Detección simultánea de estado mutacional y número de copia génica.

Método para evaluar el estado de RFCE de una muestra de tejido,

que comprende:

procesar dicha muestra de tejido con reactivos para producir señales distinguibles correspondientes a la presencia o ausencia de una mutación L858R de RFCE, de una mutación de RFCE por deleción del exón 19 y de la amplificación del gen RFCE, y

visualizar simultáneamente dichas señales distinguibles.

Detección simultánea de estado mutacional y número de copia génica CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona composiciones y métodos para detectar simultáneamente el estado mutacional y el número de copia génica. En particular, la presente invención proporciona la medición simultánea del número de copia del gen RFCE y la detección de las mutaciones por deleción L858R y del exón 19 del gen RFCE en una muestra de tejido.

ANTECEDENTES

El reconocimiento de que el receptor del factor de crecimiento epidérmico (RFCE) es una diana terapéutica en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) y en otros cánceres ha llevado al desarrollo de inhibidores de molécula pequeña del receptor de tirosina quinasa como tratamientos del cáncer. Algunos ensayos clínicos han establecido que los inhibidores de tirosina quinasa del RFCE producen respuestas objetivas en sólo una minoría de pacientes de CPCNP. Se ha establecido que existe una correlación significativa entre el número de copia del gen RFCE y la presencia de determinadas mutaciones del gen RFCE, respecto a la sensibilidad de diversas líneas de CPCNP frente a inhibidores de tirosina quinasa de RFCE (Helfrich et al., Clin. Cáncer Res. 12(23):7117, 26). Se ha demostrado que la amplificación de copias del gen RFCE se distribuye en focos en los especímenes de cáncer de pulmón, mayoritariamente en regiones con histología sólida y que los pacientes con amplificación de RFCE presentan resultados significativamente peores (Sholl et al., Cáncer Res. 69(21), 29). Los adenocarcinomas pulmonares con amplificación del gen RFCE y las deleciones y mutaciones de RFCE específicas muestran características clínicopatológicas claras asociadas a un pronóstico significativamente peor.

Se han desarrollado métodos que resultan útiles en la detección de mutaciones de RFCE en tejidos humanos (Yu et al., Clin. Cáncer Res. 15(9):323, 29). En la actualidad el campo no dispone de métodos para la detección simultánea del número de copia del gen RFCE y el estado mutacional de RFCE en múltiples loci. Dichos métodos proporcionarían un avance significativo en el diagnóstico de cánceres asociados al RFCE y en la determinación de regímenes de tratamiento eficaces en los pacientes de cáncer. Se requieren tecnologías adicionales para satisfacer estas deficiencias y otras en el campo.

Carlynn Willmore-Payne et al. (Fluirían Pathology, 26) y Alian R. Li et al. (Journal of Molecular Diagnostics, 28) describen la detección del estado de RFCE en muestras de tejidos de pacientes de cáncer.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona composiciones y métodos para detectar simultáneamente el estado mutacional y el número de copia génico. En particular, la presente invención proporciona la medición simultánea del número de copia del gen RFCE y la detección de las mutaciones L858R y Exón 19 del del gen RFCE en muestras de tejido, por ejemplo de un paciente de cáncer.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para evaluar el estado de RFCE de una muestra de tejido según se define en las reivindicaciones 1 a 15.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un kit según se define en la reivindicación 16. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 muestra la detección concurrente mediante IHQ específica de muíante L585R (rojo), IHQ específica de exón 19 del (azul) e HIS del gen RFCE (negro) de (A) RFCE de tipo salvaje, (B) RFCE exón 19 del, y (C) RFCE L585R.

La figura 2 demuestra la apariencia similar de una señal de hibridación in situ con plata y un pigmento antracótico.

La figura 3 muestra la detección concurrente mediante IHQ específica de muíante L585R (azul), IHQ específica de exón 19 (dorado) e HIS del gen RFCE (rojo) de (A) RFCE de tipo salvaje, (B) RFCE exón 19 del, y (C) RFCE L585R. La figura 4 demuestra una apariencia similar de la detección inmunohistoquímica roja y la detección mediante hibridación in situ roja.

