Procedimientos y composiciones para detectar el virus BK.

Un procedimiento de valoración de la presencia de ácido nucleico del virus BK

(BKV) en una muestra, incluyendo el procedimiento determinar la cantidad de ácido nucleico de BKV y determinar si está presente o ausente, incluyendo adicionalmente el procedimiento discriminar entre ácido nucleico de virus BKV y JC, comprendiendo el procedimiento:

poner en contacto dicha muestra con un par cebador diseñado para hibridar en condiciones de hibridación rigurosas con la secuencia diana de SEQ ID NO: 1, 2, 4 o 5, o complementos de la misma, en el que el par cebador incluye un primer cebador que tiene una secuencia que es la misma que o similar a la de una primera porción de la secuencia diana y un segundo cebador que tiene una secuencia que es complementaria de una segunda porción de la secuencia diana,

en el que al menos un cebador del par cebador diseñado para hibridar con la secuencia diana de SEQ ID NO: 2, o un complemento de la misma, en condiciones de hibridación rigurosas se diseña para hibridar con la secuencia diana de SEQ ID NO: 9 o 10, o complementos de la misma,

y determinar la cantidad de ácido nucleico del virus BK (BKV) en la muestra midiendo la amplificación de dicha secuencia diana de SEQ ID NO: 1, 2, 4 o 5, o complementos de la misma, en el que dicha amplificación detecta la presencia o ausencia de ácido nucleico de BKV.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2006/029243.

Solicitante: Focus Diagnostics, Inc.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 11331 Valley View Street Cypress, CA 90630 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: CHEN,FAN, KONG,LILLY I, CHEN,JULES, JANNATIPOUR,MEHRDAD.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/70 (en los que intervienen virus o bacteriófagos)
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Texto extraído del PDF original:

DESCRIPCION

Procedimientos y composiciones para detectar el virus BK

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El poliomavirus humano de tipo virus BK (virus BK) es un virus sin cubierta con un genoma de ADN bicatenario circular de aproximadamente 5.300 pb. El virus BK se reconoció por primera vez como miembro de la familia de los poliomavirus en 1971, después del aislamiento de la orina de un receptor de trasplante renal. La secuencia nuclear del virus BK completa se publicó tan pronto como en 1979 (Yang et al., Science 206 (4417): 456-461). Estudios posteriores han documentado una tasa mundial de seroprevalencia en adultos de más del 80 %. Típicamente, la infección primaria con el virus BK tiene lugar durante la niñez por vía respiratoria, seguida de latencia del virus en el tracto urogenital. La reactivación asintomática y propagación intermitente del virus en la orina tiene lugar espontáneamente en personas inmunocompetentes, pero son más frecuentes entre aquellas con inmunidad celular alterada, tales como mujeres embarazadas, pacientes con cáncer que reciben quimioterapia, individuos infectados con VIH-1 y receptores de aloinjertos renales u otros. La enfermedad clínica sintomática por infección por virus BK es rara y está claramente ligada al grado de inmunosupresión.

La nefropatía asociada al virus BK se ha vuelto una causa cada vez más reconocida de disfunción renal en pacientes de trasplante renal. Según estudios retrospectivos, la nefropatía por virus BK se desarrolla en un 1 a 5 % de los receptores de trasplante renal, teniendo lugar la pérdida de la función del aloinjerto en hasta el 45 % de los pacientes infectados. Aunque no está disponible una terapia antivírica específica del virus BK, en algunos casos puede controlarse la replicación del virus BK reduciendo el nivel de inmunosupresión de mantenimiento. Evidencias recientes sugieren que la detección de ADN del virus BK sigue estrechamente la evolución de la nefropatía por virus BK y puede servir como herramienta no invasiva para diagnóstico y monitorización. Por lo tanto, la cuantificación de la carga del virus BK en pacientes de trasplante renal sería útil tanto para el diagnóstico de nefropatía por virus BK como para monitorizar la respuesta a la terapia, concretamente la reducción de la inmunosupresión. Además, el virus BK se ha implicado en otras enfermedades tales como cáncer de próstata.

Se han hecho algunos intentos de proporcionar pruebas que identifiquen poliomavirus (McNees et al., Journal of Clinical Virology, 34(1): 52-62 (2005); Bergallo et al., Molecular Biotechnology 35(3): 243-25 (2007); Schaetzl et al., Journal of Medical Virology 42(2): 138-145 (1994); Watzinger et al., Journal of Clinical Microbiology, 42(11): 5189- 5198 (2004)) y de diferenciar el BKV de otros virus tales como JCV (Whiley et al., Journal of Clinical Microbiology 39(12): 4357-4361 (2001)), sin embargo, sigue existiendo la necesidad de desarrollar pruebas de diagnóstico fiables para detectar el virus BK con una sensibilidad que permita la detección de bajos títulos de virus, así como para la detección de diferentes genotipos del virus BK. Además, sigue existiendo la necesidad de una prueba de diagnóstico fiable para distinguir entre virus BK y otros poliomavirus, tales como el virus JC. Dichos ensayos son críticos para prevenir la transmisión de los virus a través de la sangre y derivados plasmáticos o por contacto personal estrecho. La presente invención afronta estas necesidades.

La bibliografía de interés incluye: Patentes de EE.UU. nº 5.213.796, 6.605.602, WO 92/19774; Anna Marta Degener, et al., J. Medical Virology 58: 413 (1999), que describe la identificación de una nueva región de control en el genoma de la cepa DPP del virus BK aislado de PBMC y Stoner et al., American J. of Kidney Diseases 33: 1102 (2002), que se refiere a transposiciones de la región reguladora del virus BK en cerebro y líquido cefalorraquídeo de un paciente de leucemia con nefritis tubulointersticial y meningoencefalitis.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención proporciona procedimientos y composiciones para una detección rápida, sensible y altamente específica basada en ácido nucleico (p.ej. basada en ADN) de un virus BK en una muestra. En general, los procedimientos implican detectar un ácido nucleico diana que tiene una secuencia diana de regiones conservadas del genoma vírico de BK. La invención presenta también pares cebadores y kits para uso en los procedimientos de la invención.

Es una ventaja de la invención que proporciona la detección del virus BK mientras que previene la detección de virus que están estrechamente relacionados genéticamente. Por tanto, la invención reduce la incidencia de falsos positivos.

Es otra ventaja de la invención que reduce la incidencia de resultados falsos negativos que pueden ser el resultado de la incapacidad de detectar variantes genéticas del virus BK (p.ej. virus BK de diferente genotipo o cepa).

Es aún otra ventaja que la invención engloba realizaciones que requieren la detección de solo una secuencia diana relativamente corta. Esto puede ser particularmente ventajoso cuando el ensayo usa tecnología basada en la amplificación, tal como PCR instantánea.

La presente invención puede desarrollarse en ensayos o fabricarse en kits para uso en laboratorios de referencia u hospitales para el diagnóstico del virus BK. El ensayo puede utilizarse también en el desarrollo y ensayos clínicos de fármacos terapéuticos para tratar enfermedades causadas por infección por BKV.

Estas y otras ventajas resultarán fácilmente evidentes para el especialista en la materia tras la lectura de la presente memoria descriptiva.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las FIG. 1A - FIG. 1AAA muestran el alineamiento de las secuencias de ácido nucleico de los 32 genotipos del virus BK. Las regiones de ácido nucleico diana para la detección del virus BK (BKV) según la invención, designándose dichas regiones como BK1, BK2, BK3, BK4 y BK5 (a las que se hace referencia también en la presente memoria como regiones diana I, II, III, IV y V, respectivamente) como se designa por el tipo de letra subrayada y por flechas de inicio y fin.

El sistema de numeración al lado derecho de la figura representa la numeración de secuencia para cada uno de los genotipos según los números respectivos de acceso a GenBank para cada genotipo o la numeración para un genoma secuenciado. Todas las referencias a numeración de secuencias de la presente memoria están basadas en la numeración de secuencia para el nº de acceso a GenBank AY628224, a menos que se indique otra cosa. Los cebadores y sondas ejemplares en las regiones diana I-V adecuados para uso en los procedimientos de la invención se indican por el tipo de letra en negrita. Las sondas adecuadas para uso en la invención incluyen cualquier secuencia situada en la secuencia de un producto de amplificación que se produciría usando dos cebadores seleccionados.

La FIG. 2 es una gráfica que muestra las curvas patrón para el ensayo instantáneo Taqman de cada una de BK1, BK2, BK3, BK4 y BK5. Las concentraciones de molde oscilaban de 50 copias por reacción a 50.000 por reacción. Se efectuaron todos los ensayos por duplicado. Para el ensayo de BK1: pendiente= -3,58, punto de corte= 43,428 y R2= 0,997. Para el ensayo de BK2: pendiente= -3,48, punto de corte= 44,053, R2= 0,999. Para el ensayo de BK3: pendiente= -3,49, punto de corte= 44,819, R2= 0,999. Para el ensayo de BK4: pendiente= -3,21, punto de corte= 41,466, R2= 0,999. Para el ensayo de BK5: pendiente= 3,61, punto de corte= 47,324, R2= 0,994.

DEFINICIONES

Los términos “virus BK” o “BKV”, como se usan en la presente memoria, hacen referencia a un virus de la familia de poliomavirus que se ha asociado a nefropatía y disfunción renal. El virus BK es un virus pequeño sin cubierta cuyo genoma incluye una molécula de ADN bicatenaria circular de aproximadamente 5.300 pb.

Los términos “polinucleótido”, “oligonucleótido”, “ácido nucleico” y “molécula de ácido nucleico” se usan intercambiablemente en la presente memoria para incluir una forma polimérica de nucleótidos, ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Este término hace referencia solo a la estructura primaria de la molécula. Por tanto, los términos incluyen ADN tri-, bi- y monocatenario, así como ARN tri-, bi- y monocatenario. Incluyen también modificaciones tales como por metilación y/o por caperuza, y formas no modificadas del polinucleótido. Más particularmente, los términos “polinucleótido”, “oligonucleótido”, “ácido nucleico” y “molécula de ácido nucleico” incluyen polidesoxirribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa), cualquier otro tipo de polinucleótido que sea un N- o C-glicósido de una base de purina o pirimidina y otros polímeros que contienen esqueletos no nucleotídicos, por ejemplo polímeros de poliamida (p.ej. ácidos peptidonucleicos (APN)) y de polimorfolino (disponible comercialmente en Anti-Virals, Inc., Corvallis, Oreg. como Neugene) y otros polímeros de ácido nucleico específicos de secuencia sintéticos, a condición de que los polímeros contengan nucleobases en una configuración que permita el apareamiento de bases y apilamiento de bases, tal como se encuentran en ADN y ARN.

A menos que se indique específicamente otra cosa, no se pretende distinción en longitud entre los términos “polinucleótido”, “oligonucleótido”, “ácido nucleico” y “molécula de ácido nucleico”, y estos términos se usarán intercambiablemente. Estos términos hacen solo referencia a la estructura primaria de la molécula. Por tanto, estos términos incluyen, por ejemplo, 3'-desoxi-2',5’-ADN, N3’,P5’ fosforamidatos de oligodesoxirribonucleótido, ARN sustituido con 2'-O-alquilo, ADN bi- y monocatenario, así como ARN bi- y monocatenario, híbridos de ADN:ARN e híbridos entre APN y ADN o ARN, e incluyen también tipos conocidos de modificaciones, por ejemplo, marcadores que son conocidos en la materia, metilación, “caperuzas”, sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural por un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como, por ejemplo, aquellas con ligamientos no cargados (p.ej. fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.), con ligamientos cargados negativamente (p.ej. fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.) y con ligamientos cargados positivamente (p.ej. aminoalquilfosforamidatos, aminoalquilfosfotriésteres), aquellos que contienen restos pendientes tales como, por ejemplo, proteínas (incluyendo nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), aquellos con intercalantes (p.ej. acridina, psoraleno, etc.), aquellos que contienen quelantes (p.ej. metales, metales radiactivos, boro, metales oxidantes, etc.), aquellos que contienen alquilantes, aquellos con ligamientos modificados (p.ej. ácidos nucleicos -anoméricos, etc.), así como formas no modificadas del polinucleótido u oligonucleótido. En particular, el ADN es ácido desoxirribonucleico.

A lo largo de la memoria descriptiva, se usan abreviaturas para hacer referencia a nucleótidos (a los que también se hace referencia como bases), incluyendo abreviaturas que hacen referencia a múltiples nucleótidos. Como se usa en la presente memoria, G= guanina, A= adenina, T= timina, C= citosina y U= uracilo. Además, R= un nucleótido de purina (A o G); Y= un nucleótido de pirimidina (A o T (U)); S= C o G; W= A o T (U); M= A o C; K= G o T (U); V= A, C o G y N= cualquier nucleótido (A, T (U), C o G). Puede hacerse referencia a los nucleótidos a lo largo de la memoria usando letras minúsculas o mayúsculas. Se entiende también que las secuencias nucleotídicas proporcionadas por el ADN de la memoria descriptiva representan también secuencias nucleotídicas para ARN en que T se sustituye por U.

Los términos “ácido desoxirribonucleico” y “ADN”, como se usan en la presente memoria, significan un polímero compuesto por desoxirribonucleótidos.

Los términos “ácido ribonucleico” y “ARN”, como se usan en la presente memoria, hacen referencia a un polímero compuesto por ribonucleótidos. Cuando se proporcionan secuencias de ácido nucleico que usan nucleótidos de una secuencia de ADN, se entiende que dichas secuencias engloban secuencias de ADN complementario y engloban adicionalmente secuencias de ARN basadas en la secuencia de ADN dada o su complemento, en que uracilo (U) reemplaza a timina (T) en la secuencia de ADN o su complemento.

Dos secuencias nucleotídicas son “complementarias” entre sí cuando esas moléculas comparten homología de organización de pares de bases. Las secuencias nucleotídicas “complementarias” se combinarán con especificidad formando un dúplex estable en condiciones de hibridación apropiadas. Por ejemplo, dos secuencias son complementarias cuando una sección de una primera secuencia puede unirse a una sección de una segunda secuencia en sentido antiparalelo, en el que el extremo 3’ de cada secuencia se une al extremo 5’ de la otra secuencia y cada A, T(U), G y C de una secuencia se alinea entonces con un T(U), A, C y G, respectivamente, de la otra secuencias. Las secuencias de ARN pueden incluir también pares de bases G=U o U=G complementarias. Por tanto, dos secuencias no tienen que tener una homología perfecta para ser “complementarias” según la invención. Habitualmente, dos secuencias son suficientemente complementarias cuando al menos aproximadamente un 85 % (preferiblemente al menos aproximadamente un 90 % y lo más preferiblemente al menos aproximadamente un 95 %) de los nucleótidos comparten organización de pares de bases en una longitud definida de la molécula.

Como se usa en la presente memoria, el término “aislado”, cuando se usa en el contexto de un compuesto aislado, hace referencia a un compuesto de interés que está en in entorno diferente de aquel en que el compuesto aparece naturalmente. “Aislado” pretende incluir compuestos que están en muestras que están sustancialmente enriquecidas en el compuesto de interés y/o en que el compuesto de interés está parcial o sustancialmente purificado. El término “aislado” engloba casos en que el material indicado no está acompañado de al menos algo del material con el que está normalmente asociado en su estado natural, constituyendo preferiblemente al menos aproximadamente un 0,5 %, más preferiblemente al menos aproximadamente un 5 % en peso de la proteína total en una muestra dada. Por ejemplo, el término “aislado” con respecto a un polinucleótido hace referencia generalmente a una molécula de ácido nucleico desprovista, en todo o en parte, de secuencias asociadas normalmente a él en la naturaleza; o una secuencia como existe en la naturaleza, pero que tiene secuencias heterólogas en asociación con la misma; o una molécula disociada del cromosoma.

