Derivados glicosilados de mitramicina, su procedimiento de obtención y sus usos.

La presente invención proporciona compuestos caracterizados por la fórmula (I),

donde cada uno de los radicales sustituyente se describe en la memoria. La invención también describe el uso de dichos compuestos en el tratamiento de diferentes enfermedades, entre otras: cáncer o procesos tumorales, en general, enfermedad de Paget, hipercalcemia, hipercalciuria y enfermedades neurológicas (Parkinson, Alzheimer, Huntington, entre otras).

Derivados glicosilados de mitramicina, su procedimiento de obtención y sus usos La presente divulgación se adscribe al campo farmacéutico y en concreto se refiere a compuestos con aplicación en oncología, con estructura química derivada de mitramicina y que se obtienen por fermentación de microorganismos.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La mitramicina (MTM) es un fármaco antitumoral producido por microorganismos del género Streptomyces, incluyendo Streptomyces argillaceus ATCC 12956. Este fármaco es el representante más importante del grupo del ácido aureólico, y es empleado para el tratamiento del carcinoma testicular, la enfermedad de Paget y la hipercalcemia causada por lesiones óseas asociadas al cáncer (Oncology 1973, 28, 147-163; Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993, 195, 12451253; Treat. Endocrinol. 2002, 1, 241-257; Treat. Endocrinol. 2003, 2, 273-292) . La MTM es además un agente neuroprotector que podría ser útil para el tratamiento de enfermedades neurológicas tales como accidente cerebrovascular, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis múltiple y encefalitis vírica (J. Neurosci. 2004, 24, 10335-10342; J. Biol. Chem. 2006, 281, 16672-16680) . Además, la MTM presenta actividad antibiótica (Antibiot. Chemother. 1962, 12, 182-186) .

La estructura química de la MTM se muestra en la Fig. 1. El grupo de compuestos del ácido aureólico incluye MTM, cromomicina A3, olivomicina A, UCH9 y durhamicina (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006, 73, 1-14) . Todos ellos contienen un núcleo tricíclico de origen policetídico, con una cadena lateral altamente funcionalizada en el carbono 3. El residuo en el carbono 7 puede ser un átomo de hidrógeno o un alquilo de cadena corta. Asimismo, estos compuestos poseen 46 desoxiazúcares unidos en forma de trisacárido o tetrasacárido (en el carbono 2) y monosacárido o disacárido (en el carbono 6) . Los compuestos del ácido aureólico difieren en la naturaleza y el modo de unión de sus cadenas glucídicas, que contienen diferentes 2, 6-didesoxiazúcares. Estas variaciones estructurales son las responsables de las sutiles diferencias que existen entre los miembros del grupo en cuanto a su unión al ADN y su perfil de actividad biológica. Es bien conocido que el patrón de glicosilación de los fármacos antitumorales que actúan uniéndose al ADN, como es el caso de la MTM, tiene gran importancia en su actividad biológica (Biopolymers 2000, 54, 104-114) . Por ello, la obtención de nuevos derivados de MTM con patrones glicosídicos alterados puede generar fármacos con actividad mejorada.

El conjunto de genes responsables de la biosíntesis de MTM ha sido ampliamente estudiado (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006, 73, 1-14) . La biosíntesis de MTM en Streptomyces argillaceus incluye la condensación de 10 unidades de acil-coenzima A para generar un intermediario tetracíclico, denominado premitramicinona (Fig. 2) . A continuación, 5 unidades de desoxiazúcares son añadidas de forma sucesiva, generándose intermediarios tetracíclicos con 3 azúcares y con 5 azúcares. Las glicosiltransferasas MtmGIII y MtmGIV son responsables de la formación del trisacárido, mientras que las glicosiltransferasas MtmGI y MtmGII catalizan la formación del disacárido. Finalmente, la ruptura de uno de los anillos, seguida de la reducción de un grupo ceto en la cadena lateral, genera la MTM.

