Detección de la tuberculosis e infección por Mycobacterium tuberculosis utilizando HBHA.

Método in vitro para detectar y diferenciar entre un mamífero que presenta una tuberculosis latente y un mamífero que presenta una tuberculosis activa, o para identificar un mamífero que presenta una tuberculosis latente en una población sana, comprendiendo dicho método

a) poner en contacto, de una manera independiente, células mononucleares de sangre periférica

(PBMC) procedentes de dicho mamífero con la forma nativa de la adhesina hemaglutinina de unión a heparina (HBHA) y con la diana 6 antigénica secretora temprana (ESAT-6) en condiciones que permiten la secreción de IFN-g;

b) medir la concentración de IFN-g específico de HBHA y la concentración de IFN-g específico de ESAT-6 mediante ELISA; y

c) calcular la relación de la concentración de IFN-g específico de HBHA respecto a la concentración de IFN-g específico de ESAT-6, en el que dicha relación obtenida en un mamífero que presenta una tuberculosis latente es superior a 1, mientras que la relación obtenida en un mamífero que presenta una tuberculosis activa es inferior a 1.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10190616.

Solicitante: INSTITUT PASTEUR DE LILLE.

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: 1, rue du Professeur Calme 59000 Lille FRANCIA.

Inventor/es: LOCHT, CAMILLE, SERGHERAERT, CHRISTIAN, MASCART,FRANÇOISE, TEMMERMAN,STÉPHANE, HOUGARDY,JEAN-MICHEL, PLACE,SAMMY.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/569 (para microorganismos, p. ej. protozoarios, bacterias, virus)

PDF original: ES-2523471_T3.pdf

 

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Detección de la tuberculosis e infección por Mycobacterium tuberculosis utilizando HBHA.

Fragmento de la descripción:

Detección de la tuberculosis e infección por Mycobacterium tuberculosis utilizando HBHA

La solicitud describe unos métodos para la detección in vitro de infección con Mycobacterium tuberculosis en mamíferos, y a métodos para la distinción in vitro entre mamíferos infectados con Mycobacterium tuberculosis para los cuales está declarada la enfermedad (forma activa) y mamíferos infectados pero asintomáticos para tuberculosis (forma latente) , y a un método para la distinción in vitro entre mamíferos que presentan una forma activa de tuberculosis y mamíferos no infectados por M. tuberculosis o que presentan una forma latente de tuberculosis. La solicitud describe asimismo unos kits para detectar y distinguir entre mamíferos infectados que presentan los síntomas de la tuberculosis y mamíferos infectados que no han desarrollado la enfermedad, y un kit para distinguir entre mamíferos que presentan una forma activa de tuberculosis y mamíferos no infectados por M. tuberculosis o que presentan una forma latente de tuberculosis.

La invención se refiere a un método para detectar y diferenciar entre un mamífero que presenta una tuberculosis latente y un mamífero que presenta una tuberculosis activa, o para identificar un mamífero que presenta una tuberculosis latente en una población sana.

La tuberculosis es una enfermedad bacteriana que afecta principalmente a los pulmones (tuberculosis pulmonar) ;

también pueden estar afectadas otras partes del cuerpo, tales como los ganglios linfáticos, la pleura (espacio pleural) , las articulaciones, los huesos, el aparato genitourinario, las meninges, el peritoneo, el tubo digestivo, el sistema nervioso central, las glándulas suprarrenales, o el pericardio (tuberculosis extrapulmonar) .

La tuberculosis se transmite de forma aérea, mediante exposición a gérmenes presentes en la saliva y

expectoraciones pulmonares (por ejemplo cuando se tose o se estornuda) de un mamífero portador de la enfermedad, o mediante contacto con lesiones. Los síntomas de la tuberculosis son fiebre, sudores nocturnos, fatiga, pérdida de peso, pérdida de apetito, y tos persistente.

En el año 2004, la tuberculosis todavía representaba un problema de salud pública importante ya que es responsable de más de dos millones de muertes por año a nivel mundial, y un tercio de la población mundial está infectada por el agente responsable, Mycobacterium tuberculosis, habitualmente conocido como bacilo de Koch o KB. La tuberculosis es así la segunda causa más importante de muerte por enfermedad infecciosa, justo por detrás de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (1) . Por esta razón, tanto la Organización Mundial de la Salud como la Comunidad Europea han hecho de la investigación en este campo una de sus prioridades. Se han definido tres objetivos principales:

a) prevención mediante el desarrollo de una vacuna que proporcionará una mejor protección que la vacuna actual, BCG (bacilo de Calmette y Guérin) ;

b) mejorar los medios para el diagnóstico rápido de la tuberculosis; y

c) descubrir unos tratamientos más rápidos que facilitan la administración y de este modo que evitan el desarrollo de cepas bacterianas multirresistentes.

