Desaturasa y método de producción de ácidos grasos poliinsaturados en organismos transgénicos.

Polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada de entre el grupo que consiste de:

(a) una secuencia de ácidos nucleicos tal como se muestra en SEC ID nº 1,

(b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEC ID nº 2,

(c) secuencia de ácidos nucleicos que se hibrida con un ácido nucleico de (a) o (b) bajo condiciones de hibridación restrictivas, en la que las condiciones de hibridación restrictivas son hibridaciones en 6x cloruro sódico/citrato sódico (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido de una o más etapas de lavado en 0,2 x SSC, SDS al 0,1% a una temperatura de entre 50ºC y 65ºC y en la que la secuencia de ácidos nucleicos codifica para un polipéptido con actividad de Δ5 desaturasa y especificidad de acil-CoA.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2009/055210.

Solicitante: ROTHAMSTED RESEARCH LIMITED.

Nacionalidad solicitante: Reino Unido.

Dirección: HARPENDEN HERTFORDSHIRE AL5 2JQ REINO UNIDO.

Inventor/es: NAPIER, JOHNATHAN A., SAYANOVA, OLGA, BAUER,JOERG.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA > NOVEDADES VEGETALES O PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCION;... > A01H5/00 (Plantas con flores, es decir, angiospermas)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/82 (para células vegetales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/53 (Oxidorreductasas (1))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/02 (Oxidorreductasas (1.), p. ej. luciferasa)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de compuestos orgánicos que contienen... > C12P7/64 (Grasas; Aceites; Ceras de tipo éster; Acidos grasos superiores, es decir, con una cadena lineal de al menos siete átomos de carbono unida a un grupo carboxilo; Aceites o grasas oxidadas)

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Fragmento de la descripción:

Desaturasa y método de producción de ácidos grasos poliinsaturados en organismos transgénicos

La presente invención se refiere a un polinucleótido de Em/7/ana ñux/ey/ que codifica para una desaturasa y que puede utilizarse para la producción recombinante de ácidos grasos poliinsaturados. La invención se refiere además a vectores, células huésped y organismos no humanos transgénicos que comprenden los polinucléotidos según la invención, y a los polipéptidos codificados por los polinucléotidos. La invención se refiere además a anticuerpos contra los polipéptidos según la invención. Finalmente, la invención se refiere además a métodos de producción de los ácidos grasos poliinsaturados y de composiciones de aceites, lípidos y ácidos grasos y a la utilización de los mismos como fármacos, cosméticos, alimentos, piensos, preferentemente alimentos de pescado o complementos alimenticios.

Los ácidos grasos y triacilglicéridos presentan múltiples aplicaciones en la industria alimentaria, en nutrición animal, en cosmética y en el sector farmacológico. Según si son ácidos grasos libres saturados o insaturados o son triacilglicéridos con un contenido elevado de ácidos grasos saturados o insaturados, resultan adecaudos para aplicaciones muy diferentes. Los ácidos grasos poliinsaturados tales como el ácido linoleico y el ácido linolénico resultan esenciales para los mamíferos, ya que no pueden ser producidos por ellos. Por lo tanto, los ácidos grasos poliinsaturados ru3 y u)6 son un constituyente importante en nutrición animal y humana.

Los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga ro3 tales como el ácido eicosapentaenoico (=EPA, Q20:5As,s,11,14,17) Q g¡ docosahexaenoico (=DHA, 022:6^*'^°'^^) son componentes importantes de la

nutrición humana debido a sus diversas funciones en aspectos de salud, entre ellos el desarrollo del cerebro del niño, la función ocular, la síntesis de hormonas y otras sustancias de señal, y la prevención de trastornos cardiovasculares, cáncer y diabetes (Poulos A., Lipids 30:1-14, 1995; Horrocks L A. y Yeo Y.K., Pharmacol. Res. 40:211-225, 1999). Por ello existe una demanda de producción de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga.

Debido a la composición actual de la alimentación humana, la adición de ácidos grasos poliinsaturados (*)3, los cuales se encuentran preferentemente en aceites de pescado, a los alimentos resulta particularmente importante. De esta manera, por ejemplo los ácidos grasos poliinsaturados tales como el ácido docosahexaenoico (=DHA, Q22:gA4,7,io,i3,i6,i9) Q gj ác¡do eicosapentaenoico (=EPA, C20:5^^^"^) se añaden a las fórmulas infantiles con el fin de mejor el valor nutricional. Se afirma que el ácido graso insaturado DHA presenta un efecto positivo sobre el desarrollo y mantenimiento de las funciones cerebrales.

Posteriormente en la presente memoria los ácidos grasos poliinsaturados se denominan PUFA, LCPUFA (ácidos grasos poliinsaturados: PUFA; ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga: LCPUFA).

