Método para la detección simultánea de microorganismos patógenos.

Método para la detección simultánea de microorganismos patógenos.

La invención se relaciona con un método in vitro para la detección simultánea de Campylobacter jejuni

, Cronobacter sakazakii, una cepa enterohemorrágica de Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella spp. y Shigella spp. en una muestra que comprende: a) Aislar el ADN de dicha muestra; b) Llevar a cabo una PCR multiplex sobre el ADN aislado en la etapa a) con un conjunto de parejas de cebadores diseñados a tal efecto; y c) Detectar los productos de amplificación obtenidos en la etapa b). La invención también se relaciona con un conjunto de parejas de cebadores especialmente diseñado para poner en práctica dicho método in vitro, así como un kit que comprende el mencionado conjunto de parejas de cebadores.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201331415.

Solicitante: UNIVERSIDAD DE OVIEDO.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: LOMBO BRUGOS,FELIPE, VILLAMIZAR RODRÍGUEZ,German, NIÑO GONZÁLEZ,Maria, MUÑIZ SALAS,Juan, GONZÁLEZ ALVAREZ,Maria Isabel, GARCIA GORDO,Cristina.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)

PDF original: ES-2540158_A1.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

La presente invención se refiere a un método para detección simultánea de múltiples microorganismos patógenos, en particular, patógenos de transmisión alimentaria, mediante el empleo de parejas de cebadores y sondas diseñados específicamente para la detección de dichos microorganismos. Asimismo, la invención también se relaciona con el conjunto de parejas de cebadores y sondas diseñados a tal efecto y

con el kit que los contiene. Por lo tanto, la presente invención se engloba dentro del campo de la microbiología, en particular, en el campo de la microbiología alimentaria.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Las patologías asociadas a microorganismos, fundamentalmente bacterias, representan una de las principales causas de enfermedad y mortalidad a nivel mundial. Se puede definir una enfermedad de origen alimentario como: “cualquier enfermedad de naturaleza infecciosa o toxigénica, que es o se piensa que ha sido causada por el agua o los alimentos”.

De esta forma, toda aquella infección producida por microorganismos habitual o extraordinariamente presentes en alimentos, o sus toxinas, y siempre que la vía de entrada al organismo sea la entérica, es considerada como de origen alimentario. Debido a la globalización del comercio, hoy en día es posible consumir productos frescos provenientes de los lugares más distantes al lugar de residencia, con tiempos de transporte muy breves. Esto supone que patógenos que usualmente han causado enfermedades en ciertas regiones, ahora puedan encontrarse en otras en las que nunca antes se habían detectado. Además, este tipo de intercambios comerciales ha elevado la complejidad de las cadenas de comercialización de tal forma que se ha requerido la aplicación de normas y recomendaciones internacionales que garanticen la inocuidad de los alimentos, tales como las propuestas de la Comisión Internacional del Codex Alimentarius o la normativa europea en materia de seguridad alimentaria establecida por la EFSA.

Toda esta normativa de seguridad repercute de forma directa en los recursos de la industria alimentaria, ya que es necesario un control exhaustivo de los procesos productivos, identificando riesgos y minimizándolos de tal manera que se garantice la inocuidad del producto final.

Entre los métodos utilizados tradicionalmente tanto en el ámbito industrial, como en el

académico y el sanitario, se encuentran la detección y recuento de microorganismos mediante técnicas de cultivo, métodos bioquímicos y métodos inmunológicos. Estos métodos se basan en la identificación de características morfológicas, bioquímicas, fisiológicas e inmunológicas, tales como: la forma de la colonia, su color, la reacción a la tinción de Gram, presencia de endosporas, flagelos, catálisis enzimáticas,

fermentación de hidratos de carbono, temperatura de crecimiento, tolerancia al pH y sales, resistencia a antibióticos y tipos de antígenos somáticos, flagelares y capsulares (Yousef, 2008) . Sin embargo, si bien han sido útiles durante muchos años, presentan ciertas limitaciones especialmente en lo que a rapidez se refiere. Estas técnicas son bastante laboriosas, ya que para realizar ensayos de detección o cuantificación es necesaria la preparación de los medios de cultivo específicos y el dispensado de los mismos en gran número de placas, seguido por el procesamiento de las muestras alimentarias, que en muchos casos requiere diversas formas de enriquecimiento, y la siembra en las placas de medio sólido. Si se suma el tiempo de preparación previa y el de incubación es posible que los resultados sean obtenidos hasta en 60 horas.