Actualmente existe una gran necesidad de nuevos agentes antitumorales, con actividad mejorada, con menos efectos secundarios indeseables y con mayor selectividad, en comparación con los fármacos actualmente en uso. Tradicionalmente, la industria farmacéutica ha desarrollado nuevos fármacos mediante dos vías fundamentales: (1) búsqueda de nuevos productos naturales, y (2) síntesis y/o modificación química de determinados compuestos. Estos métodos siguen siendo útiles, pero suelen requerir inversiones muy importantes de recursos (tiempo, dinero, energía) , pues normalmente es necesario analizar miles de productos para encontrar un nuevo compuesto prometedor. El desarrollo de la tecnología del ADN recombinante ha abierto un interesante campo de investigación para la generación de nuevos compuestos bioactivos mediante la manipulación de genes implicados en la biosíntesis de agentes antitumorales, principalmente de bacterias del grupo de los actinomicetos (Trends Biotechnol. 2001, 19, 449-456; J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2005, 9, 77-85; Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2005, 8, 748-756; J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2006, 33, 560-568; Curr. Opin. Microbiol. 2006, 9, 252-260) . Estas técnicas también pueden ser usadas para mejorar la producción de compuestos naturales ya conocidos, pues las cepas naturales suelen producir bajas concentraciones del metabolito de interés.

MTM, otros ácidos aureolicos y compuestos similares también se divulgan en el J. of Biol. Chem., 2000, 275 (5) , 30653074; Chem. & Biol. 2004, 11, 8-10; Annals of Neurology 2001, 49 (3) , 345-354; Bioorganicheskaya Khimiya 1991, 17 (3) 410-416; y Chem. of Natural Compounds 1971, 7 (5) 625-628.

V. Adams et al. 2005 AAPS Annual Meeting and Exposition, noviembre de 2005, divulga cepas de Streptomyces argillaceus modificados con plásmidos pLNBIV y pFL845.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente divulgación incluye nuevas cepas bacterianas derivadas de Streptomyces argillaceus. Estas cepas son obtenidas mediante la introducción de ciertos ácidos nucleicos adicionales en cepas bacterianas existentes, las cuales pueden ser: (a) Streptomyces argillaceus, o bien (b) cepas derivadas de Streptomyces argillaceus. Las cepas del apartado (b) pueden obtenerse (entre otros métodos) mediante la inactivación de uno (o varios) de los genes 2 5

responsables de la biosíntesis de mitramicina, y son útiles para la obtención de derivados de MTM (US 2005/0192432 A1; J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 5745-5753; J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 1606-1614; Mol. Gen. Genet. 2001, 264, 827-835; FEMS Microbiol. Lett. 2000, 186, 61-65; Mol. Gen. Genet. 2000, 262, 991-1000; J. Biol. Chem. 2000, 275, 3065-3074; Mol. Gen. Genet. 1999, 261, 216-225; Chem. Biol. 1999, 6, 19-30; J. Bacteriol. 1999, 181, 642-647; J. Bacteriol. 1998, 180, 4929-4937; J. Bacteriol. 1997, 179, 3354-3357; Mol. Gen. Genet. 1996, 251, 692-698; Gene 1996, 172, 87-91) . Un ejemplo de cepa del apartado (b) , que puede ser utilizada en la presente descripción, es Streptomyces argillaceus M7U1, que fue obtenida a partir de Streptomyces argillaceus mediante inactivación del gen mtmU (Mol. Gen. Genet. 2001, 264, 827-835) . El gen mtmU codifica una 4-cetorreductasa implicada en biosíntesis de D-oliosa, y su inactivación resulta en acumulación de premitramicinona y premitramicina A. Otro ejemplo de cepa del apartado (b) es Streptomyces argillaceus M7W1, que fue obtenida a partir de Streptomyces argillaceus mediante inactivación del gen mtmW (US 2005/0192432 A1; J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 5745-5753) . El gen mtmW codifica una cetorreductasa, y su inactivación resulta en acumulación de desmicarosil-MTM-SK, MTM-SA, MTM-SDK, y MTM-SK.

La introducción de ácidos nucleicos en Streptomyces argillaceus (o en cepas derivadas) se puede realizar mediante transformación de protoplastos, conjugación, u otros métodos conocidos (tales como lo descritos en Practical Streptomyces genetics, The John Innes Foundation, Norwich, Gran Bretaña, 2000) , de tal forma que los ácidos nucleicos son replicables en el organismo, bien en forma de elemento extracromosómico o bien integrados en el cromosoma del organismo. Dichos ácidos nucleicos codifican enzimas para la biosíntesis de diferentes azúcares; dichos azúcares no son producidos normalmente por Streptomyces argillaceus. Ejemplos de ácidos nucleicos utilizables para la presente descripción son los contenidos en los siguientes plásmidos (los cuales son citados a modo de ejemplos) : pLNBIV (Chem. Biol. 2002, 9, 721-729; J. Nat. Prod. 2002, 65, 1685-1689) , pRHAM (J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2000, 2, 271-276) , pLN2 (Chem. Biol. 2002, 9, 721-729) , pLNR (Chem. Biol. 2002, 9, 721-729) , y pFL845 (Chem. Commun. (Camb) . 2005 Mar 28; (12) :1604-6) . Los plásmidos citados contienen ácidos nucleicos que codifican enzimas para la biosíntesis de los siguientes azúcares (en forma de derivados NDP) , respectivamente: L-digitoxosa, L-rhamnosa, Lolivosa, D-olivosa, y D-amicetosa. Sin embargo, otros ácidos nucleicos pueden usarse, que codifiquen enzimas para la biosíntesis de otros azúcares no citados.