"Purificado”, como se usa en la presente memoria, significa que el material indicado comprende al menos aproximadamente un 75 % en peso del material total, prefiriéndose al menos aproximadamente un 80 %, y prefiriéndose particularmente al menos un 90 %. Como se usa en la presente memoria, el término “sustancialmente puro” hace referencia a un compuesto que se retira de su entorno natural y está al menos un 60 % libre, preferiblemente un 75 % libre y lo más preferiblemente un 90 % libre de otros componentes con los que está naturalmente asociado.

Un polinucleótido “derivado de” o “específico de” una secuencia designada, tal como una secuencia diana de un ácido nucleico diana, hace referencia a una secuencia polinucleotídica que comprende una secuencia contigua de aproximadamente al menos aproximadamente 6 nucleótidos, preferiblemente al menos aproximadamente 8 nucleótidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 10-12 nucleótidos y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 15-20 nucleótidos correspondientes, concretamente idénticos a o complementarios de una región de la secuencia nucleotídica designada. El polinucleótido derivado no necesariamente derivará físicamente de la secuencia nucleotídica de interés, sino que puede generarse de cualquier manera incluyendo, pero sin limitación, síntesis química, replicación, transcripción inversa o transcripción que está basada en la información proporcionada por la secuencia de bases en la región o regiones de la que deriva o es específico el polinucleótido. Los polinucleótidos que “derivan de” o son “específicos de” una secuencia designada incluyen polinucleótidos que están en orientaciones de codificación o anticodificación respecto al polinucleótido original.

“Homología” hace referencia al porcentaje de similitud entre dos polinucleótidos o dos restos polipeptídicos. Dos ADN o dos secuencias polipeptídicas son “sustancialmente homólogas” entre sí cuando las secuencias exhiben al menos aproximadamente un 50 %, preferiblemente al menos aproximadamente un 75 %, más preferiblemente al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, preferiblemente al menos aproximadamente un 90 % y lo más preferiblemente al menos aproximadamente un 95 % o al menos un 98 % de similitud de secuencia en una longitud definida de las moléculas. Como se usa en la presente memoria, sustancialmente homólogo hace referencia también a secuencias que muestran una identidad de secuencia completa con la secuencia de ADN o polipéptido especificada.

En general, “identidad” hace referencia a una correspondencia de nucleótido a nucleótido o aminoácido a aminoácido exacta de dos secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas, respectivamente. El porcentaje de identidad puede determinarse mediante una comparación directa de la información de secuencia entre dos moléculas alineando las secuencias, contando el número exacto de coincidencias entre las dos secuencias alineadas, dividiendo entre la longitud de la secuencia más corta y multiplicando el resultado por 100.

Pueden usarse programas informáticos fácilmente disponibles para ayudar al análisis de homología e identidad, tales como Lasergene de DNASTAR, Inc. y ALIGN, Dayhoff, M. O. en “Atlas of Protein Sequence and Structure” M.

O. Dayhoff ed., 5 Supl. 3: 353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC, que adapta el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Advances in AppI. Math. 2: 482-489, 1981 al análisis de péptidos. Los programas para determinar la homología de secuencia nucleotídica están disponibles en el Wisconsin Sequence Analysis Package, versión 8 (disponible en el Genetics Computer Group, Madison, Wis.), por ejemplo, los programas BESTFIT, FASTA y GAP, que se basan también en el algoritmo de Smith y Waterman. Estos programas se utilizan fácilmente con los parámetros por defecto recomendados por el fabricante y descritos en el Wisconsin Sequence Analysis Package al que se hace referencia anteriormente. Por ejemplo, puede determinarse el porcentaje de homología de una secuencia nucleotídica particular con una secuencia de referencia usando el algoritmo de homología de Smith y Waterman con una tabla de puntuación por defecto y una penalización por hueco de 6 posiciones nucleotídicas.

Otro procedimiento para establecer el porcentaje de homología en el contexto de la presente invención es usar el paquete de programas MPSRCH registrado por la University of Edinburgh, desarrollado por John F. Collins y Shane S. Sturrok, y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, Calif.). En este conjunto de programas, puede emplearse el algoritmo de Smith-Waterman en que se usan los parámetros por defecto para la tabla de puntuación (por ejemplo, una penalización por apertura de hueco de 12, penalización por extensión de hueco de 1 y un hueco de 6). A partir de los datos generados, el valor de “coincidencia” refleja la “homología de secuencia”. Son generalmente conocidos en la materia otros programas adecuados para calcular el porcentaje de identidad o similitud entre secuencias, por ejemplo otro programa de alineamiento es BLAST, usado con los parámetros por defecto. Por ejemplo, pueden usarse BLASTN y BLASTP usando los siguientes parámetros por defecto: código genético= estándar; filtro= ninguno; hebra= ambas; corte= 60; expectativa= 10; matriz=BLOSUM62; descripciones= secuencias; clasificado por= ALTA PUNTUACIÓN; bases de datos= no redundantes, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+traducciones CDS de GenBank+Swiss protein+Spupdate+PIR. Pueden encontrarse los detalles de estos programas en internet en un sitio web patrocinado por el National Center for Biotechnology Information (NCBI) y la National Library of Medicine (véase el sitio web en ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST).

Como alternativa, puede determinarse la homología por hibridación de polinucleótidos en condiciones que formen dúplex estables entre regiones homólogas, seguida de digestión con nucleasa o nucleasas específicas de monocatenarios y determinación del tamaño de los fragmentos digeridos. Pueden identificarse las secuencias de ADN que son sustancialmente homólogas en un experimento de hibridación Southern, por ejemplo, en condiciones rigurosas como se definen para ese sistema particular. Definir las condiciones de hibridación apropiadas está dentro de los conocimientos de un especialista en la materia. Véase, p.ej. Sambrook et al., supra; “DNA Cloning”, supra; “Nucleic Acid Hybridization”, supra.

"Recombinante", como se usa en la presente memoria para describir una molécula de ácido nucleico, hace referencia a un polinucleótido de origen genómico, ADNc, mamífero, bacteriano, vírico, semisintético, sintético u otro que, en virtud de su origen, manipulación o ambos, no está asociado a todo o una porción del polinucleótido con el que está asociado en la naturaleza. El término “recombinante”, como se usa con respecto a una proteína o polipéptido significa un polipéptido producido por expresión de un polinucleótido recombinante.

Un “elemento de control” hace referencia a una secuencia polinucleotídica que ayuda a la transcripción y/o traducción de una secuencia nucleotídica a la que está ligada. El término incluye promotores, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores en dirección 5’, señales de poliadenilación, regiones no traducidas incluyendo 5'-UTR y 3'-UTR y, cuando sea apropiado, secuencias líder y potenciadores, que proporcionan o facilitan colectivamente la transcripción y traducción de una secuencia de codificación en una célula hospedadora.

Una “ADN polimerasa dependiente de ADN” es una enzima que sintetiza una copia de ADN complementaria a partir de un molde de ADN. Los ejemplos incluyen ADN polimerasa I de E. coli y ADN polimerasa de bacteriófago T7. Todas las ADN polimerasas dependientes de ADN requieren un cebador complementario para iniciar la síntesis. En condiciones adecuadas, una ADN polimerasa dependiente de ADN puede sintetizar una copia de ADN complementario a partir de un molde de ARN.

Como se usa en la presente memoria, el término “región de ácido nucleico diana” o “ácido nucleico diana” o “moléculas diana” hace referencia a una molécula de ácido nucleico con una “secuencia diana” para detectar (p.ej. por amplificación). El ácido nucleico diana puede ser monocatenario o bicatenario y puede incluir o no otras secuencias además de la secuencia diana (p.ej. el ácido nucleico diana puede incluir o no secuencias de ácido nucleico en dirección 5’ o secuencia flanqueante 5’, puede incluir o no secuencias en dirección 3’ o flanqueantes 3’ y, en algunas realizaciones, puede no incluir secuencias de ácido nucleico en dirección 5' o dirección 3’ respecto a la secuencia diana. Cuando la detección es por amplificación, estas otras secuencias además de la secuencia diana pueden amplificarse o no con la secuencia diana.

El término “secuencia diana” o “secuencia de ácido nucleico diana” hace referencia a la secuencia nucleotídica particular del ácido nucleico diana para detectar (p.ej., mediante amplificación). La secuencia diana puede incluir una región de hibridación con sonda contenida en la molécula diana con la que una sonda formará un híbrido estable en las condiciones deseadas. La “secuencia diana” puede incluir también las secuencias complejantes con que los cebadores oligonucleotídicos se complejan y extenderse usando la secuencia diana como molde. Cuando el ácido nucleico diana es monocatenario, el término “secuencia diana” hace referencia también a la secuencia complementaria de la “secuencia diana” como se presenta en el ácido nucleico diana. Si el “ácido nucleico diana” es originalmente bicatenario, el término “secuencia diana” hace referencia tanto a las hebras más (+) como menos (-). La invención contempla también regiones diana que tienen toda la longitud de las secuencias proporcionadas en la presente memoria, así como fragmentos o subsecuencias de dichas regiones diana, y secuencias complementarias de las mismas. Los términos “fragmento” y “subsecuencia” se usan intercambiablemente en este contexto. Además, cuando se proporcionan en la presente memoria secuencias de una “secuencia diana”, se entiende que la secuencia puede ser de ADN o ARN. Por tanto, cuando se proporciona una secuencia de ADN, se contempla también la secuencia de ARN y se proporciona fácilmente sustituyendo la “T” de la secuencia de ADN por “U”, proporcionando la secuencia de ARN.

El término “cebador” o “cebador oligonucleotídico”, como se usa en la presente memoria, hace referencia a un oligonucleótido que actúa iniciando la síntesis de una hebra de ácido nucleico complementaria cuando se dispone en condiciones en que se induce la síntesis de un producto de extensión de cebador, p.ej. en presencia de nucleótidos y un agente inductor de la polimerización tal como una ADN o ARN polimerasa a una temperatura, pH, concentración de metal y concentración salina adecuados. Los cebadores son generalmente de una longitud compatible con su uso en la síntesis de productos de extensión de cebador, y están habitualmente en el intervalo de entre 8 y 100 nucleótidos de longitud, tal como 10 a 75, 15 a 60, 15 a 40, 18 a 30, 20 a 40, 21 a 50, 22 a 45, 25 a 40, y demás, más típicamente en el intervalo de entre 18-40, 20-35, 21-30 nucleótidos de largo, y cualquier longitud entre los intervalos indicados. Los cebadores típicos pueden estar en el intervalo de entre 10-50 nucleótidos de largo, tal como 15-45, 18-40, 20-30, 21-25 y demás, y cualquier longitud entre los intervalos indicados. En algunas realizaciones, los cebadores son habitualmente de no más de aproximadamente 10, 12, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o 70 nucleótidos de longitud.

Los cebadores son habitualmente monocatenarios para una máxima eficacia de amplificación, pero como alternativa, pueden ser bicatenarios. Si son bicatenarios, el cebador se trata habitualmente en primer lugar para separar sus hebras antes de usarse para preparar productos de extensión. Esta etapa de desnaturalización se efectúa típicamente con calor, pero como alternativa puede llevarse a cabo usando base, seguido de neutralización. Por tanto, un “cebador” es complementario de un molde y se compleja mediante enlaces de hidrógeno o hibridación con el molde, dando un complejo de cebador/molde para la iniciación de la síntesis por una polimerasa que se extiende mediante la adición de bases unidas covalentemente ligadas en su extremo 3’ complementario al molde en el proceso de síntesis de ADN.

Un “par cebador”, como se usa en la presente memoria, hace referencia a un primer y segundo cebadores que tienen una secuencia de ácido nucleico adecuada para la amplificación basada en ácido nucleico de un ácido nucleico diana. Dichos pares cebadores incluyen generalmente un primer cebador que tiene una secuencia que es la misma o similar a la de una primera porción de un ácido nucleico diana, y un segundo cebador que tiene una secuencia que es complementaria de una segunda porción de un ácido nucleico diana, proporcionando la amplificación del ácido nucleico diana o fragmento del mismo. La referencia a “primer” y “segundo” cebadores en la presente memoria es arbitraria, a menos que se indique específicamente otra cosa. Por ejemplo, el primer cebador puede designarse como “cebador de codificación” (que inicia la síntesis de ácido nucleico a partir del extremo 5’ del ácido nucleico diana) o como “cebador inverso” (que inicia la síntesis de ácido nucleico desde el extremo 5’ del producto de extensión producido por la síntesis iniciada por el cebador de codificación). Igualmente, el segundo cebador puede designarse como cebador de codificación o cebador inverso.

Como se usa en la presente memoria, el término “sonda” o “sonda oligonucleotídica”, usado intercambiablemente en la presente memoria, hace referencia a una estructura compuesta por un polinucleótido como se define anteriormente que contiene una secuencia de ácido nucleico complementaria de una secuencia de ácido nucleico presente en el analito de ácido nucleico diana (p.ej. un producto de amplificación de ácido nucleico). Las regiones polinucleotídicas de las sondas pueden estar compuestas por ADN y/o ARN y/o análogos nucleotídicos sintéticos. Las sondas son generalmente de una longitud compatible con su uso en la detección específica de toda o una porción de una secuencia diana de un ácido nucleico diana, y están habitualmente en el intervalo de entre 8 a 100 nucleótidos de longitud, tal como 8 a 75, 10 a 74, 12 a 72, 15 a 60, 15 a 40, 18 a 30, 20 a 40, 21 a 50, 22 a 45, 25 a 40, y demás, más típicamente en el intervalo de entre 18-40, 20-35, 21-30 nucleótidos de largo, y cualquier longitud entre los intervalos indicados. La sonda típica está en el intervalo de entre 10-50 nucleótidos de largo, tal como 15- 45, 18-40, 20-30, 21-28, 22-25 y demás, y cualquier longitud entre los intervalos indicados. En algunas realizaciones, los cebadores no son habitualmente de más de aproximadamente 10, 12, 15, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o 70 nucleótidos de longitud.

Las sondas contempladas en la presente memoria incluyen sondas que incluyen un marcador detectable. Por ejemplo, cuando se va a usar una “sonda oligonucleotídica” en un ensayo de 5’ nucleasa, tal como el ensayo TaqMan™, la sonda incluye al menos un fluorescente y al menos un apagador que se digiere por la actividad 5’ endonucleasa de la polimerasa usada en la reacción para detectar cualquier secuencia oligonucleotídica diana amplificada. En este contexto, la sonda oligonucleotídica tendrá un número suficiente de ligamientos fosfodiéster adyacentes a su extremo 5’, de modo que la actividad nucleasa 5’ a 3’ empleada pueda degradar eficazmente la sonda unida para separar los fluorescentes y apagadores. Cuando se usa una sonda oligonucleotídica en la técnica de TMA, estará marcada adecuadamente, como se describe a continuación.

Como se usa en la presente memoria, los términos “marcador” y “marcador detectable” hacen referencia a una molécula que se puede detectar incluyendo, pero sin limitación, isótopos radiactivos, fluorescentes, quimioluminiscentes, cromóforos, enzimas, sustratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, cromóforos, tintes, iones metálicos, soles metálicos, ligandos (p.ej. biotina, avidina, estreptavidina o haptenos) y similares. El término “fluorescente” hace referencia a una sustancia o porción de la misma que puede exhibir fluorescencia en el intervalo detectable.

Los términos “hibridar” e “hibridación” hacen referencia a la formación de complejos entre secuencias nucleotídicas que son suficientemente complementarias para formar complejos por apareamiento de bases de Watson-Crick. Cuando un cebador “hibrida” con la diana (molde), dichos complejos (o híbridos) son suficientemente estables para servir a la función de cebado requerida, p.ej. por la ADN polimerasa, para iniciar la síntesis de ADN.