La reducción del tiempo en el que se producen los resultados es un factor crítico que repercute directamente sobre la economía de las industrias agroalimentarias. Para una empresa de este tipo, el retardo en la salida al mercado de los productos que elabora, se traduce en el aumento de costes por almacenamiento, especialmente si son productos perecederos, y en una reducción de la posibilidad de ganancia, ya que si el alimento no está disponible para el intermediario o el consumidor, no se perciben ingresos por su venta.

Pero la rapidez y la precisión en la detección de un patógeno no solo son relevantes desde el punto de vista económico. La detección temprana de un brote alimentario permite limitar la incidencia del mismo, evitando la propagación y el aumento del número de casos. Además, facilita la selección y aplicación del tratamiento más adecuado para el paciente.

De esta forma el desarrollo de métodos que generen resultados más precisos en tiempos reducidos, supone un logro que provee beneficios tanto para las empresas del sector agroalimentario, como para el ámbito médico-sanitario.

Así, se han desarrollado métodos genéticos de detección de microorganismos que solventan los inconvenientes de los métodos tradicionales de detección. Entre los métodos clásicos se encuentran, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa convencional (PCR) , la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa a tiempo real (qRTi-PCR) , la tecnología VeraCoreTM o los microarrays.

La solicitud de patente US2013/0123119 describe el uso de cebadores para la detección de patógenos transmitidos a través de los alimentos. Dichos cebadores permiten la detección simultánea de múltiples microorganismos mediante su empleo en técnicas moleculares, tales como PCR-multiplex y PCR-multiplex a tiempo real.

La solicitud de patente EP2020449 describe un método para la detección y cuantificación simultánea, múltiple, de Listeria spp., Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni y/o E. coli O157:H7, en una o más muestras, mediante una reacción de amplificación multiplex usando una PCR a tiempo real (qRTi-PCR) .

Wang, R.F. et al. 1997 (J Appl Microbiol, 83 (6) : 727-736) describen la detección de Escherichia coli, E. coli-ETEC, E. coli-O157:H7, Shigella spp., Salmonella spp., Yersinia enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus,

V. vulnificus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus y Bacillus cereus 25 mediante reacción en cadena de la polimerasa.

Fukushima, H. et al. 2003 (Journal of Clinical Microbiology, 41 (11) : 5134-5146) describen la detección de 8 de las 17 especies de patógenos alimentarios examinados mediante el empleo de qRTi- PCR.

La solicitud de patente US2005/0239086 describe un método para la detección de una o más secuencias de ácido nucleico diana en una muestra, útil en la búsqueda de microorganismos patógenos en alimentos.

Sin embargo, ninguno de estos métodos permite la detección simultánea de los principales microorganismos patógenos habitualmente presentes en los alimentos.Por

lo tanto, existe en el estado de la técnica la necesidad de proporcionar un método de detección de microorganismos patógenos alternativos a los existentes en el estado de la técnica que permita la detección múltiple y la cuantificación rápida y eficaz de, principalmente, microorganismos patógenos transmitidos por vía alimentaria y otros de importancia industrial.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores han desarrollado un método para la detección simultánea de microorganismos patógenos alimentarios basado en un conjunto de parejas de cebadores diseñados específicamente para detectar de forma simultánea hasta 11 tipos de microorganismos patógenos mediante una PCR multiplex, entre los que se encuentra Campylobacter jejuni, Cronobacter sakazakii, una cepa enterohemorrágica de Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Shigella spp., Bacillus cereus, Clostridium perfringens, un microorganismo de la familia Enterobacteriaceae, Escherichia coli y Staphylococcus... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método in vitro para la detección simultánea de Campylobacter jejuni, Cronobacter sakazakii, una cepa enterohemorrágica de Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella spp. y Shigella spp. en una muestra que comprende:

a) Aislar el ADN de dicha muestra, b) Llevar a cabo una PCR multiplex sobre el ADN aislado en la etapa a) mediante el empleo de las siguientes parejas de cebadores:

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 3 y el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 4 diseñados para amplificar C. jejuni,

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 7 y el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 8 diseñados para amplificar C. sakazakii,

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 11 y el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12 diseñados para amplificar una cepa hemorrágica de E. coli,

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 15 y el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 16 diseñados para amplificar L. monocytogenes,

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 17 y el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 18 diseñados para amplificar

Salmonella spp.