Los diversos ácidos grasos y triglicéridos se obtienen principalmente de microorganismos tales como Morf/ere//a y Scñ/zocñyfr/um o de plantas productoras de aceites tales como la soja y la colza y de algas tales como Crypíñecod/n/um o Phaeodacfy/um y otras, de las que se obtienen, como regla general, en forma de sus triacilglicéridos (=trigl¡cér¡dos=trigl¡ceroles). Sin embargo, también pueden obtenerse de animales, tales como, por ejemplo, peces. Los ácidos grasos libres se preparan ventajosamente mediante hidrólisis. Los ácidos poliinsaturados de cadena muy larga, tales como DHA, EPA, ácido araquidónico (=ARA, C20:4^'^^"), ácido dihomo-y-linolénico (C20:3^ ^ ^) o ácido docosapentaenoico (DPA, 022:5^°'^^) no se sintetizan en cultivos de aceites tales como la colza oleaginosa, la soja, el girasol o el cártamo. Las fuentes naturales convencionales de estos ácidos grasos son peces tales como el arenque, el salmón, la sardina, la gallineta, la anguila, la carpa, la trucha, el fletán, la caballa, la lucioperca o el atún, o algas.

Según el uso pretendido, resultan preferentes aceites con ácidos grasos saturados o insaturados. En la nutrición humana, resultan preferentes, por ejemplo, los lípidos con ácidos grasos insaturados, concretamente los ácidos grasos poliinsaturados. Se afirma que los ácidos grasos poliinsaturados (*)3 presentan un efecto positivo sobre el nivel de colesterol en la sangre y que, de esta manera, posiblemente previenen las enfermedades cardiovasculares. El riesgo de enfermedad cardiaca, ictus o hipertensión puede reducirse marcadamente mediante la adición de estos ácidos grasos (*)3 a la alimentación. Además, los ácidos grasos ro3 presentan un efecto positivo sobre los procesos inflamatorios, concretamente los crónicos, asociados a enfermedades inmunológicas tales como la artritis reumatoide. Por lo tanto, se añaden a los alimentos, concretamente a alimentos dietéticos, o se utilizan en medicamentos. Los ácidos grasos ro6 tales como el ácido araquidónico tienden a presentar un efecto negativo sobre dichos trastornos relacionados con estas enfermedades reumáticas a causa de nuestra ingesta nutricional habitual.

Los ácidos grasos (*)3 y (*)6 son precursores de hormonas de tejidos, conocidas como eicosanoides, tales como las prostaglandinas, las cuales se derivan de ácido dihomo-y-linolénico, ácido araquidónico y ácido eicosapentaenoico, y de los tromboxanos y leucotrienos, los cuales se derivan de ácido araquidónico y ácido eicosapentaenoico. Los eicosanoides (conocidmos como la serie PG2), los cuales se forman a partir de los ácidos grasos ro6, generalmente

estimulan las reacciones Inflamatorias, mientras que los elcosanoldes (conocidos como la serle PG3) a partir de los ácidos grasos cu3, presentan poco o ningún efecto prolnflamatorlo.

Debido a las características positivas de los ácidos grasos polünsaturados, no se ha Intentado generar genes disponibles que participen en la síntesis de ácidos grasos o trlgllcérldos para la producción de aceites en diversos organismos con un contenido modificado de ácidos grasos ¡nsaturados. De esta manera, el documento n° WO 91/13972 y su equivalente US describen una A9-desaturasa. El documento n° WO 93/11245 reivindica una A15- desaturasa y el documento n° WO 94/11516, una A12-desaturasa. Se describen desaturadas adicionales en, por ejemplo, los documentos n° EP-A-0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222 y EPA-0 794 250; Stukey et a/., J. Blol. Chem. 265:20144-20149, 1990; Wada et a/., Nature 347:200-203, 1990; o Huang ef a/., Llplds 34:649-659, 1999. Sin embargo, la caracterización bioquímica de las diversas desaturasas ha resultado Insuficiente hasta hoy porque los enzimas, al ser proteínas unidas a membrana, suponen una gran dificultad de aislamiento y caracterización (McKeon et a/., Methods ¡n Enzymol. 71: 12141-12147, 1981; Wang ef a/., Plant Physlol. Blochem. 26: 777-792, 1988). Como regla general, las desaturasas unidas a membrana se caracterizan mediante la Introducción en un organismo adecuado que posteriormente se analiza para la actividad enzimàtica mediante el análisis de las materias primas y los productos. Las A6-desaturasas se describen en los documentos n° WO 93/06712, US 5,614,393, WO 96/21022, WO 00/21557 y WO 99/27111. Su aplicación a la producción en organismos transgénlcos se describe en, por ejemplo, los documentos n° WO 98/46763, WO 98/46764 y WO 98/46765. En este contexto, la expresión de diversas desaturasas y la formación de ácidos grasos polünsaturados también se encuentra descrita y reivindicada; ver, por ejemplo, los documentos n° WO 99/64616 y WO 98/46776. Con respecto a la eficacia de expresión de las desaturasas y su efecto sober la formación de los... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Polinucleótido que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada de entre el grupo que consiste de:

(a) una secuencia de ácidos nucleicos tal como se muestra en SEC ID n° 1,

(b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEC ID n° 2,

(c) secuencia de ácidos nucleicos que se híbrida con un ácido nucleico de (a) o (b) bajo condiciones de hibridación restrictivas, en la que las condiciones de hibridación restrictivas son hibridaciones en 6x cloruro sódico/citrato sódico (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido de una o más etapas de lavado en 0,2 x SSC, SDS al 0,1% a una temperatura de entre 50°C y 65°C y en la que la secuencia de ácidos nucleicos codifica para un polipéptido con actividad de A5 desaturasa y especificidad de acil-CoA.