El término “condiciones rigurosas” hace referencia a condiciones en las que un cebador hibridará preferencialmente con, o se unirá específicamente con, su copartícipe de unión complementario y, en una menor extensión o nada en absoluto, con otras secuencias. Dicho de otro modo, el término “condiciones de hibridación rigurosas”, como se usa en la presente memoria, hace referencia a condiciones que son compatibles con producir dúplex en una superficie de matriz entre miembros de unión complementarios, p.ej. entre sondas y dianas complementarias en una muestra, p.ej. dúplex de sondas de ácido nucleico tales como sondas de ADN y sus correspondientes dianas de ácido nucleico que están presentes en la muestra, p.ej. sus correspondientes analitos de ARNm presentes en la muestra.

Como se usa en la presente memoria, el término “par de unión” hace referencia a una primera y segunda moléculas que se unen específicamente entre sí, tal como pares polinucleotídicos complementarios capaces de formar dúplex de ácido nucleico. La “unión específica” del primer miembro del par de unión al segundo miembro del par de unión en una muestra se evidencia por la unión del primer miembro al segundo miembro, o viceversa, con mayor afinidad y especificidad que a otros componentes de la muestra. La unión entre los miembros del par de unión es típicamente no covalente.

Se entiende por “se une selectivamente” que la molécula se une preferencialmente a la diana de interés o se une con mayor afinidad a la diana que a otras moléculas. Por ejemplo, una molécula de ADN se unirá a una secuencia sustancialmente complementaria y no a secuencias no relacionadas.

Una “hibridación rigurosa” y las “condiciones de lavado de hibridación rigurosas”, en el contexto de hibridación de ácido nucleico (p.ej. como en hibridaciones en matriz, Southern o Northern), son dependientes de la secuencia y son diferentes según los diferentes parámetros ambientales. Las condiciones de hibridación rigurosas que pueden usarse para identificar ácidos nucleicos dentro del alcance de la invención pueden incluir, p.ej. hibridación en un tampón que comprende 50 % de formamida, 5xSSC y 1 % de SDS a 42 ºC, o hibridación en un tampón que comprende 5xSSC y 1 % de SDS a 65 ºC, ambas con un lavado de 0,2xSSC y 0,1 % de SDS a 65 ºC. Las condiciones de hibridación rigurosas ejemplares pueden incluir también hibridación en un tampón de 40 % de formamida, NaCl 1 M y 1 % de SDS a 37 ºC, y un lavado en 1xSSC a 45 ºC. Como alternativa, pude emplearse una hibridación con ADN unido a filtro en NaHPO4 0,5 M, 7 % de dodecilsulfato de sodio (SDS), EDTA 1 mM a 65 ºC y lavado en 0,1xSSC/0,1 % de SDS a 68 ºC. Otras condiciones de hibridación rigurosas adicionales incluyen hibridación a 60 ºC o más y 3 x SSC (cloruro de sodio 450 mM/citrato de sodio 45 mM) o incubación a 42 ºC en una solución que contiene 30 % de formamida, NaCl 1 M, 0,5 % de sarcosina de sodio, MES 50 mM, pH 6,5. Los especialistas en la materia reconocerán fácilmente que pueden utilizarse condiciones de hibridación y lavado alternativas, pero comparables, proporcionando condiciones de rigor similar.

En ciertas realizaciones, es el rigor de las condiciones de lavado lo que expone las condiciones que determinan si un ácido nucleico hibrida específicamente con una sonda. Las condiciones de lavado usadas para identificar ácidos nucleicos pueden incluir, p.ej. una concentración salina aproximadamente 0,02 M a pH 7 y una temperatura de al menos aproximadamente 50 o aproximadamente 55 a aproximadamente 60 ºC; o una concentración salina de NaCl aproximadamente 0,15 M a 72 ºC durante aproximadamente 15 minutos; o una concentración salina de aproximadamente 0,2xSSC a una temperatura de al menos aproximadamente 50 o aproximadamente 55 a aproximadamente 60 ºC, durante aproximadamente 15 a aproximadamente 20 minutos; o el complejo de hibridación se lava dos veces con una solución con una concentración salina de aproximadamente 2xSSC que contiene 0,1 % de SDS a temperatura ambiente durante 15 minutos y se lava entonces dos veces con 0,1xSSC que contiene 0,1 % de SDS a 68 ºC durante 15 minutos; o condiciones equivalentes. Las condiciones rigurosas para lavado pueden ser también, p.ej., 0,2xSSC/0,1 % de SDS a 42 ºC. En casos en los que las moléculas de ácido nucleico sean desoxioligonucleótidos (“oligos”), las condiciones rigurosas pueden incluir lavado con 6xSSC/0,05 % de pirofosfato de sodio a 37 ºC (para oligos de 14 bases), a 48 ºC (para oligos de 17 bases), a 55 ºC (para oligos de 20 bases) y a 60 º C (para oligos de 23 bases). Véase Sambrook, Ausubel o Tijssen (citados a continuación) para descripciones detalladas de condiciones de hibridación y lavado y reactivos y tampones equivalentes, p.ej. tampones SCC y reactivos y condiciones equivalentes.

Las condiciones de hibridación rigurosas son condiciones de hibridación que son al menos tan rigurosas como las condiciones representativas anteriores, en que las condiciones se considera que son al menos tan rigurosas si son al menos aproximadamente un 80 % tan rigurosas, típicamente al menos aproximadamente un 90 % tan rigurosas como las condiciones rigurosas específicas anteriores. Son conocidas en la materia otras condiciones de hibridación rigurosas y pueden emplearse también, según sea apropiado.

La “temperatura de fusión” o “Tm” del ADN bicatenario se define como la temperatura a la que la mitad de la estructura helicoidal del ADN se pierde debido al calentamiento u otra disociación del enlace de hidrógeno entre pares de bases, por ejemplo, por tratamiento ácido o alcalino o similar. La Tm de una molécula de ADN depende de su longitud y de su composición de bases. Las moléculas de ADN ricas en pares de bases GC tienen una mayor Tm que aquellas que tienen abundancia de pares de bases AT. Las hebras complementarias separadas de ADN se reasocian o emparejan espontáneamente formando ADN dúplex cuando la temperatura se baja por debajo de la Tm. La tasa más alta de hibridación de ácido nucleico tiene lugar aproximadamente a 25 ºC por debajo de la Tm. La Tm puede estimarse usando la siguiente relación: Tm= 69,3+0,41(% de GC) (Marmur et al. (1962) J. Mol. BioI. 5: 109- 118).

Como se usa en la presente memoria, una “muestra biológica” hace referencia a una muestra de tejido o fluido aislada de un sujeto, que en el contexto de la invención hace referencia generalmente a muestras sospechosas de contener ácido nucleico y/o partículas víricas de virus BK, pudiendo dichas muestras, después de procesamiento adicional, analizarse en un ensayo in vitro. Las muestras de interés típicas incluyen, pero no está necesariamente limitadas a, secreciones respiratorias (p.ej. muestras obtenidas de fluidos o tejido de los conductos nasales, pulmón y similares), sangre, plasma, suero, células sanguíneas, líquido cefalorraquídeo, materia fecal, orina, lágrimas, saliva, leche, órganos, biopsias y secreciones de los tractos intestinal y respiratorio. La muestras incluyen también muestras de constituyentes de cultivo celular in vitro incluyendo, pero sin limitación, medios acondicionados resultantes del crecimiento de células y tejidos en medio de cultivo, p.ej. células recombinantes y componentes celulares.

El término “valorar” incluye cualquier forma de medida, e incluye determinar si un elemento está presente o no. Los términos “determinar”, “medir”, “evaluar”, “valorar” y “ensayar” se usan intercambiablemente e incluyen determinaciones cuantitativas y cualitativas. La valoración puede ser relativa o absoluta. “Valorar la presencia de” incluye determinar la cantidad de algo presente y/o determinar si está presente o ausente. Como se usan en la presente memoria, los términos “determinar”, “medir” y “valorar” y “ensayar” se usan intercambiablemente e incluyen determinaciones tanto cuantitativas como cualitativas.

En el contexto de los procedimientos que implican la amplificación basada en ácido nucleico de una secuencia diana, el término “intervalo de referencia” hace referencia a un intervalo de valores de CT (ciclo umbral) de especímenes negativos del virus BK representativos de resultados que se considera que indican que la muestra (p.ej. un espécimen de paciente) es negativa del virus BK.

En el contexto de los procedimientos que implican la amplificación basada en ácido nucleico de una secuencia diana, el término “intervalo reseñable” hace referencia a un intervalo de valores de CT generados por especímenes positivos del virus BK que son representativos de resultados que se reseñan como especímenes de paciente positivos del virus BK.

“Especificidad analítica”, como se usa en la presente memoria, hace referencia a la capacidad de un sistema de detección de detectar específicamente el virus diana y no detectar otros virus relacionados, o flora patógena o comensal encontrada en los tipos de espécimen que se están validando. Por ejemplo, “especificidad analítica”, con referencia a ensayos que usan cebadores y una sonda del virus BK, hace referencia a la capacidad de este sistema de detección de amplificar y detectar específicamente el virus diana y no detectar otros virus relacionados, o flora patógena o comensal encontrada en los tipos de espécimen que se están validando.

“Sensibilidad analítica”, en el contexto de los procedimientos que implican la amplificación basada en ácidos nucleicos de una secuencia diana, hace referencia a la cantidad menor mensurable de ADN diana del virus BK que puede detectarse para cada tipo de espécimen validado.

“Precisión” hace referencia a la capacidad de un ensayo de generar reproduciblemente un resultado igual o comparable para una muestra dada.

“Exactitud” hace referencia a la capacidad de un ensayo de detectar correctamente una molécula diana en un panel con anonimato que contiene especímenes tanto positivos como negativos.

Se observa adicionalmente que las reivindicaciones pueden redactarse para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, esta afirmación se pretende que sirva como base antecedente para el uso de aquella terminología excluyente como “únicamente”, “solo” y similares con relación a la enumeración de los elementos de la reivindicación, o el uso de una limitación “negativa”.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que está englobado en la invención cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto dicte claramente otra cosa, entre el límite superior e inferior de ese intervalo, y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese intervalo indicado. Los límites superior e inferior de estos intervalos menores pueden incluirse independientemente en los intervalos menores, y están también englobados en la invención, sujetos a cualquier límite específicamente excluyente en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, se incluyen también en la invención los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de estos límites incluidos.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un especialista en la materia a la que pertenece la invención. Aunque puede usarse cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria en la práctica o ensayo de la presente invención, se describen ahora los procedimientos y materiales preferidos.

Debe observarse que, como se usa en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “y” y “el” incluyen los referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Por tanto, por ejemplo, la referencia a un “cebador oligonucleotídico” incluye una pluralidad de dichos cebadores, y la referencia a “cebador” incluye la referencia a uno o más de los cebadores y equivalentes de los mismos conocidos por los especialistas en la materia, y demás.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, procedimientos convencionales de química, bioquímica, técnicas de ADN recombinante y virología dentro de los conocimientos de un especialista en la materia. Dichas técnicas se explican enteramente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, “Fundamental Virology”, 2ª edición, vol. I y II (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.); A. L. Lehninger, “Biochemistry” (Worth Publishers, Inc., edición actual); Sambrook, et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (2ª edición, 1989); “Methods In Enzymology” (S. Colowick y N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); “Oligonucleotide Synthesis” (N. Gait, ed., 1984); “A Practical Guide to Molecular Cloning” (1984).

La invención se describirá ahora con más detalle.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La invención está basada en el descubrimiento de regiones de ácido nucleico diana de consenso en el genoma del virus BK (BKV) que incluyen secuencias de ácido nucleico diana (a las que se hace referencia también en la presente memoria como secuencias diana) para la detección de BKV en una muestra, particularmente una muestra biológica, con especificidad y sensibilidad. En particular, la detección de una o más regiones de secuencia de ácido nucleico diana permite la detección de BKV en una muestra, en general, mientras que es también capaz de discriminar entre, por ejemplo, BKV y virus JC (JCV) y/o BKV y SV40. La especificidad y simplicidad de estos ensayos facilita ensayos rápidos, fiables y económicos para la detección de BKV en general. La invención en cuestión encuentra uso en una variedad de diferentes aplicaciones, incluyendo aplicaciones de investigación, médicas, de desarrollo de fármacos y de diagnóstico.

En general, los procedimientos dados a conocer proporcionan la detección de BKV en una muestra, tal como una muestra biológica, mediante la detección de una región de ácido nucleico diana del genoma de BKV. Se describen en la presente memoria cinco de dichas regiones de ácido nucleico diana, denominadas regiones diana I-V como se designan en la Figura 1.

Los procedimientos dados a conocer proporcionan la detección de cualquier aislamiento de BKV en una muestra tal como una muestra biológica. Dichos procedimientos detectan una región de ácido nucleico diana, o fragmento de la misma, usando cebadores y sonda que corresponden a secuencias dentro de la región diana. Se proporcionan en la Tabla 1 cebadores ejemplares en las regiones diana I-V adecuados para uso en los procedimientos. Las sondas adecuadas para uso en la invención incluyen cualquier secuencia situada dentro de la secuencia de un producto de amplificación que se produciría usando cebadores seleccionados. Se selecciona una sonda adecuada para uso con dicha realización de tal modo que corresponda a una región que comparte una secuencia nucleotídica entre los diferentes aislamientos de BKV para detectar.

Se observa que las secuencias proporcionadas en la presente memoria, y particularmente las secuencias de consenso, se proporcionan como secuencias de ADN. Se entiende que las secuencias de ADN proporcionadas pueden ser monocatenarias o bicatenarias, y como tal la descripción de las secuencias de ADN siguientes se pretende que proporcione también la secuencia complementaria además.

Se describirán ahora con más detalle las composiciones y procedimientos de la invención.

REGIONES DE ÁCIDO NUCLEICO DIANA

Las regiones de secuencia de ácido nucleico diana se identificaron mediante alineamiento de diversos genomas de aislamiento de BKV. La presente invención proporciona la identificación de BKV en una muestra, tal como una muestra biológica, mediante la detección de una o más regiones de ácido nucleico diana o una porción de las mismas. En general, la detección es mediante amplificación de ácido nucleico, que en algunas realizaciones está seguida por la detección del producto de amplificación usando una sonda de hibridación. Se describen con más detalle a continuación las regiones de ácido nucleico diana.

Se apreciará que, puesto que el BKV contiene un genoma de ADN bicatenario del que se genera ARN durante la replicación vírica, los cebadores y sondas descritos en la presente memoria engloban aquellos que tienen la secuencia de ácido nucleico descrita en la presente memoria, así como los cebadores y sondas que tienen el complemento de dichas secuencias de ácido nucleico.

Además, se entenderá que los pares cebadores útiles en la invención incluyen un primer cebador que tiene una secuencia que es la misma que o similar a la de la secuencia de BKV proporcionada en la presente memoria, y un segundo cebador que tiene una secuencia que es complementaria de la secuencia de BKV proporcionada en la presente memoria, proporcionando la amplificación de una región de ácido nucleico diana de BKV descrita en la presente memoria o un fragmento de la misma (p.ej., el primer cebador es un cebador “de codificación” y el segundo cebador es un cebador “inverso”). Se entenderá adicionalmente que los pares cebadores útiles en la invención incluyen también un primer cebador que tiene una secuencia que es complementaria de la de la secuencia de BKV proporcionada en la presente memoria, y un segundo cebador que es el mismo que o similar a la secuencia de BKV proporcionada en la presente memoria, proporcionando la amplificación de una región de ácido nucleico diana de BKV descrita en la presente memoria o un fragmento de la misma (p.ej., el primer cebador es un cebador “inverso” y el segundo cebador es un cebador “de codificación”).

Se entenderá también que la secuencia de ácido nucleico de las sondas descritas en la presente memoria puede ser la misma que o similar a la secuencia de BKV proporcionada o un complemento de la misma. Además, los cebadores descritos en la presente memoria pueden usarse también como sondas, p.ej., para detectar un producto de amplificación.