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 19 y el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 20 diseñados para amplificar Shigella spp. y

c) Detectar los productos de amplificación obtenidos en la etapa b) .

2. Método según la reivindicación 1, en el que la cepa enterohemorrágica de E. coli es E. coli O157:H7, la especie de Salmonella spp. es Salmonella enterica y/o la especie de Shigella spp. es Shigella dysenteriae.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, que adicionalmente comprende la detección simultánea de al menos 1, preferiblemente 2, 3, 4 o 5 de los microorganismos seleccionados de la lista que consiste en Bacillus cereus, Clostridium perfringens, un microorganismo de la familia Enterobacteriaceae, Escherichia coli y Staphylococcus aureus mediante el empleo de las siguientes parejas de cebadores:

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 y el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 2 diseñados para amplificar B. cereus,

-La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 5 y el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 6 diseñados para amplificar C. perfringens,

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que

comprende la secuencia SEQ ID NO: 13 y el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 14 diseñados para amplificar la familia Enterobacteriaceae,

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 9 y el oligonucleótido que

comprende la secuencia SEQ ID NO: 10 diseñados para amplificar E. coli, o

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 21 y el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 22 diseñada para amplificar S.

aureus.

4. Método según la reivindicación 3, que adicionalmente comprende, previamente a la etapa a) , la homogeneización de la muestra y la posterior extracción de dos o más alícuotas de la muestra homogeneizada, en donde, una de las alícuotas es empleada en la etapa a) y la otra es empleada en caso de que se quiera cuantificar los microorganismos detectados en la muestra.

5. Método según la reivindicación 4, en el que si B. cereus, C. perfringens, un microorganismo de la Familia Enterobacteriaceae, E. coli y/o S. aureus son detectados en la etapa c) , entonces, el método comprende adicionalmente las siguientes etapas: d) Aislar el ADN de una de las alícuotas obtenidas previamente a la etapa a) , e) Llevar a cabo una PCR a Tiempo Real del ADN aislado en la etapa d) de dichos microorganismos con las siguientes parejas de cebadores y sondas:

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende

la secuencia SEQ ID NO: 23 y el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 24, y la sonda que comprende la secuencia SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 34 si el microorganismo a detectar es B. cereus,

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende

la secuencia SEQ ID NO: 25 y el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 26, y la sonda que comprende la secuencia SEQ ID NO: 35 si el microorganismo a detectar es C. perfringens,

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 27 y el oligonucleótido que comprende la

secuencia SEQ ID NO: 28, y la sonda que comprende la secuencia SEQ ID NO: 36 si el microorganismo a detectar es de la familia Enterobacteriaceae,

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 29 y el oligonucleótido que comprende la

secuencia SEQ ID NO: 30, y la sonda que comprende la secuencia SEQ ID NO: 37 si el microorganismo a detectar es E. coli, y/o

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 31 y el oligonucleótido que comprende la SEQ ID NO: 32, y la sonda que comprende la secuencia SEQ ID NO:

38 si el microorganismo a detectar es S. aureus, y f) cuantificar los productos amplificados en la etapa e) .

6. Método según la reivindicación 5, en el que la qRTi-PCR comprende al menos una sonda para el control interno de amplificación, seleccionada de la lista que consiste en:

- La sonda de ácido nucleico que comprende el oligonucleótido SEQ ID NO: 39 en el caso de que el microorganismo cuantificado sea E. coli, uno de la Familia Enterobacteriaceae o S. aureus,

- La sonda de ácido nucleico que comprende el oligonucleótido SEQ ID

NO: 41 en caso de que el microorganismo cuantificado sea C. perfringens o E.coli,

- La sonda de ácido nucleico que comprende el oligonucleótido SEQ ID NO: 40 en caso de que el microorganismo cuantificado sea B. cereus,

C. perfringens, E. coli, uno de la Familia Enterobacteriaceae, o S. 10 aureus, y

- Combinaciones de las mismas.