La detección inadecuada de nuevos casos de tuberculosis se ha identificado como una razón principal para el incremento a nivel mundial en el número de casos de tuberculosis (2) . El examen microscópico y el cultivo de esputo son reconocidos como dos buenas rutas para diagnosticar tuberculosis pulmonar. Sin embargo, los resultados de los cultivos micobacterianos sólo se pueden interpretar después de 6 a 8 semanas, y los países en desarrollo no siempre tienen acceso a la infraestructura requerida para esta técnica, lo que limita enormemente la utilidad del

cultivo como un ensayo de diagnóstico de la primera intención (3) . La determinación de bacilos acidorresistentes en esputo sigue siendo así el ensayo más útil para el diagnóstico rápido de tuberculosis pulmonar, pero la identificación es desafortunadamente sólo positiva en 50% a 60% de casos de tuberculosis pulmonar, debido parcialmente al hecho de que se necesitan 5.000 a 10.000 bacilos por μl de esputo para que el ensayo sea positivo (3) . El diagnóstico de la tuberculosis pulmonar es incluso más difícil en un niño que, cuando joven, raramente expectora, y

del que se recoge habitualmente una aspiración gástrica. Sin embargo, el examen directo de tales muestras es positivo en menos del 20% de niños con tuberculosis demostrada, lo que es mucho menor que los resultados obtenidos en los adultos (4) . Finalmente, todavía es difícil de realizar un diagnóstico de la tuberculosis extrapulmonar, que es más frecuente en niños que en adultos. A menudo se basa principalmente en el examen anatomopatológico de biopsias. La aparición histológica convencional de tuberculosis es la presencia de granulomas 60 con necrosis caseosa. El granuloma está constituido por histiocitos, células epiteloides y/o células gigantes de tipo Langerhans. Sin embargo, tanto para muestras de ganglios linfáticos como para muestras pulmonares, un cierto número de diferentes diagnósticos se puede interpretar como infecciones (micobacterias no tuberculosas, micosis, etc.) o enfermedades no infecciosas (sarcoidosis, enfermedad de Wegener, etc.) (5) . Para validar el diagnóstico de la tuberculosis, se debe de completar un examen histológico llevando a cabo tinciones especiales, tales como la 65 tinción de Ziehl-Nielsen, que explota las propiedades alcohol-acidorresistentes de Mycobacterium tuberculosis. Sin

embargo, para obtener una tinción de Ziehl-Nielsen positiva, es necesaria una cantidad de 106 organismos por mililitro de tejido (6) .

Finalmente, un diagnóstico todavía se basa a menudo en un conjunto de datos clínicos o radiológicos y en los resultados de un ensayo de piel para hipersensibilidad retrasada a tuberculina (derivado proteico purificado o PPD) . Sin embargo, este último ensayo no puede diferenciar fácilmente individuos infectados con M. tuberculosis de aquellos vacunados con BCG, y las reacciones cruzadas con micobacterias medioambientales hacen escasa su especificidad. Este ensayo, que se basa en la demostración de una respuesta inmunitaria celular, tiene una mala sensibilidad en individuos inmunodeficientes. Finalmente, aunque permite identificar personas infectadas con M. tuberculosis en una población de individuos no vacunados, desafortunadamente no puede diferenciar individuos que presentan una tuberculosis latente (libre de síntomas) de aquellos con una enfermedad activa. De hecho, sólo el 5% a 10% de los individuos infectados con M. tuberculosis desarrollan una enfermedad, mientras que los otros están protegidos frente a la enfermedad incluso si están infectados (7) . Entonces, el uso práctico de ese ensayo es extremadamente limitado.

Más recientemente, se han desarrollado técnicas de biología molecular para demostrar la presencia de M. tuberculosis usando técnicas de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) . Tales técnicas son sensibles (95%) , pero esto es especialmente cierto para muestras de esputo para las cuales el examen directo es positivo. Por el contrario, su especificidad es excelente (98%) , lo que permite que M. tuberculosis se distinga de otras micobacterias. Sin embargo, la técnica es cara, limitando su aplicación.

Parece de este modo que es una cuestión urgente desarrollar nuevos medios para diagnosticar rápidamente la tuberculosis. Uno de los posibles enfoques consiste en explotar las diferencias en respuestas inmunitarias que pueden existir entre sujetos no infectados e individuos infectados, dependiendo de si están o no enfermos. De este modo, en la bibliografía se han dado... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método in vitro para detectar y diferenciar entre un mamífero que presenta una tuberculosis latente y un mamífero que presenta una tuberculosis activa, o para identificar un mamífero que presenta una tuberculosis latente en una 5 población sana, comprendiendo dicho método a) poner en contacto, de una manera independiente, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) procedentes de dicho mamífero con la forma nativa de la adhesina hemaglutinina de unión a heparina (HBHA) y con la diana 6 antigénica secretora temprana (ESAT-6) en condiciones que permiten la secreción de IFN-γ;

b) medir la concentración de IFN-γ específico de HBHA y la concentración de IFN-γ específico de ESAT-6 mediante ELISA; y

c) calcular la relación de la concentración de IFN-γ específico de HBHA respecto a la concentración de IFN-γ específico de ESAT-6, en el que dicha relación obtenida en un mamífero que presenta una tuberculosis latente es superior a 1, mientras que la relación obtenida en un mamífero que presenta una tuberculosis activa es inferior a 1.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la relación de concentraciones obtenida de la muestra de un mamífero que presenta una tuberculosis latente se encuentra en el intervalo 100 a 400.

3. Método según la reivindicación 1, en el que la relación de concentraciones obtenida de la muestra de un mamífero que presenta una tuberculosis activa es inferior a 0, 5. 25

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra biológica se selecciona de entre el grupo que consiste en aspiraciones bronquiales, lavados broncoalveolares (BAL) , lavado gástrico, esputo, muestras de fluidos de efusión tales como fluidos pleurales, abdominales y articulares, fluidos cerebroespinales, fluidos cefalorraquídeos, fluidos sinoviales, fluidos peritoneales, fluidos pericardíacos y otros fluidos corporales, biopsias de ganglios linfáticos, biopsias transbronquiales, biopsias pleurales y hepáticas, punciones medulares y punciones lumbares, muestras de orina o sangre, y aspiraciones de pus.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende la etapa suplementaria anterior a la etapa a) de cultivar la muestra biológica. 35