Región diana I (BK1)

En una realización, la invención proporciona la detección de BKV en una muestra, tal como una muestra biológica, mediante la detección de una región de secuencia de ácido nucleico diana I (Figura 1, región diana I) (a la que se hace también referencia como BK1), posición de alineamiento 435-585 basada en la numeración del nº de acceso a GenBank AY628224) como sigue: o un complemento de la misma, o un fragmento de la misma, en la que el extremo 5’ y 3’ del ácido nucleico está contenido en la SEQ ID NO:01. Esta secuencia conservada en el genoma de BKV se muestra en el alineamiento de la FIG. 1. En una realización de particular interés, la región diana es una subsecuencia de la región diana I, tal como o un complemento de la misma o un fragmento de la misma.

Las secuencias de ácido nucleico ejemplares adecuadas para el diseño de cebadores para amplificación de un ácido nucleico de región diana I, y adecuadas para uso en los procedimientos de la invención, se indican por el tipo de letra subrayado en la Figura 1. Las secuencias adecuadas para cebadores para la amplificación del ácido nucleico de la región diana I corresponden a los nucleótidos 1-26 y 94-119 de la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:01, o un complemento de la misma.

Las sondas adecuadas para uso en la invención pueden diseñarse a partir de cualquier secuencia situada dentro de la secuencia de un producto de amplificación que se produciría usando dos cebadores seleccionados. Las secuencias adecuadas para uso como sonda para la detección del ácido nucleico de la región diana I corresponden a los nucleótidos 57-90 de la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:01, o un complemento de la misma.

En una realización, la detección del ácido nucleico de la región diana I implica la producción de un producto de amplificación de al menos 151, al menos 145, al menos 140, al menos 135, al menos 130, al menos 125, al menos 120, al menos 115, al menos 110, al menos 105, al menos 100, al menos 95, al menos 90, al menos 85, al menos 80, al menos 75, al menos 70, al menos 65, al menos 60, al menos 55, al menos 50, al menos 45, al menos 40, al menos 35, al menos 30, al menos 28, al menos 26, al menos 24, al menos 22 o al menos 20 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID NO:01.

Los procedimientos de la invención pueden implicar la detección del ácido nucleico de la región diana I sola o en combinación con la detección de una o más de las regiones diana II-V como se describen en la presente memoria. Por ejemplo, los procedimientos de la invención pueden implicar la detección de la región diana I (BK1) y la región diana II (BK2); la región diana I (BK1) y la región diana III (BK3); la región diana I (BK1) y la región diana IV (BK4); la región diana I (BK1) y la región diana V (BK5); la región diana I (BK1), la región diana II (BK2) y la región diana III (BK3); la región diana I (BK1), la región diana IV (BK4) y la región diana V (BK5); la región diana I (BK1), la región diana III (BK3) y la región diana V (BK5) y similares. Se entenderá que se contempla por los presentes procedimientos la detección de todas las combinaciones de regiones diana I-V.

Se discuten con más detalle a continuación cebadores y sondas ejemplares.

Región diana II (BK2)

En una realización, la invención proporciona la detección de BKV en una muestra, tal como una muestra biológica, mediante la detección de la región de secuencia de ácido nucleico diana II (Figura 1, región diana II (a la que se hace referencia también como BK2), posición de alineamiento 1418-1545 basada en la numeración del nº de acceso a GenBank AY628224) como sigue: o un complemento de la misma, o un fragmento de la misma, en la que el extremo 5’ y 3’ del ácido nucleico está contenido en la SEQ ID NO:02. Esta secuencia conservada como se encuentra en el genoma BKV se ilustra en el alineamiento de la FIG. 1 En una realización de particular interés, la región diana es una subsecuencia de la región diana II, tal como o un complemento de la misma o un fragmento de la misma.

Las secuencias de ácido nucleico adecuadas para el diseño de cebadores para la amplificación de un ácido nucleico de la región II de secuencia diana, y adecuadas para uso en los procedimientos de la invención, se indican por el tipo de letra subrayado en la Figura 1. Las secuencias adecuadas para cebadores para la amplificación del ácido nucleico de la región diana II corresponden a los nucleótidos 33-50 y 82-104 de la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:02, o un complemento de la misma.

Las sondas adecuadas para uso en la invención pueden diseñarse a partir de cualquier secuencia situada dentro de la secuencia de un producto de amplificación que se produciría usando dos cebadores seleccionados. Las secuencias adecuadas para uso como sonda para la detección del ácido nucleico de la región diana II corresponden a los nucleótidos 52-80 de la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:02, o un complemento de la misma.

En una realización, la detección del ácido nucleico de la región diana II implica la producción de un producto de amplificación de al menos 128, al menos 120, al menos 110, al menos 100, al menos 90, al menos 80, al menos 75, al menos 70, al menos 65, al menos 60, al menos 55, al menos 50, al menos al menos 45, 40, al menos 35, al menos 30, al menos 28, al menos 26, al menos 24, al menos 22, al menos 20 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID NO:02.

Los procedimientos de la invención pueden implicar la detección del ácido nucleico de la región diana II sola o en combinación con la detección de una o más de las regiones diana I y III-V como se describen en la presente memoria. Por ejemplo, los procedimientos de la invención pueden implicar la detección de la región diana II (BK2) y la región diana I (BK1); la región diana II (BK2) y la región diana III (BK3); la región diana II (BK2) y la región diana IV (BK4); la región diana II (BK2) y la región diana V (BK5); la región diana I (BK1), la región diana II (BK2) y la región diana III (BK3); la región diana II (BK2), la región diana IV (BK4) y la región diana V (BK5); o la región diana II (BK2), la región diana III (BK3) y la región diana V (BK5) y similares. Se entenderá que está contemplada por los presentes procedimientos la detección de todas las combinaciones de regiones diana I-V.

Se discuten con más detalle a continuación cebadores y sondas ejemplares.

Región diana III (BK3)

Se da a conocer también como útil para la detección de BKV en una muestra, tal como una muestra biológica, la detección de la secuencia de ácido nucleico de la región diana III (Figura 1, región diana III (a la que se hace referencia también como BK3), posición de alineamiento 4097-4560 basada en la numeración del nº de acceso a GenBank AY628224) como sigue: o un complemento de la misma, o un fragmento de la misma, en la que el extremo 5’ y 3’ del ácido nucleico está contenido en la SEQ ID NO:03. Esta secuencia conservada en el genoma BKV se muestra en el alineamiento de los tres genomas de la FIG. 1. Preferiblemente, la región diana es una subsecuencia de la región diana III, tal como o un complemento de la misma o un fragmento de la misma.

Las secuencias de ácido nucleico ejemplares adecuadas para el diseño de cebadores para la amplificación de un ácido nucleico de la región III están indicadas por el tipo de letra subrayado en la Figura 1. Las secuencias adecuadas para cebadores para la amplificación del ácido nucleico de la región diana III corresponden a los nucleótidos 280-306 y 355-380 de la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:03, o un complemento de la misma.

Las sondas pueden diseñarse a partir de cualquier secuencia situada dentro de la secuencia de un producto de amplificación que se produciría usando dos cebadores seleccionados. Las secuencias adecuadas para uso como sonda para la detección del ácido nucleico de la región diana III corresponden a los nucleótidos 330-354 de la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:03, o un complemento de la misma.

Se da a conocer que la detección del ácido nucleico de la región diana III implica la producción de un producto de amplificación de al menos 464, al menos 425, al menos 400, al menos 375, al menos 350, al menos 325, al menos 300, al menos 275, al menos 250, al menos 225, al menos 200, al menos 175, al menos 150, al menos 125, al menos 120, al menos 115, al menos 110, al menos 100, al menos 95, al menos 90, al menos 85, al menos 80, al menos 75, al menos 70, al menos 65, al menos 60, al menos 55, al menos 50, al menos 45, al menos 40, al menos 35, al menos 30, al menos 28, al menos 26, al menos 24, al menos 22 o al menos 20 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID NO:03.

Los procedimientos pueden implicar la detección de ácido nucleico de la región diana III en combinación con la detección de una o más de las regiones I-II y IV-V como se describen en la presente memoria. Por ejemplo, los procedimientos de la invención pueden implicar la detección de la región diana III (BK3) y la región diana IV (BK4); la región diana III (BK3) y la región diana V (BK5); la región diana III (BK3) y la región diana I (BK1); la región diana III (BK3) y la región diana II (BK2); la región diana I (BK1), la región diana II (BK2) y la región diana III (BK3); la región diana III (BK3), la región diana IV (BK4) y la región diana V (BK5); o la región diana III (BK3), la región diana I (BK1) y la región diana V (BK5) y similares. Se entenderá que está contemplada por los presentes procedimientos la detección de todas las combinaciones de las regiones diana I-V.

Se discuten con más detalle a continuación cebadores y sondas ejemplares.

Región diana IV (BK4)

En otra realización, la invención proporciona la detección de BKV en una muestra, tal como una muestra biológica, mediante la detección de una secuencia de ácido nucleico de la región diana IV (Figura 1, región diana IV (a la que se hace referencia también como BK4), posición de alineamiento 612-864 basada en la numeración del nº de acceso a GenBank AY628224) como sigue: o un complemento de la misma, o un fragmento de la misma, en la que el extremo 5’ y 3’ del ácido nucleico está contenido en la SEQ ID NO:04. Esta secuencia conservada en el genoma de BKV se muestra en el alineamiento de los tres genomas de la FIG. 1 En una realización de particular interés, la región diana es una subsecuencia de la región diana IV, tal como o un complemento de la misma o un fragmento de la misma.

Las secuencias de ácido nucleico ejemplares adecuadas para el diseño de cebadores para la amplificación de un ácido nucleico de la región diana IV, y adecuadas para uso en los procedimientos de la invención, se indican por el tipo de letra subrayado en la Figura 1. Las secuencias adecuadas para cebadores para la amplificación del ácido nucleico de la región diana IV corresponden a los nucleótidos 1-19 y 76-95 de la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:04, o un complemento de la misma.

Las sondas adecuadas para uso en la invención pueden diseñarse a partir de cualquier secuencia situada dentro de la secuencia de un producto de amplificación que se produciría usando dos cebadores seleccionados. Las secuencias adecuadas para uso como sonda para la detección del ácido nucleico de la región diana IV corresponden a los nucleótidos 36-62 de la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:04, o un complemento de la misma.

En una realización, la detección del ácido nucleico de la región diana IV implica la producción de un producto de amplificación de al menos 253, al menos 250, al menos 225, al menos 200, al menos 175, al menos 150, al menos 125, al menos 120, al menos 115, al menos 100, al menos 95, al menos 90, al menos 85, al menos 80, al menos 75, al menos 70, al menos 65, al menos 60, al menos 55, al menos 50, al menos 45, al menos 40, al menos 35, al menos 30, al menos 28, al menos 26, al menos 24, al menos 22 o al menos 20 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID NO:04.

Los procedimientos de la invención pueden implicar la detección de ácido nucleico de la región diana IV sola o en combinación con la detección de una o más de las regiones diana I-III y V como se describen en la presente memoria. Por ejemplo, los procedimientos de la invención pueden implicar la detección de la región diana IV (BK4) y la región diana I (BK1); la región diana IV (BK4) y la región diana II (BK2); la región diana IV (BK4) y la región diana III (BK3); la región diana IV (BK4) y la región diana V (BK5); la región diana I (BK1), la región diana II (BK2) y la región diana IV (BK4); la región diana III (BK3), la región diana IV (BK4) y la región diana V (BK5); o la región diana I (BK1), la región diana IV (BK4) y la región diana V (BK5) y similares. Se entenderá que se contemplan por los presentes procedimientos todas las combinaciones de las regiones diana I-V.

Se discuten con más detalle a continuación cebadores y sondas ejemplares.

Región diana V

En otra realización, la invención proporciona la detección de BKV en una muestra, tal como una muestra biológica, mediante la detección de una secuencia de ácido nucleico de la región diana V (Figura 1, región diana V (a la que se hace también referencia como BK5), posición de alineamiento 2810-2895 basada en la numeración del nº de acceso a GenBank AY628224) como sigue: o un complemento de la misma, o un fragmento de la misma, en la que el extremo 5' y 3' del ácido nucleico está contenido en la SEQ ID NO:05. Esa secuencia conservada en el genoma de BKV se muestra en el alineamiento de los tres genomas de la FIG. 1. En una realización de particular interés, la región diana es una subsecuencia de la región diana V, tal como: o complemento de la misma, o un fragmento de la misma.

Las secuencias de ácido nucleico ejemplares adecuadas para el diseño de cebadores para la amplificación de un ácido nucleico de la región diana V, y adecuadas para uso en los procedimientos de la invención, se indican por el tipo de letra subrayado en la Figura 1. Las secuencias adecuadas para cebadores para la amplificación de ácido nucleico de la región diana V corresponden a los nucleótidos 2-18 y 47-64 de la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:05, o un complemento de la misma.

Las sondas adecuadas para uso en la invención pueden diseñarse a partir de cualquier secuencia situada dentro de la secuencia de un producto de amplificación que se produciría usando dos cebadores seleccionados. Las secuencias adecuadas para uso como sonda para la detección del ácido nucleico de la región diana V corresponden a los nucleótidos 19-41 de la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO:05, o un complemento de la misma.

En una realización, la detección del ácido nucleico de la región diana V implica la producción de un producto de amplificación de al menos 86, al menos 80, al menos 75, al menos 70, al menos 65, al menos 60, al menos 55, al menos 50, al menos 45, al menos 40, al menos 35, al menos 30, al menos 28, al menos 26, al menos 24, al menos 22 o al menos 20 nucleótidos consecutivos de la SEQ ID NO:05.

Los procedimientos de la invención pueden implicar la detección del ácido nucleico de la región diana V sola o en combinación con la detección de una o más regiones diana I-IV como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, los procedimientos de la invención pueden implicar la detección de la región diana V (BK5) y la región diana I (BK1); la región diana V (BK5) y la región diana II (BK2); la región diana V (BK5) y la región diana III (BK3); la región diana IV (BK4) y la región diana V (BK5); la región diana V (BK5), la región diana II (BK2) y la región diana III (BK3); la región diana III (BK3), la región diana IV (BK4) y la región diana V (BK5); o la región diana I (BK1), la región diana III (BK3) y la región diana V (BK5) y similares. Se entenderá que se contemple por los presentes procedimientos la detección de todas las combinaciones de regiones diana I-V.

Se discuten con más detalle a continuación cebadores y sondas ejemplares.

CEBADORES Y SONDAS

Como se describe anteriormente, las secuencias de ácido nucleico de las regiones diana I-V son regiones de ácido nucleico conservadas en diferentes genotipos de BKV. Los cebadores y sondas para uso en estos ensayos derivan preferiblemente de las secuencias de ácido nucleico de las regiones diana I-V como se describen anteriormente. En una realización de particular interés, los cebadores y sondas para uso con los presentes ensayos se diseñan a partir de secuencias nucleotídicas altamente conservadas de las secuencias de ácido nucleico de las regiones diana I-V.

En general, los cebadores proporcionan la amplificación de un ácido nucleico diana para producir como diana un producto de amplificación de ácido nucleico (al que se hace referencia también como “amplicón”). Los cebadores pueden usarse, y preferiblemente se usan, junto con una sonda. Los cebadores 5’ se unen generalmente a una región para proporcionar la amplificación del ácido nucleico diana, y preferiblemente se unen a una porción 5’ de la secuencia diana como se ejemplifica en la Fig. 1. Los cebadores 3’ se unen generalmente a una secuencia que es complementaria de la porción 3’ del ácido nucleico generado por la extensión del cebador 5' como se ejemplifica en la Fig. 1. Los cebadores 5’ y 3’ pueden estar separados por aproximadamente 10, 20, 30 o 40 nucleótidos contiguos, habitualmente aproximadamente 30 nucleótidos contiguos. En ciertas realizaciones, se diseñan los cebadores para tener una secuencia complementaria de uno o más nucleótidos variantes en una secuencia de la región diana y/o tener un extremo 3’ adyacente a un nucleótido variante de una secuencia de una región diana. Las sondas se designan generalmente para tener una secuencia complementaria de uno o más nucleótidos variantes dentro de una secuencia de la región diana. En algunas realizaciones que implican la detección basada en la amplificación, se diseñan las sondas para tener una secuencia complementaria de una secuencia flanqueada por la secuencia o secuencias complementarias de uno o más cebadores usados para la amplificación.