7. Método según la reivindicación 5 ó 6, en el que las sondas están marcadas en uno de sus extremos. 15

8. Método según la reivindicación 7, en el que el marcaje es con un fluoróforo.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que previamente a la

etapa a) , el método comprende el cultivo de la muestra en un medio de 20 enriquecimiento.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en el que la alícuota empleada en la etapa a) es cultivada en un medio de enriquecimiento.

11. Método según la reivindicación 9 ó 10, en el que el tiempo de incubación de la muestra en el medio de cultivo de enriquecimiento es de entre 16 y 48 horas,

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el medio de cultivo de enriquecimiento comprende Agua de Peptona Tamponada, Sangre de caballo desfibrinada y hemolisada, Manitol y Suplemento de crecimiento de Campylobacter.

13. Método según la reivindicación 12, en el que el medio de enriquecimiento comprende -Entre 5-100 mL de sangre de caballo desfibrinada y hemolisada por cada 500 mL de medio,

- Entre 2, 5-80 g de manitol por cada 500 mL de medio, y/o

- Entre 1-8 mL de suplemento de crecimiento de Campypobacter por cada 500 mL de medio.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la muestra es una muestra de alimento.

15. Método según la reivindicación 14, en el que alimento es un producto lácteo, un producto cárnico, pescado, huevo, un ovoderivado, un vegetal, un producto de 10 pastelería, una comida preparada, o una bebida.

16. Un conjunto de parejas de cebadores que comprende:

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la

secuencia SEQ ID NO: 3 y el oligonucleótido que comprende la secuencia 15 SEQ ID NO: 4 diseñados para amplificar C. jejuni,

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 7 y el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 8 diseñados para amplificar C. sakazakii,

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la

secuencia SEQ ID NO: 11 y el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 12 diseñados para amplificar una cepa enterohemorrágica de E. coli,

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la

secuencia SEQ ID NO: 15 y el oligonucleótido que comprende la secuencia 25 SEQ ID NO: 16 diseñados para amplificar L. monocytogenes,

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 17 y el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 18 diseñados para amplificar Salmonella spp.,

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la

secuencia SEQ ID NO: 19 y el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 20 diseñados para amplificar Shigella spp., y

17. Conjunto de parejas de cebadores según la reivindicación 16, en el que la cepa hemorrágica de E. coli es E. coli O157:H7, la especie de Salmonella spp. es 35 Salmonella enterica y/o la especie de Shigella spp. es Shigella dysenteriae.

18. Conjunto de parejas de cebadores según la reivindicación 16 o 17, que además comprende 1, preferiblemente 2, 3, 4 ó 5 de las parejas de cebadores seleccionadas de la lista que consiste en:

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la

secuencia SEQ ID NO: 5 y el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 6 diseñados para amplificar C. perfringens,

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 13 y el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 14 diseñados para amplificar la familia Enterobacteriaceae,

-La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 9 y el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 10 diseñados para amplificar E. coli,

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la

secuencia SEQ ID NO: 21 y el oligonucleótido que comprende la secuencia 15 SEQ ID NO: 22 diseñada para amplificar S. aureus, y

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 y el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 2 diseñados para amplificar B. cereus.

19. Conjunto de parejas de cebadores según la reivindicación 18, que comprende, además, al menos 1, preferiblemente 2, 3, 4 o 5, de las parejas de cebadores y sondas seleccionadas del grupo que consiste en:

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 23 y el oligonucleótido que comprende la

secuencia SEQ ID NO: 24, y la sonda que comprende la secuencia SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 34 si el microorganismo a detectar es B. cereus,

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 25 y el oligonucleótido que comprende la

secuencia SEQ ID NO: 26, y la sonda que comprende la secuencia SEQ ID NO: 35 si el microorganismo a detectar es C. perfringens,

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 27 y el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 28, y la sonda que comprende la secuencia

SEQ ID NO: 36 si el microorganismo a detectar es de la familia Enterobacteriaceae,

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 29 y el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 30, y la sonda que comprende la secuencia SEQ ID NO: 37 si el microorganismo a detectar es E. coli, y

- La pareja de cebadores formada por el oligonucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO: 31 y el oligonucleótido que comprende la SEQ ID NO: 32, y la sonda que comprende la secuencia SEQ ID NO: 38 si el microorganismo a detectar es S. aureus.