Las cepas bacterianas de este documento pueden ser cultivadas en cualquier medio adecuado, en condiciones que permitan su crecimiento, tal como se describe en Gene 1996, 172, 87-91; J. Bacteriol. 1998, 180, 4929-4937; J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 5745-5753. Tras varios días... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto con la fórmula (VIII) :

OH

2. Una cepa bacteriana Streptomyces argillaceus (pFL942) , caracterizada porque posee un ácido nucleico adicional que codifica enzimas activos para la biosíntesis de azúcares que no están presentes en Streptomyces argillaceus de tipo silvestre.

3. Una cepa bacteriana de la reivindicación 2, caracterizada porque el ácido nucleico de Streptomyces argillaceus (pFL942) está contenido en el plásmido pFL942 y codifica enzimas activos para la biosíntesis de L-micarosa y sus intermediarios biosintéticos.

4. Un método para obtener la cepa bacteriana de las reivindicaciones 2 o 3, que comprende la introducción del plásmido pFL942 en Streptomyces argillaceus, que codifica enzimas activos para la biosíntesis de azúcares que no estén presentes en Streptomyces argillaceus de tipo silvestre.

5. Un método para producir el compuesto de la reivindicación 1, que comprende: a) cultivar una cepa bacteriana de cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3 en un medio adecuado; y b) aislar el compuesto de la reivindicación 1 del caldo de cultivo producido en el paso (a) .

FIG. 1

Me OMe OH

OH

FIG. 2

i) MtmGIV Mtm PKS ii) MtmGIII OCH3

[O] OCH3 iii) MtmGIVH 4-O-CH3 H OH 9-CH3 HO

HO CH3 CH3

H3C OH OH O OOOH

HO CH3

OH OH O O O

CH3 CH3 OOO HO

O

HO OH3C

EOD C

preMTMone OH preMTM-A3

iv) MtmGI v) MtmGII

CH3 CH3 H3CO OH CH3 CH3 H OCH3

OO

HO

CH3 HO

O8 OH HO O

HO

BA CH3H3C 9

O

OH OH O OOMtmOIV HO

CH3 CH3 O

MtmW CH3

OO HO

O

HO OH3C

EOD C

OH

OH

MTM preMTM-B

FIG. 3A

Min.

FIG. 3B

Min.

FIG. 3C FIG. 3D

1.00

0.75

0.50

0.25

0.22

0.00

0.00

6 9121518212427 Minutes

FIG. 4a Me OMe OR5

C

Me Me R18 O Me OO O

OR16OR10O

(VIII) R1 = OR2 =

R11O (II) (V)

B OR17 ED

Me Me O Me O (IX) R1 = R10O O O R19O (VI)

R2 =

R11O R20O R21O Me O

B (II) ED

Me Me OO R12O (X) R1= R10O O

R2= Me R11O

(III)

B (II) OR13 D

R22O (XI) R1= OH R2= OR23 D

E (VII)

(XII) R1= H R2= R22O

Me R14OMe OO

(XIII) R1 = R10O R2= OR11O R15O

(IV) (II)

DB

FIG 4b

Me OMe OR5

C

Me R24O

O Me OR10O

O

(XVII) R2 =

R1 = R11O (II) (XIV)

B R25O D R24O

Me O (XVIII) R1= H R2=

(XIV)

R25O D Me Me O R26O O R28O Me O

(XIX) R1 = R10O O R2 =

OR11O B (II) E (XV)

OR27 D Me (XX) R1= H R2= R26O (XV)

OR27 ED Me R29O

(XXI) R1= H R2=

OR30 ED (XVI)

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

La lista de referencias citadas por el solicitante es, únicamente, para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido gran cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción Literatura no patente citada en la descripción