Los cebadores y sondas para uso en los ensayos de la presente memoria se diseñan basándose en la secuencia dada a conocer en la presente memoria y se sintetizan fácilmente por técnicas estándares, p.ej. síntesis en fase sólida mediante la química de fosforamidita, como se da a conocer en las patentes de EE.UU. nº 4.458.066 y 4.415.732, incorporadas a la presente memoria como referencia; Beaucage et al. (1992) Tetrahedron 48: 2223-2311 y Applied Biosystems User Bulletin nº 13 (1 de abril de 1987). Otros procedimientos de síntesis química incluyen, por ejemplo, el procedimiento de fosfotriéster descrito por Narang et al., Meth. EnzymoI. (1979) 68: 90 y el procedimiento de fosfodiéster dado a conocer por Brown et al., Meth. EnzymoI. (1979) 68: 109. Pueden incorporarse a sondas poli(A) o poli(C), u otras extensiones de nucleótidos no complementarios, usando estos mismos procedimientos. Las extensiones de óxido de hexaetileno pueden acoplarse con sondas mediante procedimientos conocidos en la materia. Cload et al. (1991) J. Am. Chem. Soc. 113: 6324-6326; patente de EE.UU. nº 4.914.210 de Levenson et al.; Durand et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 6353-6359 y Hom et al. (1986) Tet. Lett. 27: 4705-4708.

Típicamente, las secuencias cebadoras están en el intervalo de entre 10-75 nucleótidos de longitud, tal como 10 a 70, 12 a 65, 15 a 60, 20 a 55, 25 a 50, 30 a 45 y similares. Más típicamente, los cebadores están en el intervalo de entre 18 y 40, 19 y 35, 20 y 30, 21 y 29, 22 y 28, 23 y 27, 24-25 nucleótidos de largo, y cualquier longitud entre los intervalos indicados. Son de particular interés los cebadores de aproximadamente 20 a 22 nucleótidos de longitud.

La sonda típica está en el intervalo de entre 10-50 nucleótidos de largo, tal como 10 a 50, 12 a 45, 15 a 40, 20 a 35, 25 a 30 y similares. Más típicamente, las sondas están en el intervalo de entre 18 y 40,19 y 35, 20 y 30, 21 y 29, 22 y 28, 23 y 27, 24-25 nucleótidos de largo, y cualquier longitud entre los intervalos indicados. Son de particular interés las sondas de aproximadamente 20 a 22 nucleótidos de longitud.

En algunas realizaciones, los procedimientos en cuestión proporcionan la detección de cualquier genotipo de BKV en una muestra, tal como una muestra biológica. En dichas realizaciones, los procedimientos en cuestión detectan una región diana de ácido nucleico, o fragmento de la misma, usando cebadores y sonda que corresponden a secuencias dentro de la región diana. Los cebadores ejemplares dentro de las regiones diana I-V adecuadas para uso en los procedimientos de la invención se indican por el tipo de letra en negrita en la FIG. 1. Las sondas adecuadas para uso en la invención pueden diseñarse a partir de cualquier secuencia situada dentro de la secuencia de un producto de amplificación que se produciría usando dos cebadores seleccionados. Se selecciona una sonda adecuada para uso con dicha realización de tal modo que corresponda a una región que comparte secuencia nucleotídica entre los diferentes genotipos de BKV para detectar.

Los procedimientos dados a conocer pueden proporcionar la detección y discriminación entre diferentes genotipos en una muestra, tal como una muestra biológica. Los procedimientos dados a conocer pueden detectar un ácido nucleico de región diana, o fragmento del mismo, usando cebadores y sonda que corresponden a secuencias dentro de la región diana. Los cebadores ejemplares dentro de las regiones diana I-V adecuados para uso en los procedimientos se indican por tipo de letra en negrita en la Figura 1. Las sondas adecuadas para uso en la invención pueden diseñarse a partir de cualquier secuencia situada dentro de la secuencia de un producto de amplificación que se produciría usando dos cebadores seleccionados. La secuencia de la sonda se selecciona de tal modo que corresponda a una región que difiere en secuencia en uno o más nucleótidos entre los diferentes genotipos de BKV para detectar.

Se describe en la Tabla 1 las secuencias de ácido nucleico ejemplares de los genotipos de BKV que son adecuadas para uso como cebadores y sondas en los ensayos de la presente invención. La numeración de secuencia presentada en la Tabla 1 es la numeración del número de acceso a GenBank AY628224 en la FIG. 1.

Tabla 1: Secuencias de cebador y sonda ejemplares para la detección de las regiones diana I-V de ácido nucleico de BKV (secuencia proporcionada basándose en la secuencia del genoma de BKV; numeración de

secuencia basada en la numeración del nº de acceso a GenBank AY628224 de la FIG. 1)

SEC ID NO.:

Inicio

Fin

Longitud

Secuencia 5’ a 3’

Región diana I (BK1) (correspondiente a los nucleótidos 435-585 de AY628224)

Región diana II (BK2) (correspondiente a los nucleótidos 1418-1545 de AY628224)

SEC ID NO.:

Inicio

Fin

Longitud

Secuencia 5’ a 3’

Región diana III (BK3) (correspondiente a los nucleótidos 4097-4560 de AY628224)

Región diana IV (BK4) (correspondiente a los nucleótidos 612-864 de AY628224)

Región diana V (BK5) (correspondiente a los nucleótidos 2810-2895 de AY628224)

“F” hace referencia a cebador de codificación, “R” hace referencia a cebador inverso y “P” hace referencia a sonda Las sondas pueden acoplarse con marcadores para detección. Hay varios procedimientos y composiciones conocidos para derivatizar oligonucleótidos con funcionalidades reactivas que permiten la adición de un marcador. Por ejemplo, están disponibles varios enfoques biotinilación de sondas, de modo que puedan fijarse marcadores radiactivos, fluorescentes, quimioluminiscentes, enzimáticos o electrónicos densos por avidina. Véanse, p.ej. Broken

et al., Nucl. Acids Res. (1978) 5: 363-384, que da a conocer el uso de marcadores de ferritina-avidina-biotina; y Chollet et al. Nucl. Acids Res. (1985) 13: 1529-1541, que da a conocer la biotinilación de los extremos 5’ de oligonucleótidos mediante un brazo ligador de aminoalquilfosforamida. Están también disponibles varios procedimientos para sintetizar oligonucleótidos derivatizados con amino que se marcan fácilmente por compuestos fluorescentes o de otros tipos derivatizados con grupos reactivos con amino, tales como isotiocianato, N- hidroxisuccinimida o similares, véase, p.ej. Connolly (1987) Nucl. Acids Res. 15: 3131-3139, Gibson et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15: 6455-6467 y la patente de EE.UU. nº 4.605.735 de Miyoshi et al. Están también disponibles procedimientos para sintetizar oligonucleótidos derivatizados con sulfhidrilo que pueden hacerse reaccionar con marcadores específicos de tiol, véanse, p.ej. la patente de EE.UU. nº 4.757.141 de Fung et al., Connolly et al. (1985) Nuc. Acids Res. 13: 4485-4502 y Spoat et al. (1987) NucI. Acids Res. 15: 4837-4848. Se proporciona una revisión integral de las metodologías para marcar fragmentos de ADN en Matthews et al., Anal. Biochem. (1988) 169: 1-25.

Por ejemplo, las sondas pueden marcarse fluorescentemente ligando una molécula fluorescente al extremo no ligante de la sonda. Pueden encontrarse orientaciones sobre la selección de marcadores fluorescentes apropiados en Smith et al., Meth. EnzymoI. (1987) 155: 260-301; Karger et al., NucI. Acids Res. (1991) 19: 4955-4962 y Haugland (1989) “Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals” (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.). Los marcadores fluorescentes preferidos incluyen fluoresceína y derivados de la misma, tales como los dados a conocer en la patente de EE.UU. nº 4.318.846 y Lee et al., Cytometry (1989) 10: 151-164 y 6-FAM, JOE, TAMRA, ROX, HEX-1, HEX-2, ZOE, TET-1 o NAN-2 y similares.

Adicionalmente, las sondas pueden marcarse con un éster de acridinio (EA). Las tecnologías actuales permiten que el marcador de EA se disponga en cualquier localización dentro de la sonda. Véanse, p.ej., Nelson et al. (1995) "Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence in Nonisotopic Probing, Blotting and Sequencing”, Kricka L. J. (ed) Academic Press, San Diego, Calif.; Nelson et al. (1994) "Application of the Hybridization Protection Assay (HPA) to PCR in The Polymerase Chain Reaction”, Mullis et al. (eds.) Birkhauser, Boston, Mass.; Weeks et al., Clin. Chem. (1983) 29: 1474-1479; Berry et al., Clin. Chem. (1988) 34: 2087-2090. Puede fijarse directamente una molécula de EA a la sonda usando la química de brazo ligador no basado en nucleótidos, que permite la disposición del marcador en cualquier localización dentro de la sonda. Véanse, p.ej., las patentes de EE.UU. nº 5.585.481 y 5.185.439.

Si se usa un soporte sólido en el ensayo (p.ej. para capturar amplicones del ácido nucleico diana usando una sonda), la sonda oligonucleotídica puede fijarse al soporte sólido de una variedad de maneras. Por ejemplo, la sonda puede fijarse al soporte sólido mediante fijación del nucleótido 3’ o 5’ terminal de la sonda al soporte sólido. Más preferiblemente, la sonda se fija al soporte sólido por un ligador que sirve para distanciar la sonda del soporte sólido. El ligador es habitualmente de al menos 15-30 átomos de longitud, más preferiblemente de al menos 15-50 átomos de longitud. La longitud necesaria del ligador dependerá del soporte sólido particular usado. Por ejemplo, un ligador de 6 átomos es generalmente suficiente cuando se usa poliestireno de alta reticulación como soporte sólido.

Son conocidos una amplia variedad de ligadores en la materia que pueden usarse para fijar la sonda oligonucleotídica al soporte sólido. El ligador puede estar formado por cualquier compuesto que no interfiera significativamente con la hibridación de la secuencia diana con la sonda fijada al soporte sólido. El ligador puede estar formado por un oligonucleótido homopolimérico que puede añadirse fácilmente al ligador por síntesis automatizada. Como alternativa, pueden usarse como ligador polímeros tales como polietilenglicol funcionalizado. Dichos polímeros se prefieren a los oligonucleótidos homopolímericos porque no interfieren significativamente con la hibridación de la sonda con el oligonucleótido diana. Se prefiere particularmente polietilenglicol.

Los ligamentos entre el soporte sólido, el ligador y la sonda normalmente no se escinden durante la retirada de los grupos protectores de base en condiciones básicas a alta temperatura. Los ejemplos de ligamientos preferidos incluyen ligamientos carbamato y amida.

Los ejemplos de tipos preferidos de soportes sólidos para inmovilización de la sonda oligonucleotídica incluyen vidrio de poro controlado, placas de vidrio, poliestireno, perlas de poliestireno recubiertas con avidina, celulosa, nailon, gel de acrilamida y dextrano activado.

En ciertas realizaciones, se añade un control interno (CI) o patrón interno para servir como control para mostrar que cualquier resultado negativo no es debido a un fallo del ensayo. El uso del CI permite el control del proceso de separación, el proceso de amplificación y el sistema de detección, y permite la monitorización del rendimiento del ensayo y la cuantificación de la muestra o muestras. El CI puede incluirse en cualquier punto adecuado, por ejemplo, en el tampón de lisis. En una realización, el CI comprende ácido nucleico de fago. Cuando se usa un soporte sólido en el ensayo, el soporte sólido puede incluir adicionalmente sondas específicas del patrón interno (sonda de CI), facilitando así la captura cuando se usa la sonda de CI. La sonda de CI puede acoplarse opcionalmente con un marcador detectable que es diferente del marcador detectable para la secuencia diana. En realizaciones en que el marcador detectable es un fluoróforo, el CI puede cuantificarse espectrofotométricamente y por el límite de los estudios de detección.

DETECCIÓN DE BKV EN UNA MUESTRA

El ensayo de la invención detecta y determina la cantidad de BKV en una muestra. El ensayo puede ser un ensayo basado en la amplificación que usa cebadores degenerados y sondas, en que los cebadores y sondas se diseñan para proporcionar la amplificación de una secuencia de ácido nucleico de región diana del genoma de BKV.

Como se discute anteriormente, el ensayo detecta la presencia de uno o más ácidos nucleicos de regiones diana como se definen en las reivindicaciones. Las secuencias de ácido nucleico de las regiones diana I-V son regiones de ácido nucleico conservadas en diferentes genotipos de BKV. Los cebadores y sondas para uso en estos ensayos derivan preferiblemente de las secuencias de ácido nucleico de las regiones diana I-V como se describen anteriormente. Los cebadores y sondas particularmente preferidos para uso con los presentes ensayos se diseñan a partir de las secuencias nucleotídicas altamente conservadas de las secuencias de ácido nucleico de las regiones diana I-V.

Como se discute anteriormente, los cebadores y/o sondas se diseñan para la detección basada en ácido nucleico, particularmente un procedimiento de amplificación, de un ácido nucleico diana que tiene una secuencia de ácido nucleico diana descrita anteriormente, p.ej., una secuencia de ácido nucleico de la región diana I-V. Es decir, en dicha realización, los cebadores se diseñan para amplificar una secuencia diana que tiene la secuencia de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico descrita anteriormente, p.ej. la secuencia de ácido nucleico de la región diana I-V.

Como alternativa, los cebadores y/o sondas se diseñan para la detección basada en ácido nucleico, particularmente un procedimiento de amplificación, de un ácido nucleico diana que tiene una secuencia de ácido nucleico que es un fragmento de una secuencia de ácido nucleico diana descrito anteriormente, p.ej. una secuencia de ácido nucleico de la región diana I-V. Es decir, los cebadores se diseñan para amplificar una secuencia diana que tiene la secuencia de ácido nucleico de una porción menor que la secuencia de ácido nucleico entera descrita anteriormente, p.ej., la secuencia de ácido nucleico de la región diana I-V.

En una realización, se detecta el ácido nucleico diana de BKV mediante el uso de cebadores y sondas diseñados por las secuencias de la secuencia de la región diana V.

En una realización de particular interés, se detecta la secuencia diana usando cebadores que tienen la secuencia (cebador 5') (SEQ ID NO:15), (cebador 3') (SEQ ID NO:16), y es de particular interés una sonda que tiene la secuencia .

En otra realización de particular interés, se detecta la secuencia diana usando cebadores que tienen la secuencia (cebador 5') (SEQ ID NO:18), (cebador 3') (SEQ ID NO: 19), y es de particular interés una sonda que tiene la secuencia .

Es de particular interés el uso de estos cebadores y sondas en un procedimiento de PCR TI instantánea para la detección de BKV en una muestra, con el uso de una sonda TaqMan doblemente marcada.

PROCEDIMIENTOS DE DETECCIÓN

La invención proporciona un ensayo basado en ADN para detectar BKV en una muestra. La detección puede realizarse usando una amplia variedad de procedimientos, incluyendo secuenciación directa, hibridación con oligómeros específicos de secuencia, electroforesis en gel y espectrometría de masas. Estos procedimientos pueden usar formatos heterogéneos u homogéneos, marcadores isotópicos o no isotópicos, así como ningún marcador en absoluto.