20. Conjunto de parejas de cebadores según la reivindicación 19, que comprende además un control interno de amplificación de la qRTi-PCR seleccionado del grupo que consiste en

- La sonda de ácido nucleico que comprende el oligonucleótido SEQ ID NO: 39 en el caso de que el microorganismo cuantificado sea E. coli, uno de la Familia Enterobacteriaceae o S. aureus,

- La sonda de ácido nucleico que comprende el oligonucleótido SEQ ID NO: 41 en caso de que el microorganismo cuantificado sea C. perfringens o E.coli, y

- La sonda de ácido nucleico que comprende el oligonucleótido SEQ ID NO: 40 en caso de que el microorganismo cuantificado sea B. cereus,

C. perfringens, E. coli, uno de la Familia Enterobacteriaceae, o S. aureus.

21. Conjunto de parejas de cebadores según la reivindicación 19 ó 20, en el que las sondas están marcadas en uno de sus extremos.

22. Conjunto de parejas de cebadores según la reivindicación 21, en el que el marcaje es con un fluoróforo.

23. Uso in vitro de un conjunto de parejas de cebadores según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, para la detección simultánea de C. jejuni, C. sakazakii, una cepa enterohemorrágica de E. coli, L. monocytogenes, Salmonella spp. y Shigella spp.

24. Uso según la reivindicación 23, en el que la cepa hemorrágica de E. coli es E. coli O157:H7, la especie de Salmonella spp. es Salmonella enterica y/o la especie de Shigella spp. es Shigella dysenteriae.

25. Uso según la reivindicación 23 o 24, que comprende además la detección simultánea de al menos 1, preferiblemente 2, 3, 4 o 5 de los microorganismos seleccionados de la lista que consiste en B. cereus, C. perfringens, un microorganismo de la familia Enterobacteriaceae, E. coli y S. aureus.

26. Un kit que comprende un conjunto de parejas de cebadores según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22.

27. Uso de un kit según la reivindicación 26, para la detección simultánea de C. jejuni,

C. sakazakii, una cepa enterohemorrágica de E. coli, L. monocytogenes, 15 Salmonella spp. y Shigella spp..

28. Uso según la reivindicación 27, en el que la cepa hemorrágica de E. coli es E. coli O157:H7, la especie de Salmonella spp. es Salmonella enterica y/o la especie de Shigella spp. es Shigella dysenteriae 29. Uso según la reivindicación 28, que comprende además la detección simultánea de al menos 1, preferiblemente 2, 3, 4 o 5 de los microorganismos seleccionados de la lista que consiste en B. cereus, C. perfringens, un microorganismo de la familia Enterobacteriaceae, E. coli y S. aureus.

FIG. 1

FIG. 2

FIG. 3

FIG. 4

FIG. 5

FIG. 6

FIG. 7

FIG. 8

FIG. 9

FIG. 10

FIG. 11

FIG. 12

FIG.13A

FIG. 13B

FIG. 14A

FIG. 14B

FIG. 14C

FIG. 14D

FIG. 14E

FIG. 14F

FIG. 14G

FIG. 14H

FIG. 14I

FIG. 14J

FIG. 14K

FIG. 15A

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FIG. 16A

FIG. 16B

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FIG. 17A

FIG. 17B

FIG. 17C

FIG. 18A

FIG. 18B

FIG. 18C

FIG. 19A

FIG. 19B

FIG. 20

FIG. 21A

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FIG. 21D

FIG. 22

FIG. 23

FIG. 24A

FIG. 24B

FIG. 24C

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FIG. 24E

FIG. 24F

FIG. 24G

FIG. 24H

FIG. 25

FIG. 26A

FIG. 26B

FIG. 26C

FIG. 26D

FIG. 27A

FIG. 27B

LISTA DE SECUENCIAS

<110> UNIVERSIDAD DE OVIEDO ALCE CALIDAD, S.L. INDUSTRIAS LÁCTEAS ASTURIANAS, S.A.

