Determinación de ADN y/o ARN a partir de datos de espectrofotómetro UV-VIS.

Un método implementado por ordenador para analizar datos de espectrofotómetro UV-VIS de una muestra que comprende ADN y / o ARN, comprendiendo el método

- recibir datos de espectrofotómetro UV-VIS de la muestra,

- ajustar los datos de espectrofotómetro UV-VIS teniendo en cuenta por lo menos un espectro representativo de una muestra que tiene un contenido en pares de bases, siendo el par de bases cualquiera de adenina-timina

(AT) o guanina-citosina (GC) o adenina-uracilo (AU), y

- obtener a partir del ajuste una cuantificación de una cantidad 10 de ADN y / o ARN.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2012/053481.

Solicitante: Trinean NV.

Nacionalidad solicitante: Bélgica.

Dirección: Dulle-Grietlaan 17 bus 3 9050 Gentbrugge BELGICA.

Inventor/es: BOONEFAES,TOM.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de los materiales por... > G01N21/33 (utilizando la luz ultravioleta (G01N 21/39 tiene prioridad))

PDF original: ES-2543031_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Determinación de ADN y/o ARN a partir de datos de espectrofotómetro UV-VIS

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de la caracterización de muestras. Más en particular, la presente invención se refiere a métodos y sistemas para analizar muestras usando espectros registrados, tal como por ejemplo para analizar unas muestras que comprenden ADN y/o ARN.

Antecedentes de la invención

Aunque existen numerosas técnicas de análisis para la cualificación y cuantificación de muestras, sólo algunas técnicas de análisis son fáciles de realizar, rápidas y precisas como la espectrofotometría. Un ejemplo de espectrofotometría es la espectroscopía de absorbancia de UV-VIS. Durante tales experimentos, se irradian muestras con radiación UV-VIS de diferentes longitudes de onda, se detecta la radiación restante después del paso a través de la muestra y se determina la absorbancia a diferentes longitudes de onda. Debido a que componentes particulares mostrarán una absorbancia particular a longitudes de onda particulares, un perfil de absorbancia particular de este tipo puede usarse como huella dactilar, lo que permite, al compararse con espectros de referencia, identificar los componentes. Cuando se estudian muestras más complejas, las características de absorbancia en el espectro pueden ser más amplias, haciendo sustancialmente más difícil la interpretación de los espectros.

En el pasado se han descrito varias técnicas diferentes de análisis espectral. Algunos métodos son proporcionados permiten determinar la concentración o concentración relativa de los componentes de una muestra basándose en la aproximación del espectro medido con una combinación lineal de espectros convencionales, también denominados de referencia, de los componentes individuales. Una aproximación del espectro medido con espectros de referencia puede realizarse usando técnicas de minimización para el ajuste de los espectros de referencia a los espectros de absorción, como por ejemplo regresión de mínimos cuadrados o regresión de de las mínimas desviaciones absolutas. Tales métodos pueden aplicarse también de forma iterativa.

Se conocen métodos más complejos, tales como métodos que hacen uso de derivadas de un espectro, debido a que, entre otras cosas, estas últimas pueden permitir aumentar la insensibilidad a los desplazamientos de longitud de onda. Un ejemplo de un método que usa derivadas es el análisis de una mezcla de proteínas usando la segunda derivada del espectro de la muestra. Otro método conocido se basa en la computación matricial para determinar la concentración de un número de componentes químicos usando un número de datos espectrales predeterminados de cada componente químico, por el cual el número de datos espectrales previamente determinados es más grande que el número de componentes químicos que va a determinarse. Algunos de los métodos conocidos se basan en una correlación cruzada de muestras y espectros de referencia, ponderándose ambos mediante la transmitancia media por longitud de onda. Se han descrito unas aplicaciones particulares para analizar muestras con una composición conocida, tal como por ejemplo un análisis de la composición de una proteína usando espectroscopía electromagnética, análisis de ARN en el que las muestras se dividen por medios químicos en fracciones de AC y de GU y la composición de AC y de GU se determina entonces basada en la absorción a 260 nm.