Preferiblemente, los procedimientos implican amplificar ácidos nucleicos de una muestra. Si se obtiene un ácido nucleico de diagnóstico, se indica la presencia de BKV en una muestra. En general, los procedimientos implican amplificar un ácido nucleico de una muestra usando un cebador de detección y al menos otro cebador, como se describe anteriormente, y valorar los ácidos nucleicos amplificados. Los procedimientos son altamente sensibles y pueden detectar del orden de 5 copias de BKV por reacción, que es equivalente a 200 copias de ADN por ml de espécimen, aunque la detección puede estar limitada por el límite de detección de intervalo lineal. Por tanto, la invención proporciona generalmente la detección de BKV en una muestra en que el BKV está presente en al menos 200 copias de ADN por ml de espécimen.

Como es conocido en la materia, puede valorarse un ácido nucleico amplificado mediante una serie de procedimientos incluyendo, por ejemplo, determinar la presencia o ausencia del ácido nucleico, determinar el tamaño del ácido nucleico o determinar la abundancia de un ácido nucleico con relación a otro ácido nucleico amplificado. En la mayoría de realizaciones, se valora un ácido nucleico amplificado usando electroforesis en gel, hibridación de ácido nucleico, secuenciación y/o detección de una señal de un marcador unido al ácido nucleico amplificado. Los procedimientos de amplificación (p.ej., mediante reacción en cadena de la polimerasa) de ácido nucleico, procedimientos de práctica de la extensión de cebadores y procedimientos de valoración de los ácidos nucleicos son generalmente bien conocidos en la materia (véanse, p.ej. Ausubel, et al., “Short Protocols in Molecular Biology”, 3ª ed., Wiley & Sons, 1995 y Sambrook, et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3ª edición, (2001) Cold Spring Harbor, N.Y.) y no tienen que describirse con más detalle.

Por ejemplo, los cebadores y sondas descritos anteriormente pueden usarse en técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar BKV en muestras biológicas. La PCR es una técnica para amplificar una secuencia de ácido nucleico diana deseada contenida en una molécula de ácido nucleico o mezcla de moléculas. En la PCR, se emplea un par de cebadores en exceso para hibridar con las hebras complementarias del ácido nucleico diana. Los cebadores se extienden cada uno por una polimerasa usando el ácido nucleico diana como molde. Los productos de extensión se vuelven secuencias diana ellos mismos después de la disociación de la hebra diana original. Se hibridan entonces nuevos cebadores y se extienden por una polimerasa, y se repite el ciclo para aumentar geométricamente el número de moléculas de secuencia diana. El procedimiento de PCR para amplificar secuencias de ácido nucleico diana en una muestra es bien conocido en la materia y se ha descrito, p.ej. en Innis et al. (eds.) “PCR Protocols” (Academic Press, NY 1990); Taylor (1991) “Polymerase chain reaction: basic principles and automation, in PCR: A Practical Approach”, McPherson et al. (eds.) IRL Press, Oxford; Saiki et al.

(1986) Nature 324:163; así como en las patentes de EE.UU. nº 4.683.195, 4.683.202 y 4.889.818.

En particular, la PCR usa cebadores oligonucleotídicos relativamente cortos que flanquean la secuencia nucleotídica diana para amplificar, orientados de tal modo que sus extremos 3’ se enfrenten entre sí, extendiéndose cada cebador hacia el otro. Se extrae la muestra polinucleotídica y se desnaturaliza, preferiblemente por calor, y se hibrida con el primer y segundo cebadores que están presentes en exceso molar. Se cataliza la polimerización en presencia de los cuatro trifosfatos de desoxirribonucleótido (dNTP: dATP, dGTP, dCTP y dTTP) usando un agente de polimerización de polinucleótido dependiente de cebador y molde, tal como cualquier enzima capaz de producir productos de extensión de cebador, por ejemplo ADN polimerasa I de E. coli, fragmento Klenow de ADN polimerasa I, ADN polimerasa T4, ADN polimerasas termoestables aisladas de Thermus aquaticus (Taq) disponibles en una variedad de fuentes (por ejemplo, Perkin Elmer), Thermus thermophilus (United States Biochemicals), Bacillus

stereothermophilus (Bio-Rad) o Thermococcus litoralis (polimerasa "Vent", New England Biolabs). Esto da como resultado dos “productos largos” que contienen los cebadores respectivos en sus extremos 5’ ligados covalentemente con los complementos recién sintetizados de las hebras originales.

Se devuelve entonces la mezcla de reacción a las condiciones de polimerización, p.ej. reduciendo la temperatura, inactivando un agente desnaturalizante o añadiendo más polimerasa, y se inicia el segundo ciclo. El segundo ciclo proporciona las dos hebras originales, los dos productos largos del primer ciclo, dos nuevos productos largos replicados a partir de las hebras originales y dos “productos cortos” replicados a partir de los productos largos. Los productos cortos tienen la secuencia de la secuencia diana con un cebador en cada extremo. En cada ciclo adicional, se producen dos productos largos adicionales, y un número de productos cortos igual al número de productos largos y cortos que permanecen al final del ciclo anterior. Por tanto, el número de productos cortos que contienen la secuencia diana crece exponencialmente con cada ciclo. Preferiblemente, la PCR se lleva a cabo con un ciclador térmico comercialmente disponible, p.ej., Perkin Elmer.

El ensayo de nucleasa 5’ fluorogénico, conocido como ensayo TAQMAN™ (Perkin-Elmer), es un sistema de detección basado en PCR para dianas de ácido nucleico potente y versátil. Para una descripción detallada del ensayo TAQMAN™, los reactivos y condiciones para uso del mismo véanse, p.ej., Holland et al., Proc. Nati. Acad. Sci, U.S.A. (1991) 88: 7276-7280; las patentes de EE.UU. nº 5.538.848, 5.723.591 y 5.876.930. Por ello, los cebadores y sondas derivados de regiones del genoma de BKV descritas en la presente memoria pueden usase en análisis TAQMAN™ para detectar la presencia de infección en una muestra biológica. Se efectúa el análisis junto con ciclación térmica monitorizando la generación de señales fluorescentes. El sistema de ensayo exime de la necesidad de análisis electroforético en gel, y tiene la capacidad de generar datos cuantitativos que permiten la determinación de los números de copias de la diana.

El ensayo de nucleasa 5’ fluorogénico se efectúa convenientemente usando, por ejemplo, ADN polimerasa AMPLITAQ GOLD™, que tiene actividad nucleasa 5’ endógena, para digerir una sonda oligonucleotídica interna marcada tanto con un tinte indicador fluorescente como un apagador (véanse Holland et al., Proc. NatI. Acad.Sci. USA (1991) 88: 7276-7280 y Lee et al., NucI. Acids Res. (1993) 21: 3761-3766). Los resultados del ensayo se detectan midiendo los cambios en la fluorescencia que tienen lugar durante el ciclo de amplificación a medida que se digiere la sonda fluorescente, desacoplando los marcadores de tinción y apagador y causando un aumento de la señal fluorescente que es proporcional a la amplificación del ácido nucleico diana.

Los productos de amplificación pueden detectarse en solución o usando soportes sólidos. En este procedimiento, se diseña la sonda TAQMAN™ para hibridar con una secuencia diana en el producto de PCR deseado. El extremo 5’ de la sonda TAQMAN™ contiene un tinte indicador fluorescente. El extremo 3’ de la sonda se bloquea para prevenir la extensión de sonda y contiene un tinte que apagará la fluorescencia del fluoróforo 5’. Durante la posterior amplificación, se escinde el marcador fluorescente 5’ si está presente una polimerasa con actividad exonucleasa 5’ en la reacción. La escisión del fluoróforo 5’ da como resultado un aumento de la fluorescencia que puede detectarse.

En particular, la sonda oligonucleotídica se construye de tal modo que la sonda exista en al menos una conformación monocatenaria cuando no está hibridada en que la molécula apagadora está suficientemente cerca de la molécula indicadora para apagar la fluorescencia de la molécula indicadora. La sonda oligonucleotídica existe también en al menos una conformación cuando está hibridada con un polinucleótido diana tal que la molécula apagadora no esté situada suficientemente cerca de la molécula indicadora para apagar la fluorescencia de la molécula indicadora. Al adoptar estas conformaciones hibridada y no hibridada, la molécula indicadora y la molécula apagadora en la sonda exhiben diferentes intensidades de señal de fluorescencia cuando la sonda está hibridada y no hibridada. Como resultado, es posible determinar si la sonda está hibridada o no hibridada basándose en el cambio en la intensidad de fluorescencia de la molécula indicadora, la molécula apagadora o una combinación de las mismas. Además, debido a que la sonda puede diseñarse de tal modo que la molécula apagadora apague la molécula indicadora cuando la sonda no está hibridada, la sonda puede diseñarse de tal modo que la molécula indicadora exhiba una fluorescencia limitada a menos que la sonda esté hibridada o digerida.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a procedimientos para amplificar una secuencia nucleotídica de BKV diana usando una polimerasa de ácido nucleico que tiene actividad nucleasa 5’ a 3’, uno o más cebadores capaces de hibridar con la secuencia de BKV diana o su producto de extensión y una sonda oligonucleotídica capaz de hibridar con la secuencia diana de BKV en 3’ respecto al cebador. Durante la amplificación, la polimerasa digiere la sonda oligonucleotídica cuando se hibrida con la secuencia diana, separando así la molécula indicadora de la molécula apagadora. A medida que se realiza la amplificación, se monitoriza la fluorescencia de la molécula indicadora, correspondiendo la fluorescencia a la aparición de amplificación de ácido nucleico. La molécula indicadora es preferiblemente un tinte de fluoresceína y la molécula apagadora es preferiblemente un tinte de rodamina.

Otro procedimiento de detección implica el uso de sondas oligonucleotídicas específicas de secuencia diana, que contienen una región de complementariedad de la secuencia diana descrita anteriormente. Las sondas pueden usarse en ensayos de protección de la hibridación (EPH). En esta realización, las sondas se marcan convenientemente con éster de acridinio (EA), una molécula altamente quimioluminiscente. Véanse, p.ej., Nelson et al. (1995) "Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence in Nonisotopic Probing, Blotting and Sequencing”, Kricka L. J. (ed) Academic Press, San Diego, Calif.; Nelson et al. (1994) "Application of the Hybridization Protection Assay (HPA) to PCR in The Polymerase Chain Reaction”, Mullis et al. (eds.) Birkhauser, Boston, Mass.; Weeks et al., Clin. Chem. (1983) 29: 1474-1479; Berry et al., Clin. Chem. (1988) 34: 2087-2090. Se fija directamente una molécula de EA a la sonda usando una química de brazo ligador no basado en nucleótidos que permite la disposición del marcador en cualquier localización dentro de la sonda. Véanse, p.ej., las patentes de EE.UU. nº 5.585.481 y 5.185.439. Se desencadena la quimioluminiscencia mediante reacción con peróxido de hidrógeno alcalino, que procura una N-metilacridona excitada que colapsa a continuación al estado basal con emisión de un fotón. Adicionalmente, el EA causa la hidrólisis de éster que procura el ácido carboxílico de metilacridinio no quimioluminiscente.

Cuando la molécula de EA está fijada covalentemente a una sonda de ácido nucleico, la hidrólisis es rápida en condiciones débilmente alcalinas. Cuando la sonda marcada con EA es exactamente complementaria del ácido nucleico diana, la velocidad de hidrólisis de EA se reduce en gran medida. Por tanto, la sonda marcada con EA hibridada y no hibridada puede detectarse directamente en solución, sin necesidad de separación física.

El EPH consiste generalmente en las siguientes etapas: (a) la sonda marcada con EA hibrida con el ácido nucleico diana en solución durante aproximadamente 15 a aproximadamente 30 minutos. Se añade entonces una solución alcalina débil y se hidroliza el EA acoplado con la sonda no hibridada. Esta reacción lleva aproximadamente 5 a 10 minutos. Se detecta el EA asociado a híbrido restante como medida de la cantidad de diana presente. Esta etapa lleva aproximadamente 2 a 5 s. Preferiblemente, la etapa de hidrólisis diferencial se realiza a la misma temperatura que la etapa de hibridación, típicamente a 50 a 70 ºC. Como alternativa, puede realizarse una segunda etapa de hidrólisis diferencial a temperatura ambiente. Esto permite usar pH elevados, por ejemplo en el intervalo de 10-11, que procuran mayores diferencias en la velocidad de hidrólisis entre la sonda marcada con EA hibridada y no hibridada. El EPH se describe con detalle, p.ej. en las patentes de EE.UU. nº 6.004.745, 5.948.899 y 5.283.174.

Las moléculas oligonucleotídicas pueden usarse también en amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (ABSAN). Este procedimiento es un proceso enzimático dirigido por promotor que induce la amplificación in vitro continua, homogénea e isotérmica de un ácido nucleico específico proporcionando copias de ARN del ácido nucleico. Los reactivos para realizar la ASBAN incluyen un primer cebador de ADN con una cola 5’ que comprende un promotor, un segundo cebador de ADN, transcriptasa inversa, ARNasa H, ARN polimerasa T7, NTP y dNTP. Usando la ABSAN, se generan grandes cantidades de ARN monocatenario a partir de ADN o ADN monocatenario o ADN bicatenario. Cuando se va a amplificar ARN, el ARNmc sirve como molde para la síntesis de una primera hebra de ADN por elongación de un primer cebador que contiene un sitio de reconocimiento de ARN polimerasa. Esta hebra de ADN sirve a su vez como molde para la síntesis de una segunda hebra de ADN complementaria por elongación de un segundo cebador, dando como resultado un sitio promotor de ARN polimerasa activo bicatenario, y la segunda hebra de ADN sirve como molde para la síntesis de grandes cantidades del primer molde, el ARNmc, con la ayuda de una ARN polimerasa. La técnica NASBA es conocida en la materia y se describe, p.ej., en la patente europea 329.822, solicitud de patente internacional nº WO 91102814 y las patentes de EE.UU. nº 6.063.603, 5.554.517 y 5.409.818.

Las secuencias de BKV descritas en la presente memoria son también útiles en las técnicas de hibridación y amplificación de ácido nucleico que utilizan moléculas de ADN ramificadas. En un ensayo de hibridación de ácido nucleico básico, el ácido nucleico analito monocatenario hibrida con una sonda de ácido nucleico monocatenaria marcada y se detectan los dúplex marcados resultantes. Se han desarrollado variaciones de este esquema básico para facilitar la separación de los dúplex para detectar materiales ajenos y/o para amplificar la señal que se detecta. Un procedimiento de amplificación de la señal usa multímeros de amplificación que son polinucleótidos con un primer segmento que hibrida específicamente con el ácido nucleico analito o una hebra del ácido nucleico unido al analito, e iteraciones de un segundo segmento que hibrida específicamente con una sonda marcada. La amplificación es teóricamente proporcional al número de iteraciones del segundo segmento. Los multímeros pueden ser lineales o ramificados. Son útiles en estas técnicas dos tipos generales de multímeros ramificados: bifurcados y filiformes. Los procedimientos para preparar y usar moléculas de ácido nucleico ramificadas son conocidos y se describen, p.ej., en la patente de EE.UU. nº 5.849.481.

Kits

Se proporcionan también kits como se definen en las reivindicaciones. Los reactivos de ensayo anteriormente descritos, incluyendo cebadores, sondas, soporte sólido con sondas unidas, así como otros reactivos de detección, pueden proporcionarse en kits, con instrucciones adecuadas y otros reactivos necesarios para realizar los ensayos como se describen anteriormente. El kit contendrá normalmente en envases separados la combinación de cebadores y sondas (ya unidos a una matriz sólida o separados con los reactivos para unirlos a la matriz), formulaciones de control (positivo y/o negativo), reactivos marcados cuando el formato de ensayo requiera los mismos y reactivos generadores de señal (p.ej. sustrato enzimático) si el marcador no genera una señal directamente. Se incluirán habitualmente en el kit instrucciones (p.ej. escritas, en cinta, VCR, CD-ROM, etc.) para llevar a cabo el ensayo. El kit puede contener también, dependiendo del ensayo particular usado, otros reactivos y materiales envasados (concretamente, tampones de lavado y similares). Pueden realizarse ensayos estándares, tales como los descritos anteriormente, usando estos kits.