<120> Método para la detección simultánea de microorganismos patógenos <130> ES1624.5

<160> 47

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador directo diseñado para amplificar B- cereus (GVR-BC-Mpx-up)

<400> 1 gcgtactgag ttagagaacg gt 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador inverso diseñado para amplificar B. cereus (GVR-BC-Mpx-rp)

<400> 2 tttgcttgct ttgcatacgg a 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador directo diseñado para amplificar Campylobacter jejuni (GVR-CJ-Mpx-up)

<400> 3 gagtgaggcg aaattccaac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador inverso diseñado para amplificar Campylobacter jejuni (GVR-CJ-Mpx-rp)

<400> 4 tctcatctcc cttgccattg 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial Página 1 <220>

<223> Cebador directo diseñado para amplificar Clostridium perfringens (GVR-CP-Mpx-up)

<400> 5 tgggaaagtt ctttcaacac c

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador inverso diseñado para amplificar Clostridium perfringens (GVR-CP-Mpx-rp)

<400> 6 gagaaagaat ccaagtattc gaagg

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebadore directo diseñado para amplificar Cronobacter sakazakii (GVR-CS-Mpx-up)

<400> 7 tggcatcatc aacactttcg t

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador inverso diseñado para amplificar Cronobacter sakazakii (GVR-CS-Mpx-rp)

<400> 8 tcgactacta cctggtggac g

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador directo diseñado para amplificar E. coli (GVR-EC-Mpx-up)

<400> 9 gttggtggga aagcgcgtta ca <210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador inverso diseñado para amplificar E. coli (GVR-EC-Mpx-rp)

Página 2

<400> 10 cgttaaaact gcctggcaca g 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador directo diseñado para amplificar una cepa enterohemorrágica de E. coli (GVR-H7-Mpx-up)

<400> 11 tgggtactgt gcctgttact g 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador inverso diseñado para amplificar una cepa enterohemorrágica de E. coli (GVR-H7-Mpx-rp)

<400> 12 aagccctcgt atatccacag c 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador directo diseñado para amplificar una bacteria de la familia Enterobacteriaceae (GVR-EB-Mpx-up)

<400> 13 tcagagttcc cgaaggcact c 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador inverso diseñado para amplificar una bacteria de la familia Enterobacteriaceae (GVR-EB-Mpx-rp)

<400> 14 gcaacgcgaa gaaccttacc t 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador directo diseñado para amplificar Listeria monocytogenes (GVR-LM-Mpx-up)

<400> 15 Página 3 tgacgaaatg gcttacagtg a <210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador inverso diseñado para amplificar Listeria monocytogenes (GVR-LM-Mpx-rp)

<400> 16 gccgaagttt acattcaagc t 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador directo diseñado para amplificar Salmonella spp. (GVR-SE-Mpx-up)

<400> 17 cccgattttc tctggatggt 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador inverso diseñado para amplificar Salmonella spp. (GVR-SE-Mpx-rp)

<400> 18 ggcaatagcg tcacctttga 20

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador directo diseñado para amplificar Shigella spp. (GVR-SH-Mpx-up)

<400> 19 tcaaaacaca ttgatgagta tcagg 25

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador inverso diseñado para amplificar Shigella spp. (GVR-SH-Mpx-rp)

<400> 20 tacatctttt tgaccggact tctta 25

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial Página 4 <220>

<223> Cebador directo diseñado para amplificar Staphylococcus aureus (GVR-SA-Mpx-up)

<400> 21 gcaactgaaa caacagaagc t

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador inverso diseñado para amplificar Staphylococcus aureus (GVR-SA-Mpx-rp)

<400> 22 tcacggatac ctgtaccagc a <210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador directo diseñado para amplificar B. cereus mediante RT-PCR (RT-GVR-BC-up)

<400> 23 ggtcgtagta gtggaagcga atg

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador inverso diseñado para amplificar B. cereus mediante RT-PCR (RT-GVR-BC-rp)

<400> 24 aacgttagga aactattcat c

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador directo diseñado para amplificar C. perfring mediante RT-PCR (RT-GVR-CP-up)