Además, también se conocen algunos métodos que abordan espectros de componentes desconocidos. Se conocen métodos en los que la separación de espectros de componentes desconocidos a partir de muestras se basa en programación lineal o cuadrática restringida y muestra transformada, es decir, ondícula transformada. Otros métodos hacen uso de espectros de componentes aproximados mediante una correlación cruzada punto a punto de absorbancia y al hacer uso de una concentración conocida. Varias técnicas hacen uso de un análisis de componentes principales (PCA) para obtener espectros de referencia relevantes para el diagnóstico a partir de una base de datos de espectros asociados con patologías mediante lo cual una correlación con espectros de referencia se usa para ayudar al diagnóstico de una nueva muestra.

Spjotvoll y col. describen en Technometrics 24 (1982) una técnica para determinar espectros y concentraciones de mezclas de dos constituyentes sobre la base de un estimador de mínimos cuadrados. Un método se analiza para la identificación de dos compuestos químicos desconocidos y una estimación de su proporción en un conjunto de mezclas desconocidas de los dos compuestos. Está basado en un ajuste de mínimos cuadrados y un análisis de componentes principales para la separación mediante lo cual se introducen unas restricciones adicionales tales como que la suma de concentraciones sea igual a la unidad y que los espectros y las concentraciones sean no negativos.

El uso de datos de espectrofotómetro UV-VIS para la cuantificación o el análisis de ADN y / o de ARN sigue sin dar un paso adelante debido a la carencia de una técnica de análisis precisa y eficiente para los resultados obtenidos.

El documento US7786295 describe un método implementado por ordenador para analizar datos de espectrofotómetro UV-VIS de una muestra que comprende ADN y / o ARN, siendo el método adecuado para aislar ADN a partir de muestras biológicas. El documento EP1524514 describe un método de medición de una concentración de ADN usando datos de espectrofotómetro UV-VIS.

Por lo tanto, existe la necesidad de un método que permita un análisis de unas muestras que comprenden componentes de ADN y/o de ARN, en particular usando espectroscopía UV-VIS.

Resumen de la invención

Un objeto de realizaciones de la presente invención es la provisión de métodos y sistemas buenos para analizar espectros de espectroscopía UV-VIS de muestras y los correspondientes métodos y sistemas buenos para caracterizar muestras que comprenden ADN y/o ARN. La muestra de forma ventajosa comprende ADN bicatenario, a pesar de que la técnica también puede usarse para muestras que comprenden solo ARN. Los espectros de espectroscopía UV-VIS pueden ser espectros de absorbancia UV-VIS.

Es una ventaja de las realizaciones de acuerdo con la presente invención que se proporcionan sistemas y métodos que permiten ayudar al análisis de PCR, por ejemplo, sin la necesidad de purificar la mezcla de reacción, incluso si la mezcla de reacción es una mezcla de 4dNTP, oligonucleótidos cebadores, enzima polimerasa y ADN en la muestra.

Es una ventaja que métodos y sistemas de acuerdo con las realizaciones de la presente invención permitan la obtención de resultados relevantes y concluyentes.

El objetivo anterior se logra mediante un método y dispositivo de acuerdo con la presente invención.

La presente invención se refiere a un método implementado por ordenador para analizar datos de espectrofotómetro UV-VIS de una muestra que comprende por lo menos ADN y/o ARN, el por lo menos ADN y / o ARN siendo de forma ventajosa por lo menos ADN bicatenario, comprendiendo el método la recepción de datos de espectrofotómetro UV-VIS, ajustar los datos de espectrómetro UV-VIS teniendo en cuenta por lo menos un espectro representativo de un par de bases siendo cualquiera entre adenina-timina (AT) o guanina-citosina (GC) o adeninauracilo (AU) , y obtener a partir del ajuste una cuantificación de una cantidad de ADN y/o ARN, siendo la obtención de forma ventajosa, la obtenida a partir del ajuste una cuantificación de una cantidad de ADN bicatenario. Es una ventaja de las realizaciones de la presente invención que datos de espectrofotómetro UV-VIS puedan usarse para caracterizar, sin una gran... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método implementado por ordenador para analizar datos de espectrofotómetro UV-VIS de una muestra que comprende ADN y / o ARN, comprendiendo el método

- recibir datos de espectrofotómetro UV-VIS de la muestra, -ajustar los datos de espectrofotómetro UV-VIS teniendo en cuenta por lo menos un espectro representativo de una muestra que tiene un contenido en pares de bases, siendo el par de bases cualquiera de adenina-timina (AT) o guanina-citosina (GC) o adenina-uracilo (AU) , y -obtener a partir del ajuste una cuantificación de una cantidad de ADN y / o ARN.