Las instrucciones se registran generalmente en un medio de registro adecuado. Por ejemplo, las instrucciones pueden imprimirse sobre un sustrato tal como papel o plástico, etc. Como tales, las instrucciones pueden estar presentes en los kit como un prospecto de envase, en el etiquetado del envase del kit o componentes de mismo (p.ej., asociadas al envoltorio o subenvoltorio), etc. En otras realizaciones, las instrucciones están presentes como un archivo de datos de almacenamiento electrónico presente en un medio almacenamiento en soporte informático adecuado, p.ej. CD-ROM, disquete, etc., incluyendo el mismo medio en que se presenta el programa.

En aún otras realizaciones, las instrucciones no están presentes por sí mismas en el kit, sino que se proporcionan medios para obtener las instrucciones de una fuente remota, p.ej. a través de internet. Es un ejemplo de esta realización un kit que incluye una dirección web donde pueden visualizarse las instrucciones o de donde pueden descargarse las instrucciones.

Todavía más, el kit puede ser aquel en que se obtienen las instrucciones descargando de una fuente remota, como en internet o la red informática mundial. Puede usarse alguna forma de protocolo de seguridad de acceso o identificación para limitar el acceso a aquellos con derecho al uso de la invención en cuestión. Como con las instrucciones, el medio para obtener las instrucciones y/o programa se registra generalmente en un medio de registro adecuado.

Los kits de la invención, como se definen en la reivindicación 15, incluyen al menos dos cebadores (un cebador 5’ y otro 3’), habitualmente al menos dos cebadores y una sonda como se describen anteriormente. Los kits pueden contener también instrucciones para usar el kit para detectar BKV en una muestra usando los procedimientos descritos anteriormente, incluyendo los procedimientos de PCR discutidos anteriormente. Pueden incluirse también en los kits en cuestión tampones, dNTP y controles (p.ej. ácidos nucleicos de control positivo y negativo) para efectuar los procedimientos en cuestión. Los cebadores en los kits en cuestión pueden estar marcados detectablemente o no marcados.

EJEMPLOS

Se proponen los siguientes ejemplos para proporcionar a los especialistas en la materia una divulgación y descripción completas de cómo preparar y usar la presente invención. Se han hecho esfuerzos por asegurar la exactitud con respecto a los números usados (p.ej. cantidades, temperatura, etc.), pero deberían tomarse en consideración algunos errores experimentales y desviaciones. A menos que se indique otra cosa, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular medio ponderado, la temperatura es en grados centígrados y la presión es atmosférica o cercana.

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

Se usaron los siguientes procedimientos y materiales en el ejemplo o ejemplos siguientes.

Tipos de espécimen y manejo. Las muestras para uso en la detección de BKV según la invención pueden ser cualquier muestra biológica tal como suero, plasma, líquido amniótico y espécimen de tejido. Los especímenes de tejido deberían almacenarse congelados a -20 ± 10 ºC en solución salina o solución salina tamponada con fosfato (PBS). El suero, plasma y líquido amniótico deberían almacenarse congelados a -20 ± 10 ºC. Todos los tipos de espécimen anteriores, según sea necesario, pueden enviarse en hielo seco por expreso nocturno.

Sondas y cebadores. Se diseñaron los cebadores y sondas oligonucleotídicos y se analizó su idoneidad por PCR e hibridación por análisis informático usando programas estándares (Primer Express, Applied Biosystems). Se sintetizaron los cebadores oligonucleotídicos y sondas fluorogénicas por vendedores cualificados. Se desalaron y liofilizaron los cebadores oligonucleotídicos. Los conjuntos de pares cebadores oligonucleotídicos para la detección de BKV eran los siguientes:

SEC ID NO.:

Secuencia 5’ a 3’

Región diana I (BK1)

Región diana II (BK2)

Región diana III (BK3)

Región diana IV (BK4)

SEC ID NO.:

Secuencia 5’ a 3’

Región diana V (BK5)

"F" hace referencia al cebador de codificación, “R” al cebador inverso y “P” hace referencia a la sonda. Las sondas se congelan a una concentración 100 µM. La concentración de trabajo de las sondas es de 5 µM, se diluyeron 1:10 con Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 y se distribuyeron en alícuotas de 100 µl. Las sondas pueden almacenarse a -20 ºC o menos y protegerse de la luz.

Enzimas. Se usan las siguientes enzimas: mezcla maestra universal de PCR 2X TaqMan® de Applied Biosystems nº de cat. 4304437 o 4318157, que incluye la ADN polimerasa AmpliTaq Gold de Applied Biosystems.

Reactivos y tampones. Se usaron los siguientes en los ensayos: QIAamp DNA Blood Mini Kit (nº cat. QIAGEN 51106).

Equipo. El equipo usado incluía el sistema de detección de secuencia ABI PRISM® 7500.

Amplificación. Se consiguió la amplificación de ADN mediante el procedimiento de PCR ampliamente usado descrito anteriormente (véase, por ejemplo, Persing et al., 1993, “Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Amplifications”, American Society for Microbiology, Washington D.C.). Se detectó la secuencia de ADN amplificada mediante hibridación y escisión de la sonda oligonucleotídica doblemente marcada por el procedimiento de Taqman. Brevemente, los protocolos de amplificación y detección fueron los siguientes: se amplificó el ADN extraído de especímenes clínicos en 25 µl de mezcla de reacción de PCR (mezcla maestra de PCR, Applied Biosystems) que contenía 500 nM de cada cebador, 100 nM de sonda doblemente marcada (sonda Taqman) y 200 µM de cada uno de los cuatro dNTP. Se usó la polimerasa AmpliTaq Gold en la mezcla, que es una enzima termoactivable (inicio en caliente) para potenciar la especificidad y sensibilidad de la amplificación. Se sometió la reacción de PCR a ciclación térmica (10 min a 95 ºC, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 ºC, 30 segundos a 60 ºC) usando el sistema de PCR instantánea ABI7500. Se monitorizaron la amplificación y detección instantáneamente, y se analizaron después de la terminación de la ciclación de PCR usando el software de detección de secuencia de ABI (v1.2.2).

Especificidad. Se ensayó la especificidad de cebadores y sondas oligonucleotídicos derivados del ADN secuenciado y las secuencias disponibles en GenBank en un panel de muestras clínicas positivas y negativas de BKV. Se ensayaron también los cebadores y sondas con muestras positivas y negativas de JCV, así como una serie de controles. Se compararon los resultados con el resultado por el ensayo de PCR usado actualmente en laboratorios clínicos. Se secuenciaron algunos de los ácidos nucleicos amplificados para validar la especificidad del ensayo. La secuenciación de los ácidos nucleicos amplificados confirmó que todos los fragmentos de PCR eran realmente secuencias de BKV. Ninguno de estos fragmentos de secuencia se correlacionaba con secuencias de JCV o secuencias de cualquier otra especie.

Sensibilidad. Se analizó la sensibilidad de los ensayos mediante titulación de una serie de concentración conocida de ADN de BKV y convirtiendo las concentraciones en curvas patrón. Puesto que hay varios conjuntos de cebador/sonda orientados a diferentes regiones, la sensibilidad variable ligeramente. Globalmente, la sensibilidad analítica alcanzaba 5 copias o menos por tubo de reacción. Basándose en el procedimiento de preparación de muestra y el protocolo de ajuste de volumen, esta sensibilidad analítica era equivalente a aproximadamente 200 copias por ml para el espécimen clínico (p.ej., suero, orina u otra forma de espécimen líquido).

EJEMPLO 1

SECUENCIACIÓN COMPLETA DEL GENOMA ENTERO DE BKV

Para comprender la diversidad genómica de BKV e identificar secuencias candidatas para sus aplicaciones de diagnóstico, se efectuó una secuenciación del genoma vírico entero. Se recogieron muestras de orina de 13 pacientes positivos de BKV. Para evitar una estrecha relación clínica, estos pacientes se eligieron de recursos geográficamente diversificados y se seleccionaron aleatoriamente por otro lado. Se extrajeron muestras para ADN vírico mediante el procedimiento habitual. Se amplificó entonces el ADN extraído para su genoma entero de 5,1 kb mediante el protocolo largo de PCR (Stratagene). Se secuenció el ADN vírico amplificado mediante un procedimiento de terminación didesoxilo de cuatro colores con un conjunto de cebadores de secuenciación prediseñados, y se separó en un sistema secuenciador ABI377. Se ensamblaron las piezas de secuencia en cóntigos de 5,1-5,2 kb completos por el software Lasergene 6 para cada genoma de BKV para análisis.

Se alinearon entre sí 13 cóntigos de BKV ensamblados y se alinearon también frente a todas las secuencias de BKV publicadas. Se adquirió la información de secuencia publicada de bases de datos públicas (GenBank, EMBL y Swiss-Port). Se compararon las 32 secuencias de genoma de BKV completas, incluyendo las 13 secuencias de BKV recientes y las 19 secuencias de BKV publicadas (nº de acceso a GenBank: AY628224, AY628225, AY628226, AY628227, AY628228, AY628229, AY628230, AY628231, AY628232, AY628233, AY628234, AY628235, AY628236, AY628237, AY628238, M23122, NC001538, V01108 y V01109).

En primer lugar, se compararon todas las secuencias de las cepas de BKV entre sí. Se compararon entonces las secuencias de BKV con los genomas de otras especies estrechamente relacionadas. De todas las especies que se cribaron, eran de particular interés los poliomavirus JC (JCV), otro miembro de la familia de poliomavirus.

El alineamiento de secuencia completo en el genoma de BKV permitió la selección de varias regiones de secuencia candidatas para detección de diagnóstico. Estas regiones comparten consenso en todos los 32 genomas de BKV, y tienen variaciones mínimas en sus secuencias. Las secuencias fuera de estas regiones no son de consenso o son altamente polimórficas, lo que las hace muy difíciles de usar para detección ubicua en aplicaciones de diagnóstico. Se efectuó adicionalmente un análisis comparativo frente a secuencias de todas las demás especies en bases de datos públicas. Principalmente, el JCV comparte una alta homología con el BKV. A pesar de la homología, la comparación de las regiones seleccionadas de BKV con JCV mostraba algunas diferencias de secuencia. Estas diferencias de secuencia, aunque limitadas, eran críticas para la detección diferencial de BKV de JCV.

De las más de 5100 pares de bases del genoma entero completo, hay un total de 142 variaciones nucleotídicas anteriormente no publicadas que se identificaron. De estas variaciones nucleotídicas, 105 eran sustituciones nucleotídicas (pares de bases únicos o múltiples) y 37 eran deleciones o inserciones (pares de bases múltiples). Las variaciones recién identificadas se distribuían por todo el genoma de BKV. Se creó un mapa detallado de la diversidad genética de BKV combinando las variaciones de secuencia recién identificadas con las variaciones de bases de datos públicas. Como se muestra en la FIG. 1, este mapa ilustra las regiones que son altamente polimórficas y las regiones que están relativamente conservadas. El análisis de este mapa detallado permite la selección de las regiones de secuencia candidatas para aplicaciones de diagnóstico.

EJEMPLO 2

IDENTIFICACION DE LA REGIÓN DIANA I ("BK1")

Como se muestra en la FIG. 1, la comparación de las secuencias entre todas las secuencias de ácido nucleico recién completadas y las secuencias de ácido nucleico publicadas permitía la selección de más de una región de secuencia que está conservada y proporcionará una detección basada en ácido nucleico específica y sensible de la presencia o ausencia de BKV en una muestra biológica. Se seleccionó la región BK1 que comprende los nucleótidos 435 a 585 del nº de acceso a GenBank AY628224 para el diseño de cebador de PCR. La secuencia de ácido nucleico de la secuencia diana de BK1 es: La estrategia usada para diseñar los cebadores de amplificación basada en ácido nucleico estaba basada en el análisis de múltiples alineamientos de secuencia de todas las secuencias genómicas de BKV y secuencias de virus estrechamente relacionados. Este análisis se diseñó para incluir todas las variantes de BKV. Este análisis se diseñó también para excluir cualquier secuencia estrechamente relacionada, pero no de BKV, tal como secuencias de JCV. Un análisis cuidadoso de estos alineamientos permitía la selección de secuencias oligonucleotídicas que cubren secuencias de todas las variantes de BKV, pero que discriminan secuencias de cualquier otro género estrechamente relacionado, permitiendo así la amplificación específica de género y la detección e identificación ubicua de BKV. Las secuencias de cebadores y sonda para la región diana BK1 son las siguientes:

SEQ ID NO:

Secuencia 5’ a 3’

Región diana I (BK1)

Para la confirmación de la detección específica de BKV, se secuenciaron y analizaron los productos de amplificación de PCR de especímenes de BKV. Se alinearon bien las secuencias del producto de amplificación con la secuencia de BKV, y ninguna de las secuencias del producto de amplificación se identificó como secuencia de JCV o de ningún otro género. Se muestran en la Fig. 2 los resultados del ensayo. Las concentraciones de molde oscilaban de 50 copias por reacción a 50.000 por reacción, y se efectuó el ensayo por duplicado. Ensayo de BK1: pendiente= -3,58, punto de corte= 43,428 y R2= 0,997.

EJEMPLO 3

IDENTIFICACIÓN DE LA REGIÓN DIANA II ("BK2")

La comparación de las secuencias de ácido nucleico entre todas las secuencias de ácido nucleico de BKV recién completadas y las secuencias de ácido nucleico de BKV publicadas permitía la selección de la región diana BK2. La región diana BK2 comprende los nucleótidos 1418 a 1545 de nº de acceso a GenBank AY628224. La secuencia de ácido nucleico de la secuencia diana BK2 es: La estrategia usada para diseñar los cebadores y sondas de amplificación basada en ácido nucleico estaba basada en el análisis de múltiples alineamientos de secuencia de todas las secuencias de BKV y secuencias de virus estrechamente relacionados. Este análisis se diseñó para incluir todas las variantes de BKV. Este análisis se diseñó también para excluir cualquier secuencia estrechamente relacionada, pero no de BK, tal como una secuencia de JCV. Un análisis cuidadoso de estos alineamientos permitía la selección de secuencias oligonucleotídicas con secuencias que cubren todas las variantes de BKV pero que discriminan las secuencias de cualquier otro género estrechamente relacionado, permitiendo así la amplificación específica de género y la detección e identificación ubicua de BKV. Las secuencias de los cebadores y sonda para la región diana BK2 son como siguen:

SEQ ID NO:

Secuencia 5’ a 3’

Región diana II (BK2)

Para la confirmación de la detección específica de BKV, se secuenciaron y analizaron los productos de amplificación de PCR de especímenes de BKV. Se alinearon bien las secuencias del producto de amplificación con la secuencia de BKV, y ninguna de las secuencias del producto de amplificación se identificó como secuencia de JCV o de ningún otro género. Se muestran en la Fig. 2 los resultados del ensayo. Las concentraciones de molde oscilaban de 50 copias por reacción a 50.000 por reacción, y se efectuó el ensayo por duplicado. Para el ensayo de BK2: pendiente= -3,48, punto de corte= 44,053 y R2= 0,999.