La figura 5 muestra la detección concurrente mediante IHQ específica de muíante L585R (roja), IHQ específica de exón 19 (dorado) e HIS del gen RFCE (azul) de (A) RFCE de tipo salvaje, (B) RFCE exón 19 del, y (C) RFCE L585R. La figura 6 muestra la detección concurrente mediante IHQ específica de muíante L585R (rojo), IHÓ específica de exón 19 (dorado) e HIS del gen RFCE (azul) de (A) RFCE muíante negativo, (B) RFCE exón 19 del, y (C) RFCE L585R.

La figura 7 demuestra una apariencia similar de la detección inmunohistoquímica roja (A) y la detección inmunohistoquímica dorada (B).

La figura 8 muestra la detección concurrente de IHQ específica de muíante L585R e IHQ específica de exón 19 del (azul) e HIS del gen RFCE (rojo) de (A) RFCE de tipo salvaje, (B) RFCE exón 19 del, y (C) RFCE L585R.

La figura 9 muestra una comparación entre la detección de proteínas de IHQ (A) y la detección dual génica/de proteínas (B).

La figura 1 muestra una comparación entre la detección de proteínas de IHQ (A) y la detección dual génica/de proteínas (B).

La figura 11 muestra una comparación entre la detección de proteínas de IHQ (A) y la detección dual génica/de proteínas (B).

La figura 12 muestra una comparación entre la detección de proteínas de IHQ (A) y la detección dual génica/de proteínas (B).

La figura 13 muestra una comparación entre la detección de proteínas de IHQ (A) y la detección dual génica/de proteínas (B).

La figura 14 muestra la detección concurrente de genes/proteínas mediante IHQ específica de muíante L585R y específica de exón 19 del (azul) e HIS del gen RFCE (rojo) de (A) RFCE negativo para mutación, (B) RFCE levemente positiva para mutación, y (C) RFCE positivo para mutación.

La figura 15 muestra heterogeneidad tumoral utilizando la detección concurrente de genes/proteínas mediante IHQ específica para muíante L585R y específica para exón 19 del (azul) e HIS del gen RFCE (rojo).

La figura 16 muestra heterogeneidad tumoral utilizando la detección concurrente de genes/proteínas mediante IHQ específica para muíante L585R y específica para exón 19 del (azul) e HIS del gen RFCE (rojo).

DEFINICIONES

Con el fin de facilitar la comprensión de la presente invención, se definen varios términos y expresiones a continuación.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "número de copia" o "número de copia génica" tal como se utiliza en referencia a secuencias específicas de ácidos nucleicos (por ejemplo RFCE, RFCE de tipo salvaje, RFCE exón 19 del, RFCE L858R y de control) se refiere al número real de dichas secuencias por cada célula Individual. Pude informarse del número de copia por cada célula individual o informarse como el número medio en un grupo de células (por ejemplo una muestra de tejido). Al comparar el "número de copla" de las células (por ejemplo células experimentales y de control), no resulta necesario determinar el número de copia exacto de la célula, sino por el contrario sólo se requiere obtener una aproximación que permita determinar si una célula dada contiene más o menos de la secuencia de ácidos nucleicos en comparación con otra célula. De esta manera, cualquier método capaz de determinar directa o indirectamente de manera fiable las cantidades de ácidos nucleicos puede utilizarse para medir el número de copia aunque no se determine el número de copia real.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "amplificación" utilizado en referencia al número de copia se refiere a la condición en la que el número de copia de una secuencia de ácidos nucleicos (por ejemplo RFCE, RFCE de tipo salvaje, RFCE exón 19 del, RFCE L858R) es superior al número de copla de una secuencia de control (por ejemplo el cromosoma 17). En otras palabras, la amplificación indica que la proporción entre una secuencia particular de ácidos nucleicos (por ejemplo RFCE, RFCE de tipo salvaje, RFCE exón 19 del, RFCE L858R) es superior a 1:1 en comparación con una secuencia de control (por ejemplo 1,1:1, 1,2:1 o 1,3:1). En realizaciones preferentes, la proporción de una secuencia particular de ácidos nucleicos es por lo menos 1,5 veces superior al número de copia de la secuencia de control (es decir, 1,5:1).