2. Un método implementado por ordenador de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho ajuste comprende tener en cuenta un conjunto de espectros de referencia representativos de dos contenidos en pares de bases distintos.

3. Un método implementado por ordenador de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho ajuste comprende tener en cuenta un conjunto de dos o un conjunto de exactamente dos espectros de referencia representativos de dos contenidos de GC distintos.

4. Un método implementado por ordenador de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que dicho ajuste comprende ajustar datos de espectrofotómetro UV-VIS de una muestra que comprende ADN y / o ARN que tiene por lo menos 50 pares de bases, de forma ventajosa por lo menos 100 pares de bases y / o en el que dicha muestra comprende ADN y dicho ajuste comprende usar una combinación de un conjunto de espectros de referencia representativos de pares de bases y espectros de referencia que son representativos de bases nitrogenadas separadas.

5. Un método implementado por ordenador de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho ajuste usando una combinación de espectros de referencia representativos de pares de bases y espectros de referencia que son representativos de bases nitrogenadas separadas comprende ajustar usando espectros que son los espectros de diferencia entre los espectros de referencia representativos de pares de bases y los espectros de referencia que son representativos de bases nitrogenadas separadas.

6. Un método implementado por ordenador de acuerdo con la reivindicación 5, en el que los espectros de diferencia entre espectros de referencia representativos de pares de bases y espectros de referencia que son representativos de bases nitrogenadas separadas, son espectros obtenidos de la sustracción con respecto a unos espectros de referencia dados representativos de un par de bases dado, los espectros de referencia que son representativos de las bases nitrogenadas separadas correspondientes.

7. Un método implementado por ordenador de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que los espectros de referencia representativos de bases nitrogenadas separadas son espectros de referencia para adenina, guanina, timina, citosina y / o uracilo.

8. Un método implementado por ordenador de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, estando el método adaptado para analizar una reacción de PCR de una muestra que comprende ADN, en el que dicha obtención comprende determinar una cantidad de ADN bicatenario que se forma durante o después de una reacción de PCR.

9. Un método implementado por ordenador de acuerdo con la reivindicación 8, en el que ajustar además comprende tener en cuenta una componente espectral para un componente de contaminación.

10. Un método implementado por ordenador de acuerdo con la reivindicación 9, en el que tener en cuenta una componente espectral para un componente de contaminación, comprende tener en cuenta una componente espectral para uno o más de trimetilglicina, guanidinatiocianato, fenol, ácido etilendiaminotetraacético, proteínas azida de sodio o hemoglobina y / o en el que ajustar datos del espectrofotómetro UV-VIS de una muestra comprende ajustar datos del espectrofotómetro UV-VIS de una mezcla que comprende desoxinucleótidos trifosfato, oligonucleótidos cebadores, polimerasa y ADN.

11. Un método implementado por ordenador de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, en el que ajustar además comprende tener en cuenta una o más componentes espectrales representativas de la dispersión en la muestra y / o tener en cuenta una o más componentes espectrales representativas de la turbidez en la muestra y / o en el que el ADN y / o ARN es por lo menos una cantidad de ADN bicatenario.

12. Un sistema implementado por ordenador para analizar datos de espectrofotómetro UV-VIS de una muestra que comprende ADN y / o ARN, comprendiendo el sistema

- un medio de entrada para recibir dichos datos de espectrofotómetro UV-VIS, -un medio de procesamiento programado para el ajuste de los datos de espectrómetro UV-VIS teniendo en cuenta por lo menos un espectro representativo de un par de bases siendo cualquiera de adenina-timina (AT) o guanina-citosina (GC) o adenina-uracilo, y obtener a partir del ajuste una cuantificación de una cantidad de ADN

y/oARN, y -un medio de salida para emitir una cuantificación de una cantidad de ADN y / o ARN para la muestra bajo estudio.

13. Un sistema implementado por ordenador de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicho medio de procesamiento está adaptado para realizar un ajuste tal como se describe en cualquiera de los métodos de las reivindicaciones 1 a 11.

14. Un producto de programa informático para, si se implementa en una unidad de procesamiento, realizar un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11. 15

15. Un medio de soporte de datos que comprende un producto de programa informático de acuerdo con la reivindicación 14.

16. Transmisión de un producto de programa informático de acuerdo con la reivindicación 14 a través de una red de 20 área amplia o local.