EJEMPLO 4

IDENTIFICACIÓN DE LA REGION DIANA III (“BK3”)

La comparación de las secuencias de ácido nucleico entre todas las secuencias de ácido nucleico de BKV recién completadas y las secuencias de ácido nucleico de BKV publicadas permitía la selección de la región diana BK3. La región diana BK3 comprende los nucleótidos 4097 a 4560 de nº de acceso a GenBank AY628224. La secuencia de ácido nucleico de la secuencia diana BK3 es: La estrategia usada para diseñar los cebadores y sondas de amplificación basada en ácido nucleico estaba basada en el análisis de múltiples alineamientos de secuencia de todas las secuencias de BKV y secuencias de virus estrechamente relacionados. Este análisis se diseñó para incluir todas las variantes de BKV. Este análisis se diseñó también para excluir cualquier secuencia estrechamente relacionada, pero no de BK, tal como una secuencia de JCV. Un análisis cuidadoso de estos alineamientos permitía la selección de secuencias oligonucleotídicas con secuencias que cubren todas las variantes de BKV pero que discriminan las secuencias de cualquier otro género estrechamente relacionado, permitiendo así la amplificación específica de género y la detección e identificación ubicua de BKV. Las secuencias de los cebadores y sonda para la región diana BK3 son como siguen:

SEQ ID NO:

Secuencia 5’ a 3’

Región diana III (BK3)

Para la confirmación de la detección específica de BKV, se secuenciaron y analizaron los productos de amplificación de PCR de especímenes de BKV. Se alinearon bien las secuencias del producto de amplificación con la secuencia de BKV, y ninguna de las secuencias del producto de amplificación se identificó como secuencia de JCV o de ningún otro género. Se muestran en la Fig. 2 los resultados del ensayo. Las concentraciones de molde oscilaban de 50 copias por reacción a 50.000 por reacción, y se efectuó el ensayo por duplicado. Para el ensayo de BK3: pendiente= -3,49, punto de corte= 44,819 y R2= 0,999.

EJEMPLO 5

IDENTIFICACIÓN DE LA REGIÓN DIANA IV ("BK4")

La comparación de las secuencias de ácido nucleico entre todas las secuencias de ácido nucleico de BKV recién completadas y las secuencias de ácido nucleico de BKV publicadas permitía la selección de la región diana BK4. La región diana BK4 comprende los nucleótidos 612 a 864 de nº de acceso a GenBank AY628224. La secuencia de ácido nucleico de la secuencia diana BK4 es: La estrategia usada para diseñar los cebadores y sondas de amplificación basada en ácido nucleico estaba basada en el análisis de múltiples alineamientos de secuencia de todas las secuencias de BKV y secuencias de virus estrechamente relacionados. Este análisis se diseñó para incluir todas las variantes de BKV. Este análisis se diseñó también para excluir cualquier secuencia estrechamente relacionada, pero no de BK, tal como una secuencia de JCV. Un análisis cuidadoso de estos alineamientos permitía la selección de secuencias oligonucleotídicas con secuencias que cubren todas las variantes de BKV pero que discriminan las secuencias de cualquier otro género estrechamente relacionado, permitiendo así la amplificación específica de género y la detección e identificación ubicua de BKV. Las secuencias de los cebadores y sonda para la región diana BK4 son como siguen:

SEQ ID NO:

Secuencia 5’ a 3’

Región diana IV (BK4)

Para la confirmación de la detección específica de BKV, se secuenciaron y analizaron los productos de amplificación de PCR de especímenes de BKV. Se alinearon bien las secuencias del producto de amplificación con la secuencia de BKV, y ninguna de las secuencias del producto de amplificación se identificó como secuencia de JCV o de ningún otro género. Se muestran en la Fig. 2 los resultados del ensayo. Las concentraciones de molde oscilaban de 50 copias por reacción a 50.000 por reacción, y se efectuó el ensayo por duplicado. Para el ensayo de BK4: pendiente= -3,21, punto de corte= 41,466 y R2= 0,999.

Se ensayó la sensibilidad analítica del cebador y sonda oligonucleotídicos mediante titulación de una serie de concentración conocida de ADN y se calculó usando el análisis de curva patrón. Se demostró que la sensibilidad analítica del ensayo alcanzaba 5 copias o menos por tubo de reacción. Ajustada al procedimiento de preparación de muestra y protocolo de ajuste de volumen, esta sensibilidad analítica es equivalente a aproximadamente 200 copias por ml de especímenes clínicos líquidos.

Se ensayó el conjunto de cebador/sonda en un panel de 333 muestras clínicas anteriormente probadas. El panel incluía 47 muestras conocidas positivas de BKV (detectado) y 286 conocidas negativas de BKV (no detectado). El conjunto de cebador/sonda oligonucleotídicos detectaba las 47 muestras positivas. Además, de las 284 muestras negativas, detectaba 34 como positivas de BKV. Para validar este resultado positivo “errado”, se secuenciaron 28.

Los 28 productos de amplificación secuenciados se identificaron como BKV. Las 6 muestras restantes no pudieron secuenciarse debido a un volumen de muestra insuficiente. Globalmente, se detectaron al menos un 10 % de muestras clínicamente negativas como positivas de BKV mediante la nueva estrategia de cebador/sonda y se validaron por secuenciación como verdaderos positivos. La incapacidad de detectar dicho porcentaje de verdaderos positivos podría estar causada por el desapareamiento de cebador/sonda en los sitios de variación o la baja eficacia de la PCR o ambos.

EJEMPLO 6

IDENTIFICACIÓN DE LA REGIÓN DIANA V ("BK5")

La comparación de las secuencias de ácido nucleico entre todas las secuencias de ácido nucleico de BKV recién completadas y las secuencias de ácido nucleico de BKV publicadas permitía la selección de la región diana BK4. La región diana BK4 comprende los nucleótidos 2810 a 2895 de nº de acceso a GenBank AY628224. La secuencia de ácido nucleico de la secuencia diana BK5 es: La estrategia usada para diseñar los cebadores y sondas de amplificación basada en ácido nucleico estaba basada en el análisis de múltiples alineamientos de secuencia de todas las secuencias de BKV y secuencias de virus estrechamente relacionados. Este análisis se diseñó para incluir todas las variantes de BKV. Este análisis se diseñó también para excluir cualquier secuencia estrechamente relacionada, pero no de BK, tal como una secuencia de JCV. Un análisis cuidadoso de estos alineamientos permitía la selección de secuencias oligonucleotídicas con secuencias que cubren todas las variantes de BKV pero que discriminan las secuencias de cualquier otro género estrechamente relacionado, permitiendo así la amplificación específica de género y la detección e identificación ubicua de BKV. Las secuencias de los cebadores y sonda para la región diana BK5 son como siguen:

SEQ ID NO:

Secuencia 5’ a 3’

Región diana V (BK5)

Para la confirmación de la detección específica de BKV, se secuenciaron y analizaron los productos de amplificación de PCR de especímenes de BKV. Se alinearon bien las secuencias del producto de amplificación con la secuencia de BKV, y ninguna de las secuencias del producto de amplificación se identificó como secuencia de JCV o de ningún otro género. Se muestran en la Fig. 2 los resultados del ensayo. Las concentraciones de molde oscilaban de 50 copias por reacción a 50.000 por reacción, y se efectuó el ensayo por duplicado. Para el ensayo de BK5: pendiente= -3,61, punto de corte= 47,324 y R2= 0,994.

Resulta evidente por los resultados y la discusión anteriores que la invención en cuestión proporciona un importante nuevo medio para la detección de virus BK, así como la diferenciación entre diferentes genotipos o cepas del virus BK. Como tales, los procedimientos y sistemas en cuestión encuentran uso en una variedad de aplicaciones diferentes, incluyendo aplicaciones de investigación, médica, terapéutica, de diagnóstico, militar y otras. Por consiguiente, la presente invención representa una contribución significativa a la materia.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> CHEN, FAN KONG, LILLY, I. CHEN, JULES JANNATIPOUR, MEHRDAD <120> Procedimientos y composiciones para detectar el virus BKV <130> FOCS-013WO <150> 11/246.904 <151> 06-10-2005 <150> 60/705.217 <151> 02-08-2005 <160> 54 <170> FastSEQ para Windows versión 4.0 <210> 1 <211> 151 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 1 <210> 2 <211> 128 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 2 <210> 3 <211> 464 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 3 <210> 4 <211> 253 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 4 <210> 5 <211> 86 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 5 <210> 6 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 6 <210> 7 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 7 <210> 8 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 8 <210> 9 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 9 <210> 10 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 10 <210> 11 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 11 <210> 12 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 12 <210> 13 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 13 <210> 14 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 14 <210> 15 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 15 <210> 16 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 16 <210> 17<211> 27<212> ADN<213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 17 <210> 18 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 18 <210> 19 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 19 <210> 20 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 20 <210> 21 <211> 4012 <212> ADN <213> Secuencia de consenso de poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 21 <210> 22 <211> 5141 <212> ADN <213> Secuencia mayoritaria de poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 22 <210> 23 <211> 5141 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 23 <210> 24 <211> 5141 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 24 <210> 25 <211> 5141 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 25 <210> 26 <211> 5141 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 26 <210> 27 <211> 5141 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 27 <210> 28 <211> 5141 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 28 <210> 29 <211> 5141 <212> ADN <213> Secuencia de consenso de poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 29 <210> 30 <211> 5141 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 30 <210> 31 <211> 5141 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 31 <210> 32 <211> 5141 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 32 <210> 33 <211> 5092 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 33 <210> 34 <211> 5141 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 34 <210> 35 <211> 5141 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 35 <210> 36 <211> 5129 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 36 <210> 37 <211> 5132 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 37 <210> 38 <211> 5098 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 38 <210> 39 <211> 5153 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 39 <210> 40 <211> 5153 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 40 <210> 41 <211> 4963 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK

ES 2 552 725 T3   <400> 41

ES 2 552 725 T3   <210> 42 <211> 5147 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 42

ES 2 552 725 T3   <210> 43 <211> 5147 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 43

ES 2 552 725 T3  

ES 2 552 725 T3   <210> 44 <211> 5196 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 44

ES 2 552 725 T3   <210> 45 <211> 5154

ES 2 552 725 T3   <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 45

ES 2 552 725 T3   <210> 46 <211> 5149 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 46

ES 2 552 725 T3   <210> 47<211> 5146

ES 2 552 725 T3   <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 47

ES 2 552 725 T3   <210> 48 <211> 5153 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 48

ES 2 552 725 T3  

ES 2 552 725 T3   <210> 49 <211> 5147 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 49

ES 2 552 725 T3   <210> 50 <211> 5147 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 50

ES 2 552 725 T3  

ES 2 552 725 T3   <210> 51 <211> 5148 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 51

ES 2 552 725 T3   <210> 52 <211> 5147 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 52

ES 2 552 725 T3  

ES 2 552 725 T3   <210> 53 <211> 5148 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 53

ES 2 552 725 T3   <210> 54 <211> 5111 <212> ADN <213> Poliomavirus humano de tipo virus BK <400> 54

ES 2 552 725 T3  

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REIVINDICACIONES

1.

Un procedimiento de valoración de la presencia de ácido nucleico del virus BK (BKV) en una muestra, incluyendo el procedimiento determinar la cantidad de ácido nucleico de BKV y determinar si está presente o ausente, incluyendo adicionalmente el procedimiento discriminar entre ácido nucleico de virus BKV y JC, comprendiendo el procedimiento: poner en contacto dicha muestra con un par cebador diseñado para hibridar en condiciones de hibridación rigurosas con la secuencia diana de SEQ ID NO: 1, 2, 4 o 5, o complementos de la misma, en el que el par cebador incluye un primer cebador que tiene una secuencia que es la misma que o similar a la de una primera porción de la secuencia diana y un segundo cebador que tiene una secuencia que es complementaria de una segunda porción de la secuencia diana, en el que al menos un cebador del par cebador diseñado para hibridar con la secuencia diana de SEQ ID NO: 2, o un complemento de la misma, en condiciones de hibridación rigurosas se diseña para hibridar con la secuencia diana de SEQ ID NO: 9 o 10, o complementos de la misma, y determinar la cantidad de ácido nucleico del virus BK (BKV) en la muestra midiendo la amplificación de dicha secuencia diana de SEQ ID NO: 1, 2, 4 o 5, o complementos de la misma, en el que dicha amplificación detecta la presencia o ausencia de ácido nucleico de BKV.

2.

El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha determinación comprende amplificación basada en ácido nucleico.

3.

El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el producto de amplificación es de aproximadamente de 30 nucleótidos de longitud o menos.

4.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que los cebadores tienen una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleótidos.

5.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que los cebadores están separados por aproximadamente 30 nucleótidos contiguos.

6.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho procedimiento comprende poner en contacto dicha muestra con al menos dos pares cebadores diseñados para hibridar en condiciones de hibridación rigurosas con al menos dos de las secuencias diana de SEQ ID NO: 1, 4, 5, 9 o 10, o complementos de las mismas.

7.

El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que al menos un par cebador se diseña para hibridar con la secuencia diana de SEQ ID NO: 1, o un complemento de la misma, en condiciones de hibridación rigurosas y en el que al menos un cebador del par cebador comprende los nucleótidos 1-26, 57-90 o 94- 119 de la SEQ ID NO: 1, o complementos de la misma.

8.

El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que al menos un par cebador se diseña para hibridar con la secuencia diana de SEQ ID NO: 4, o un complemento de la misma, en condiciones de hibridación rigurosas y en el que al menos un cebador del par cebador comprende los nucleótidos 1-19, 32-62 o 76- 95 de la SEQ ID NO: 4, o complementos de la misma.

9.

El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que al menos un par cebador se diseña para hibridar con la secuencia diana de SEQ ID NO: 5 o un complemento de la misma, en condiciones de hibridación rigurosas y en el que al menos un cebador del par cebador comprende los nucleótidos 2-18, 19-41 o 47- 64 de la SEQ ID NO: 5, o complementos de la misma.

10.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que al menos un cebador es un oligonucleótido degenerado.

11.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que al menos un cebador comprende un marcador detectable.

12.

El procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicho marcador detectable es un fluorescente.

13.

Un par cebador de primer y segundo cebadores diseñados para hibridar en condiciones de hibridación rigurosas con la secuencia diana de SEQ ID NO: 1, 2, 4 o 5, o complementos de la misma, en el que el par cebador incluye un primer cebador que tiene una secuencia que es la misma que o similar a la de una primera porción de la secuencia diana, y un segundo cebador que tiene una secuencia que es complementaria de una segunda porción de la secuencia diana, y

ES 2 552 725 T3   en el que al menos un cebador del par cebador diseñado para hibridar con la secuencia diana de SEQ ID NO: 2, o un complemento de la misma, en condiciones de hibridación rigurosas se diseña para hibridar con la secuencia diana de SEQ ID NO: 9 o 10, o complementos de la misma, y en el que al menos un cebador del par cebador diseñado para hibridar con la secuencia diana de SEQ ID NO:4, o un complemento de la misma, en condiciones de hibridación rigurosas comprende los nucleótidos 1-19, 32-62 o 76-95 de la SEQ ID NO: 4, o complementos de la misma.

14.

El par cebador de la reivindicación 13, en el que al menos un cebador del par cebador comprende adicionalmente un marcador detectable.

15.

Un kit que comprende (i) un primer envase que comprende un par cebador de primer y segundo cebadores diseñados para hibridar en condiciones de hibridación rigurosas con la secuencia diana de SEQ ID NO: 1, 2, 4 o 5, en el que el par cebador incluye un primer cebador que tiene una secuencia que es la misma que o similar a la de una primera porción de la secuencia diana y un segundo cebador que tiene una secuencia que es complementaria de una segunda porción de la secuencia diana, en el que al menos un cebador del par cebador diseñado para hibridar con la secuencia diana de SEQ ID NO: 2, o un complemento de la misma, en condiciones de hibridación rigurosas se diseña para hibridar con la secuencia diana de SEQ ID NO: 9 o 10, o complementos de la misma, y en la que al menos un cebador del par cebador diseñado para hibridar con la secuencia diana de SEQ ID NO:4, o un complemento de la misma, en condiciones de hibridación rigurosas comprende los nucleótidos 1-19, 32-62 o 76-95 de la SEQ ID NO: 4, o complementos de la misma, (ii) un segundo envase que comprende una formulación de control.

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