<400> 25 tgggaaagtt ctttcaacac c

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador inverso diseñado para amplificar C. perfringens mediante Página 5

RT-PCR (RT-GVR-CP-rp)

<400> 26 aaaaacaaaa cggtggatta agag

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador directo diseñado para amplificar un microorganismo de la Familia Enterobacteriaceae mediante RT-PCR (RT-GVR-EB-up)

<400> 27 cgcgaagaac cttacctact cttg

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador inverso diseñado para amplificar un microorganismo de la Familia Enterobacteriaceae mediante RT-PCR (RT-GVR-EB-rp)

<400> 28 tcccgaaggc actcctctat c

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador directo diseñado para amplificar E. coli mediante RT-PCR (RT-GVR-EC-up)

<400> 29 tggtgattac cgacgaaaac g

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador inverso diseñado para amplificar E. coli mediante RT-PCR (RT-GVR-EC-rp)

<400> 30 ccggcgtagt taaagaaatc atg

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador directo diseñado para amplificar S. aureus mediante RT-PCR (RT-GVR-SA-up)

<400> 31 Página 6

ccgcaattta acaaaacacc

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador inverso diseñado para amplificar S. aureus mediante RT-PCR (RT-GVR-SA-rp)

<400> 32 tggtctcgct tcatatccaa <210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda TaqMan-GVR-BC1 diseñada para cuantificar B. cereus <400> 33 aacgttagga aactattcat c

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda TaqMan-GVR-BC2 diseñada para cuantificar B. cereus <400> 34 aacgttagga aactattcat c

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda TaqMan-GVR-CP diseñada para amplificar C. perfringens <400> 35 taactcaatt caacataggt gaca <210> 36

<211> 17

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda TaqMan-GVR-EB diseñada para cuantificar un microorganismo de la Familia Enterobacteriaceae <400> 36 catccagaga atccttt

<210> 37

<211> 19

<212> DNA Página 7

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda TaqMan-GVR-EC diseñada para cuantificar E. coli <400> 37 caagaaaaag cagtcttac

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Sonda TaqMan-GVR-SA diseñada para cuantificar S. aureus <400> 38 cgtgaataca acgatggaac a <210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Control Interno de Amplificación TaqMan-GVR-IAC1

<400> 39 aaccgtcagg aacccagac

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Control Interno de Amplificación TaqMan-GVR-IAC2

<400> 40 aaccgtcagg aacccagac

<210> 41

<211> 19

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Control Interno de Amplificación TaqMan-GVR-IAC3

<400> 41 aaccgtcagg aacccagac

<210> 42

<211> 74

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador directo GVR-QIAC1-up utilizado para la construcción del IAC quimérico <400> 42

aaaatgggaa agttctttca acaccaagcg ggacttaacc caacatttca caaaggattg

Página 8

tcaagctgct cctc

<210> 43

<211> 69

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador inverso GVR-QIAC1-rp utilizado para la construcción del IAC quimérico <400> 43 aaaatggtct cgcttcatat ccaaaaccgg cgtagttaaa gaaatcatga agctccgtcc

agctctctc

<210> 44

<211> 72

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador directo GVR-QIAC2-up utilizado para la construcción del IAC quimérico <400> 44 aaaaccgcaa tttaacaaaa caccaaggtc gtagtagtgg aagcgaatga atgggaaagt

tctttcaaca cc

<210> 45

<211> 71

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador inverso GVR-QIAC2-rp utilizado para la construcción del IAC quimérico <400> 45 aaaaaaaaac aaaacggtgg attaagagaa gcaacgccac catcttcaga atggtctcgc

ttcatatcca a <210> 46

<211> 53

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador GVR-QIAC3-up utilizado para la construcción del IAC quimérico <400> 46 aaaaaagctt tggtgattac cgacgaaaac gaaccgcaat ttaacaaaac acc

<210> 47

<211> 59

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220> Página 9

69

72

71

<223> Cebador GVR-QIAC3-rp utilizado para la construcción del IAC quimérico <400> 47 aaaaggatcc atgcaacgcg aagaacctta cctaaaaaaa caaaacggtg gattaagag 59

Página 10