Tal como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "molécula de ácidos nucleicos" y "secuencia de ácidos nucleicos" se refieren a cualquier molécula que contiene ácidos nucleicos, incluyendo, aunque sin limitación, ADN o ARN. Las expresiones comprenden secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de base conocidos de ADN y ARN, incluyendo, aunque sin limitación, 4-acetilcitosina,... [Seguir leyendo]

1. Método para evaluar el estado de RFCE de una muestra de tejido, que comprende:

procesar dicha muestra de tejido con reactivos para producir señales distinguibles correspondientes a la presencia o ausencia de una mutación L858R de RFCE, de una mutación de RFCE por deleción del exón 19 y de la amplificación del gen RFCE, y

visualizar simultáneamente dichas señales distinguibles.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha muestra de tejido se obtiene a partir de un sujeto que se sospecha que presenta cáncer, de un sujeto diagnosticado de cáncer o de un sujeto que sufre de cáncer.

3. Método según la reivindicación 1, en el que dicho procesamiento comprende poner en contacto dicha muestra con moléculas de unión a antígeno específicas para moléculas de RFCE que comprenden la mutación L858R y/o la mutación por deleción del exón 19.

4. Método según la reivindicación 3, en el que dicho procesamiento comprende además poner en contacto dicha muestra con sondas de ácidos nucleicos específicas para el gen RFCE.

5. Método según la reivindicación 4, en el que dicho procesamiento comprende además poner en contacto dichas moléculas de unión a antígeno específicas para moléculas de RFCE que comprenden la mutación L858R y/o la mutación por deleción del exón 19 y dicha sonda de ácidos nucleicos específica para el gen RFCE con reactivos que producen una señal detectable correspondiente a la presencia o ausencia de dicha mutación L858R de RFCE y/o por deleción del exón 19 y la presencia o ausencia de amplificación del gen RFCE.

6. Método según la reivindicación 5, en el que dichas moléculas de unión a antígeno específicas para moléculas de RFCE que comprenden la mutación L858R y/o por deleción del exón 19 y dicha sonda de ácidos nucleicos específica para el gen RFCE comprenden una fracción generadora de señales.

7. Método según la reivindicación 5, en el que dichas moléculas de unión a antígeno específicas para moléculas de RFCE que comprenden la mutación L858R y/o la mutación por deleción del exón 19 y dicha sonda de ácidos nucleicos específica para RFCE se detectan con sistemas generadores de señales.

8. Método según la reivindicación 7, en el que dichos sistemas generadores de señales comprenden reactivos para la detección diferencial de dichas moléculas de unión a antígeno específicas para moléculas de RFCE que comprenden la mutación L858R y/o la mutación por deleción del exón 19 y dicha sonda de ácidos nucleicos específica para RFCE.

9. Método según la reivindicación 8, en el que dicho sistema generador de señales comprende reactivos para generar diferentes señales colorimétricas para cada una de dichas moléculas de unión a antígeno específicas para moléculas de RFCE que comprenden la mutación L858R yo la mutación por deleción del exón 19 y dicha sonda de ácidos nucleicos específica para RFCE.

1. Método según la reivindicación 9, en el que dichos reactivos para generar diferentes señales colorimétricas se seleccionan de entre el grupo que consiste de plata, rojo Fast, azul Fast, dorado Fast, DAB, naranja AP y azul AP.

11. Método según al reivindicación 9, en el que dichos reactivos para generar diferentes señales colorimétricas comprenden reactivos marcados enzimáticamente.

12. Método según la reivindicación 11, en el que los mareajes enzimáticos de dichos reactivos marcados enzimáticamente se seleccionan de entre el grupo que consiste de peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, fosfatasa ácida, glucosa oxidasa, (3-galactosidasa, (3-glucuronidasa y (3-lactamasa.

13. Método según la reivindicación 1, que comprende además:

evaluar los cambios en el número de copia del gen RFCE y la presencia o la ausencia de mutaciones de RFCE.

14. Método según la reivindicación 13, que comprende además utilizar dicha evaluación para realizar un diagnóstico o pronóstico para el paciente.

15. Método según la reivindicación 13, que comprende además utilizar dicha evaluación para determinar un tratamiento terapéutico.

16. Kit que comprende:

una primera molécula de unión a antígeno específica para moléculas de RFCE que comprende una mutación L858R,

una segunda molécula de unión a antígeno específica para moléculas de RFCE que comprende una mutación por deleción del exón 19,

una sonda de ácidos nucleicos específica para RFCE,

y reactivos distinguibles generadores de señales específicos para cada una de dicha primera molécula de unión a antígeno, dicha segunda molécula de unión a antígeno y dicha sonda de ácidos nucleicos.