2. Polinucleótido según la reivindicación 1, en el que el polinucleótido consiste de ARN o ADN.

3. Vector que comprende el polinucleótido según la reivindicación 1 o 2.

4. Vector según la reivindicación 3, en el que el vector es un vector de expresión.

5. Vector según la reivindicación 3 o 4, en el que el vector comprende por lo menos un polinucleótido adicional que codifica para un enzima adicional que participa en la biosíntesis de lípidos o ácidos grasos.

6. Célula huésped que comprende el polinucleótido según la reivindicación 1 o 2 o el vector según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

7. Célula huésped según la reivindicación 6, en la que la célula huésped comprende además por lo menos un enzima adicional que participa en la biosíntesis de lípidos o ácidos grasos.

8. Vector según la reivindicación 5 o la célula huésped según la reivindicación 7, en el que el enzima se selecciona de entre el grupo que consiste de: acll-CoA deshldrogenasa(s), acil-ACP [=proteína portadora de acilo] desaturasa(s), acll-ACP tloesterasa(s), ácido graso aclltransferasa(s), acil-CoA:lisofosfolípido aciltransferasa(s), ácido graso slntasa(s), ácido graso hldroxllasa(s), acetil-coenzima A carboxilasa(s), acil-coenzima A oxidasa(s), ácido graso desaturasa(s), ácido graso acetllenasa(s), lipoxigenasa(s), triacilglicerol lipasa(s), aleño óxido sintasa(s), hldroperóxldo llasa(s), ácido graso elongasa(s), A4-desaturasa(s), A5-desaturasa(s), A6-desaturasa(s), A8- desaturasa(s), A9-desaturasa(s), A12-desaturasa(s), A5-elongasa(s), A6-elongasa(s) y A9-elongasa(s).

9. Método para generar un polipéptido con actividad de desaturasa, que comprende las etapas:

(a) expresar un polinucleótido según la reivindicación 1 o 2 en una célula huésped, y

(b) obtener, de la célula huésped, el polipéptido que está codificado por el polinucleótido según (a).

10. Polipéptido que está codificado por el polinucleótido según la reivindicación 1 o 2.

11. Anticuerpo que reconoce específicamente el polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEC ID n° 2.

12. Organismo no humano transgénico que comprende el polinucleótido según la reivindicación 1 o 2, el vector según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 o la célula huésped según la reivindicación 8.

13. Organismo no humano transgénico según la reivindicación 12, en el que el organismo es un animal, una planta o un microorganismo multicelular.

14. Método para la producción de una sustancia que presenta la estructura mostrada en la fórmula general I a continuación:

**(Ver fórmula)**

O

en la que las variables y sustltuyentes son los siguientes:

R^=hidroxilo, coenzima A (tioéster), lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, lisofosfatidilglicerol, lisodifosfatidilglicerol, lisodifosfatidilglicerol, lisofosfatidilserina, lisofosfatidilinositol, base esfingo o un radical de fórmula II:

H^COR*

HCO K,CO^-

(")

R^=hidrógeno, lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, lisofosfatidilglicerol, lisodifosfatidilglicerol, lisofosfatidilserina, lisofosfatidilinositol o alquil C2-Ü24-carbon¡lo saturado o insaturado, R^=hidrógeno, alquil C2- C24-carbonilo saturado o insaturado, o R^y R^ independientemente uno de otro son un radical de fórmula la:

**(Ver fórmula)** **(Ver fórmula)**

Ca)

n = 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 9, m = 2, 3, 4, 5 o 6 y p = 0 o 3,

y en el que el método comprende el cultivo de: (i) una célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, o (¡I) de un organismo no humano transgénico según la reivindicación 12 o 13 bajo condiciones que permiten la blosíntesls de la sustancia.

15. Método para la producción de una composición de aceites, lípidos o ácidos grasos, que comprende las etapas del método según la reivindicación 14 y la etapa adicional de formular la sustancia como composición de aceites, lípidos o ácidos grasos.

16. Método según la reivindicación 15, en el que la composición de aceites, lípidos o ácidos grasos se formula adlclonalmente para proporcionar un fármaco, un producto cosmético, un alimento, un pienso, preferentemente alimento para peces, o un complemento alimenticio.

17. Utilización del pollnucleótldo según la reivindicación 1 o 2, del vector según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, de la célula huésped según la reivindicación 6 o 7, del vector o la célula huésped según la reivindicación 8, del pollpéptldo según la reivindicación 10 o del organismo no humano transgénico según la reivindicación 12 o 13 para la producción de una composición de aceites, lípidos o ácidos grasos.

18. Utilización según la reivindicación 17, en el que la composición de aceites, lípidos o ácidos grasos está destinada al uso como fármaco, producto cosmético, alimento, pienso, preferentemente alimento para peces o complemento alimenticio.