácidos 25 a 35 y/o los aminoácidos 60 a 80, del proBNP felino.
11. Péptido que consiste en los aminoácidos 25 a 41 y/o los aminoácidos 55 a 65 y/o los aminoácidos 74 a 86 del proBNP canino.
12. Uso de un péptido de acuerdo con la reivindicación 10 u 11 como control positivo o como norma para la determinación de concentraciones en un método de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7.
13. Kit para la determinación de proBNP felino o canino que comprende al menos un anticuerpo o al menos una mezcla de anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, medios para la detección cualitativa y/o cuantitativa de una unión del al menos un anticuerpo o de la al menos una mezcla de anticuerpos con proBNP felino o canino y, en un caso dado, péptidos de acuerdo con la reivindicación 10 u 11 y/o proBNP felino o canino como control positivo o norma para una determinación de concentraciones.
14. Kit de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado por que los medios para la detección cualitativa y/o cuantitativa de una unión del al menos un anticuerpo o de la al menos una mezcla de anticuerpos de proBNP felino o canino comprenden al menos un anticuerpo adicional.
15. Kit de acuerdo con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado por que el al menos un anticuerpo y/o el al menos un anticuerpo adicional está marcado.
16. Kit de acuerdo con una de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado por que el al menos un anticuerpo y/o el al menos un anticuerpo adicional está marcado con peroxidasa, particularmente peroxidasa de rábano picante, biotina, colorante fluorescente, oro coloidal o radioisótopos.
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